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摘要：目的 观察葡萄籽提取物原花青素抗氧化作用的量效关系。方法 实验小鼠随机分为空白组、模型组和原花青素5 mg/kg组、15 mg/kg组、45 mg/kg组、135 mg/kg组、405 mg/kg组。模型组和各给药组小鼠腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg制备氧化损伤模型，空白组注射等体积生理盐水溶液，造模期间各组动物给予相应药物，连续造模7周。给药结束后，测定血清中丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性，观察受试物的量效关系。结果 原花青素45、135、405 mg/kg剂量组可显著降低模型小鼠血清MDA水平，原花青素15、45、135、405 mg/kg剂量组血清SOD活性提高。结论 原花青素在>15 mg/kg剂量时对小鼠D-半乳糖氧化损伤模型显示出较好的抗氧化活性，提示临床应保证一定的服用剂量以发挥较好的抗氧化功效。
关键词：葡萄籽；原花青素；D-半乳糖；抗氧化；量效关系；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0037-03
葡萄籽为葡萄科葡萄属葡萄（Vitis vinifera L.）的种子，在食品工业中是葡萄相关加工产品的废弃部分。但近些年来，随着研究的不断深入，发现葡萄籽具有很高的营养价值和药用价值，其中所含的原花青素（proanthocyanidin）为葡萄籽生物
活性的重要成分之一[1]。原花青素是葡萄中最主要的多酚类物质，因在酸性介质中加热产生红色的花青素而得名。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）是由儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯通过C4-C6或C4-C8键共价相连组成的多聚体。由于这类物质的分子中具有多电子的羟基部分，使它拥有较强的抗氧、清除自由基的能力[2]。
随着人们对GSPE生物活性的深入研究，GSPE作为天然抗
氧化剂所具有的多项保健功能已得到多方面的证实。近年来GSPE已成为我国保健食品中的一种常用原料[3]。但目前GSPE人体应用存在有效剂量不明确等突出问题，这给以GSPE为原料的保健食品研发和审评带来了困扰和盲目性。从减少资源利用和节约成本、动物代替等角度，本研究以D-半乳糖所致小鼠氧化损伤模型为切入点，观察GSPE对氧化损伤的影响，进而探讨其抗氧化功能的量效关系，为临床人体使用提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 动物
ICR小鼠，SPF级，雄性，体质量18～22 g，购自北京大学医学部实验动物科学部，动物许可证号：SCXK（京）2006-0008。
1.2 药物
葡萄籽原花青素，批号1104009-18，含量99.82%，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司。
1.3 试剂与仪器
D-半乳糖，Sigma-Aldrich，货号0637。丙二醛（MDA）测定试剂盒，批号20111227，南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，批号20111222，南京建成生物工程研究所。Sartorious BT 124S电子精密天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；半自动生化测定仪（Microlab 300，Vital Scientific Inc.）；IKA MS 3数字振荡器，德国；Sigma 3K15、1-15PK离心机，德国。
1.4 分组、造模与给药
将小鼠按体质量随机分为7组：空白组、模型组和原花青素5 mg/kg组、15 mg/kg组、45 mg/kg组、135 mg/kg组、405 mg/kg组，每组12只。模型组及各给药组小鼠腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg（0.1 mL/10 g体质量）制备氧化损伤模型，空白组注射等体积生理盐水溶液[4-5]。
造模开始给予不同剂量GSPE，每日灌胃给药1次，连续给药7周，空白组和模型组予等体积蒸馏水，灌胃体积为20 mL/kg。按照给药剂量和灌胃体积，用蒸馏水分别将GSPE配制成相应0.025%、0.075%、0.225%、0.675%、2.025%浓度水溶液，4 ℃，棕色瓶避光贮存。
1.5 指标测定
末次给药前实验动物禁食不禁水16 h，末次给药后1 h，各组小鼠眼眶后静脉丛取血，离心取血清。采用MDA和SOD试剂盒测量血清中MDA含量和SOD活性。
1.6 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件进行分析，实验数据用—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
模型组血清MDA含量显著升高，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，原花青素45、135、405 mg/kg剂量组可显著降低模型小鼠血清MDA水平（P<0.05，P<0.01）。模型组血清SOD活性显著降低，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.001）。与模型组比较，原花青素15、45、135、405 mg/kg剂量组可显著升高模型小鼠血清SOD活性（P<0.001）。结果见表1。
3 讨论
原花青素在自然界中广泛存在，具有很强的抗氧化和清除自由基活性。据报道，其抗氧化能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍，是迄今为止发现的最好的天然抗氧化剂之一[6-7]。植物果实中原花青素含量相对较高，其中葡萄籽原花青素在质量和含量上均比较突出。由于鲜食葡萄籽资源比较分散而酿酒葡萄籽资源比较集中，因而适宜作原花青素的原料[8]。葡萄籽原花青素具有广泛的生物活性，研究表明，葡萄籽原花青素除了具有显著的抗氧化和清除自由基活性以外，还具有抗炎、抗肿瘤、保护缺血性脑组织损伤、降血脂等作用[9-14]。 目前，GSPE作为天然抗氧剂和原料已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域，其销售额近年来一直位于美国膳食补充剂前10名。近年来GSPE已成为我国保健食品中的一种常用原料。据统计，2003-2005年国家食品药品监督管理局批准注册的2659个保健食品中共有89个含GSPE保健食品，约占批准注册产品总数的3.3%。抗氧化活性是上述保健功能的生物学作用基础[15]。虽然GSPE已被广泛应用，但从市场相关产品来看，尚存在管理较为混乱、生产企业良莠不齐、质量标准不统一等问题。这不仅容易引起消费者的使用困扰，且为药品食品主管部门对此类产品的审评带来一定困难。因此，明确GSPE的抗氧化作用量效关系，可在一定程度上解决此类问题。
针对上述现象，本研究以小鼠D-半乳糖氧化损伤模型为切入点，通过相关抗氧化实验研究方法，初步对GSPE的抗氧化量效关系进行研究，为临床GSPE使用提供剂量参考。结果表明，GSPE在15～405 mg/kg剂量范围内对D-半乳糖氧化损伤模型小鼠具有较好的抗氧化作用，并呈现较好的正性量效关系，随着剂量的加大，其抗氧化活性逐渐增强，提示GSPE抗氧化功能的临床应用应当保证一定的服用量。根据小鼠与人剂量折算系数（小鼠剂量换算系数为人的9倍）换算，单独应用GSPE达到抗氧化功能的最低剂量应当大于每日100 mg/60 kg体质量，以发挥较好的抗氧化功能效果。
上述实验结果为动物药理实验结果，所得结论虽可在一定程度上为临床应用提供参考，但更准确的数据有待临床试验加以进一步深入研究。
参考文献：
[1] 袁敏，韩莉，裴俊俊.葡萄籽提取物原花青素药理作用研究进展[J].中药材，2005，28（7）：632-634.
[2] 暴悦梅，佟永薇，章勤学.葡萄籽中原花青素的研究[J].食品研究与开发，2010，31（1）：185-186.
[3] 周素娟.葡萄籽提取物原花青素的研究概况及其在我国保健食品中的应用[J].中国食品卫生杂志，2007，19（3）：284-286.
[4] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[S].2003：43.
[5] 麦嘉仪，沈新南，魏延，等.叶黄素对D-半乳糖致小鼠氧化损伤的保护作用[J].中国预防医学杂志，2010，11（4）：346-349.
[6] Toshiaki A， Mitsutoshi H. Radical scavenging action and its mode in procyanidins B-1 and B-3 from Azuki beans to peroxyl radicals[J]. Agric Biol Chem，1990，54（10）：2499-2504.
[7] Toshiaki A， Ikunori K， Danji F. Antioxidative properties of procyanidins B-1 and B-3 from Azuki beans in aqueous systems[J]. Agric Biol Chem，1988，52（11）：2717-2722.
[8] 张小军，夏春镗，吴建铭，等.原花青素的资源研究[J].中药材，2009， 32（7）：1154-1159.
[9] 吴岚，刘开祥，俸军林，等.原花青素对脑缺血再灌注损伤大鼠炎症反应及自由基含量的影响[J].中国中医急症，2009，18（9）：1477-1478.
[10] 池余刚，钟玲，伍霞，等.葡萄籽提取物诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡及其机制的探讨[J].重庆医科大学学报，2009，34（7）：826-829.
[11] 徐蕾，钟玲，胡琴琴，等.葡萄籽原花青素对人卵巢癌裸鼠移植瘤细胞增殖和凋亡的影响[J].第三军医大学学报，2009，31（21）：2120-2123.
[12] 王峰，郭健.原花青素对大鼠脑缺血再灌注损伤抗炎机制研究[J].中国实用医药，2009，4（2）：12-13.
[13] 刘畅，张萍，闵连秋.原花青素对局灶性脑缺血大鼠脑组织SOD、MDA和NF-κB的影响[J].辽宁医学院学报，2009，30（2）：138-140.
[14] 李姝.原花青素对高血脂大鼠血脂影响的实验研究[J].吉林医学， 2009，34（1）：138-140.
[15] 周素娟.葡萄籽提取物原花青素的研究概况及其在我国保健食品中的应用[J].中国食品卫生杂志，2007，19（3）：284-286.
（收稿日期：2013-01-13，编辑：华强）
关键词：葡萄籽；原花青素；D-半乳糖；抗氧化；量效关系；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0037-03
葡萄籽为葡萄科葡萄属葡萄（Vitis vinifera L.）的种子，在食品工业中是葡萄相关加工产品的废弃部分。但近些年来，随着研究的不断深入，发现葡萄籽具有很高的营养价值和药用价值，其中所含的原花青素（proanthocyanidin）为葡萄籽生物
活性的重要成分之一[1]。原花青素是葡萄中最主要的多酚类物质，因在酸性介质中加热产生红色的花青素而得名。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）是由儿茶素、表儿茶素及其没食子酸酯通过C4-C6或C4-C8键共价相连组成的多聚体。由于这类物质的分子中具有多电子的羟基部分，使它拥有较强的抗氧、清除自由基的能力[2]。
随着人们对GSPE生物活性的深入研究，GSPE作为天然抗
氧化剂所具有的多项保健功能已得到多方面的证实。近年来GSPE已成为我国保健食品中的一种常用原料[3]。但目前GSPE人体应用存在有效剂量不明确等突出问题，这给以GSPE为原料的保健食品研发和审评带来了困扰和盲目性。从减少资源利用和节约成本、动物代替等角度，本研究以D-半乳糖所致小鼠氧化损伤模型为切入点，观察GSPE对氧化损伤的影响，进而探讨其抗氧化功能的量效关系，为临床人体使用提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 动物
ICR小鼠，SPF级，雄性，体质量18～22 g，购自北京大学医学部实验动物科学部，动物许可证号：SCXK（京）2006-0008。
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葡萄籽原花青素，批号1104009-18，含量99.82%，天津市尖峰天然产物研究开发有限公司。
1.3 试剂与仪器
D-半乳糖，Sigma-Aldrich，货号0637。丙二醛（MDA）测定试剂盒，批号20111227，南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，批号20111222，南京建成生物工程研究所。Sartorious BT 124S电子精密天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；半自动生化测定仪（Microlab 300，Vital Scientific Inc.）；IKA MS 3数字振荡器，德国；Sigma 3K15、1-15PK离心机，德国。
1.4 分组、造模与给药
将小鼠按体质量随机分为7组：空白组、模型组和原花青素5 mg/kg组、15 mg/kg组、45 mg/kg组、135 mg/kg组、405 mg/kg组，每组12只。模型组及各给药组小鼠腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg（0.1 mL/10 g体质量）制备氧化损伤模型，空白组注射等体积生理盐水溶液[4-5]。
造模开始给予不同剂量GSPE，每日灌胃给药1次，连续给药7周，空白组和模型组予等体积蒸馏水，灌胃体积为20 mL/kg。按照给药剂量和灌胃体积，用蒸馏水分别将GSPE配制成相应0.025%、0.075%、0.225%、0.675%、2.025%浓度水溶液，4 ℃，棕色瓶避光贮存。
1.5 指标测定
末次给药前实验动物禁食不禁水16 h，末次给药后1 h，各组小鼠眼眶后静脉丛取血，离心取血清。采用MDA和SOD试剂盒测量血清中MDA含量和SOD活性。
1.6 统计学方法
采用SPSS10.0统计软件进行分析，实验数据用—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
模型组血清MDA含量显著升高，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，原花青素45、135、405 mg/kg剂量组可显著降低模型小鼠血清MDA水平（P<0.05，P<0.01）。模型组血清SOD活性显著降低，与空白组比较差异有统计学意义（P<0.001）。与模型组比较，原花青素15、45、135、405 mg/kg剂量组可显著升高模型小鼠血清SOD活性（P<0.001）。结果见表1。
3 讨论
原花青素在自然界中广泛存在，具有很强的抗氧化和清除自由基活性。据报道，其抗氧化能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍，是迄今为止发现的最好的天然抗氧化剂之一[6-7]。植物果实中原花青素含量相对较高，其中葡萄籽原花青素在质量和含量上均比较突出。由于鲜食葡萄籽资源比较分散而酿酒葡萄籽资源比较集中，因而适宜作原花青素的原料[8]。葡萄籽原花青素具有广泛的生物活性，研究表明，葡萄籽原花青素除了具有显著的抗氧化和清除自由基活性以外，还具有抗炎、抗肿瘤、保护缺血性脑组织损伤、降血脂等作用[9-14]。 目前，GSPE作为天然抗氧剂和原料已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域，其销售额近年来一直位于美国膳食补充剂前10名。近年来GSPE已成为我国保健食品中的一种常用原料。据统计，2003-2005年国家食品药品监督管理局批准注册的2659个保健食品中共有89个含GSPE保健食品，约占批准注册产品总数的3.3%。抗氧化活性是上述保健功能的生物学作用基础[15]。虽然GSPE已被广泛应用，但从市场相关产品来看，尚存在管理较为混乱、生产企业良莠不齐、质量标准不统一等问题。这不仅容易引起消费者的使用困扰，且为药品食品主管部门对此类产品的审评带来一定困难。因此，明确GSPE的抗氧化作用量效关系，可在一定程度上解决此类问题。
针对上述现象，本研究以小鼠D-半乳糖氧化损伤模型为切入点，通过相关抗氧化实验研究方法，初步对GSPE的抗氧化量效关系进行研究，为临床GSPE使用提供剂量参考。结果表明，GSPE在15～405 mg/kg剂量范围内对D-半乳糖氧化损伤模型小鼠具有较好的抗氧化作用，并呈现较好的正性量效关系，随着剂量的加大，其抗氧化活性逐渐增强，提示GSPE抗氧化功能的临床应用应当保证一定的服用量。根据小鼠与人剂量折算系数（小鼠剂量换算系数为人的9倍）换算，单独应用GSPE达到抗氧化功能的最低剂量应当大于每日100 mg/60 kg体质量，以发挥较好的抗氧化功能效果。
上述实验结果为动物药理实验结果，所得结论虽可在一定程度上为临床应用提供参考，但更准确的数据有待临床试验加以进一步深入研究。
参考文献：
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[8] 张小军，夏春镗，吴建铭，等.原花青素的资源研究[J].中药材，2009， 32（7）：1154-1159.
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[10] 池余刚，钟玲，伍霞，等.葡萄籽提取物诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡及其机制的探讨[J].重庆医科大学学报，2009，34（7）：826-829.
[11] 徐蕾，钟玲，胡琴琴，等.葡萄籽原花青素对人卵巢癌裸鼠移植瘤细胞增殖和凋亡的影响[J].第三军医大学学报，2009，31（21）：2120-2123.
[12] 王峰，郭健.原花青素对大鼠脑缺血再灌注损伤抗炎机制研究[J].中国实用医药，2009，4（2）：12-13.
[13] 刘畅，张萍，闵连秋.原花青素对局灶性脑缺血大鼠脑组织SOD、MDA和NF-κB的影响[J].辽宁医学院学报，2009，30（2）：138-140.
[14] 李姝.原花青素对高血脂大鼠血脂影响的实验研究[J].吉林医学， 2009，34（1）：138-140.
[15] 周素娟.葡萄籽提取物原花青素的研究概况及其在我国保健食品中的应用[J].中国食品卫生杂志，2007，19（3）：284-286.
（收稿日期：2013-01-13，编辑：华强）