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目的最新调查数据显示,目前全世界糖尿病的患病率为9.1%,患病人数已达4.51亿,我国成人糖尿病患病率为10.9%,糖尿病患者达1.48亿。而在所有糖尿病患者中约有1%-5%是由单基因突变引起,被称为单基因突变糖尿病。其中钾内流通道亚家族成员11 J（KCNJ11）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）两个单基因糖尿病基因已经发展成治疗T2D的主要药物靶点。因此,单基因糖尿病是宝贵的“人体疾病模型”,有助于我们了解常见的T1D和T2D的病理生理基础,并为新药物靶点的发现提供可能。最近,有学者报告一种新的综合征,该综合征主要临床表现包括脑回简化的小头畸形,癫痫和永久性新生儿糖尿病,英文全称为Microcephaly-Epilepsy and Neonatal Diabetes Syndrome,简称为MEDS。基因检测显示MEDS主要是由于IER3IP1基因突变造成。本研究旨在探讨IER3IP1蛋白特性,并在分子水平,细胞水平,动物水平研究该蛋白在β细胞合成分泌胰岛素过程中的作用,进一步加深了解MEDS发病机制。方法1、通过免疫荧光研究IER3IP1在INS1细胞中的定位,通过CRISPR/Cas9技术构建IER3IP1-/-敲除的293T细胞系(293TIER3IP1-/-),在293TIER3IP1-/-细胞系中通过加/不加DTT（DTT为一种还原剂,可以打开胰岛素内部的二硫键,破坏原有构象,通过加用和不加用相比,可以判断是否存在错误折叠）处理应用蛋白杂交实验（Western Blotting,WB）分析IER3IP1敲除及突变后对胰岛素原合成、折叠、分泌的影响,并给予β细胞系、小鼠胰岛糖刺激,观察IER3IP1蛋白的表达变化。2、构建IER3IP1-/-动物模型,观察IER3IP1-/-小鼠体重、血糖变化情况,摘取不同时期IER3IP1-/-小鼠胰腺,进行HE染色,统计胰岛占胰腺面积比值变化情况;进行免疫组化及免疫荧光染色,观察胰岛素原、胰岛素含量及定位变化,胰岛α、β、δ细胞分布改变;进行电镜扫描,观察细胞器结构变化;结果1、在INS1细胞中的研究结果表明IER3IP1蛋白既定位于内质网又定位于高尔基体,人体胰腺标本的免疫荧光结果与INS1细胞系中的结果一致;应用蛋白质构象模拟软件预测IER3IP1为N端和C端各一α螺旋结构的蛋白,V12G（M1）突变和L78P（M2）突变分别影响了N端和C端的α螺旋结构;正常情况下IER3IP1蛋白不分泌至细胞外,突变后同样不分泌至细胞外;高糖刺激（25.5mmol/L）会上调IER3IP1表达。2、在293T细胞中研究表明,与过表达IER3IP1蛋白相比,表达M1突变型IER3IP1蛋白,可使细胞分泌效率降低21.1%,表达M2突变型IER3IP1蛋白,可降低细胞分泌降低91.6%;应用同位素示踪法研究发现过表达IER3IP1会增强细胞分泌新合成胰岛素能力,与过表达IER3IP1蛋白相比,表达M1突变型IER3IP1蛋白,可使细胞分泌降低降低37.1%,表达M2突变型IER3IP1蛋白,可降低细胞分泌效率45.7%;应用shRNA敲降IER3IP1蛋白,敲降效率为62.9%时,可使细胞分泌效率下降55%,敲降效率为78.5%时,可使细胞分泌效率下降86.6%;293T IER3IP1-/-细胞系实验也证实IER3IP1敲除后细胞分泌胰岛素原功能显著下降。3、与C57BL/6小鼠相比,3周龄IER3IP1-/-小鼠空腹血糖正常（6.1mmol/L VS 6.3mmol/L）,体重基本正常（6.5g VS 6.03g）,胰岛大小、形态正常,但胰岛占胰腺面积下降约13.6%（14.25‰VS 12.31‰）;4周龄IER3IP1-/-小鼠出现明显空腹血糖升高（8.4mmol/L VS 19.2mmol/L）,体重增加减慢（10.1g VS 8.9g）;8周龄IER3IP1-/-小鼠,空腹血糖显著增高（7.6mmol/L VS 22.4mmol/L）,体重明显减低（19.4g VS 15.5g）,胰岛占胰腺面积下降90.2%（3.656‰VS 0.358‰）。4、发病IER3IP1-/-小鼠胰腺HE染色结果表明,与正常C57BL/6小鼠胰岛细胞排列整齐、规则,细胞核呈（类）圆形,大小较均一,多数呈浅着色,胞浆丰富,胞核居中相比,IER3IP1-/-小鼠胰岛细胞排列不规则,局部呈“拥挤状”,细胞核可见规则圆形,亦可见较多（类）椭圆形,部分细胞胞浆欠丰富,胞核靠近细胞膜;免疫荧光染色发现,与C57BL/6小鼠胰岛胰岛素原聚集在β细胞核周（高尔基体位置）不同,IER3IP1-/-小鼠胰岛β细胞几乎看不到核周的胰岛素原聚集;而且IER3IP1-/-小鼠β细胞胰岛素含量明显减低;电镜扫描显示β细胞内质网变粗,胰岛素分泌颗粒明显减少,并出现大量空泡化线粒体,以及线粒体吞噬囊泡现象;通过WB法检测胰岛相关蛋白表达,结果显示与C57BL/6小鼠相比,IER3IP1-/-小鼠胰岛素表达量降低最高可达93.3%,胰岛素原与胰岛素比值显著增高可达6.34倍;与C57BL/6小鼠相比,4周龄IER3IP1-/-小鼠胰岛p-eIF2α/eIF2α比值降低18.2%,14周龄IER3IP1-/-小鼠胰岛p-eIF2α/eIF2α比值降低42.8%。结论1、本实验成功构建了293TIER3IP1-/-细胞系,成功构建IER3IP1-/-小鼠模型。2、本实验证实IER3IP1蛋白既定位于内质网又定位于高尔基体;IER3IP1蛋白正常情况下和突变后均不分泌至细胞外;高糖刺激可以诱导IER3IP1蛋白表达上调;3、本实验在293T细胞中证实过表达IER3IP1蛋白可以增强细胞分泌功能,敲除或突变IER3IP1蛋白后会抑制细胞分泌功能,增加胰岛素原的错误折叠;4、本实验证实IER3IP1-/-小鼠3周时出现β细胞功能障碍,4周时出现显著高血糖,发病的IER3IP1-/-小鼠β细胞合成胰岛素下降,胰岛素原错误折叠增加,胰岛素原不能正常向高尔基体转运,且出现内质网变粗,大量线粒体空泡化及线粒体吞噬囊泡现象。