论文部分内容阅读
[摘要] 目的 构建含有CD24基因的重组质粒，在人胚肾上皮细胞Hek293中表达出具有免疫原性的抗原。方法 用PCR方法扩增CD24基因，克隆到载体pYD5-hFC中，获得重组质粒pYD5-CD24，转化DH10α感受态细胞中，挑选克隆抽取质粒，以脂质体介导将质粒转染Hek293细胞，72 h后收集细胞培养上清，Western-Blot分析鉴定。结果 构建了含有CD24基因的重组质粒，并在人胚肾上皮细胞Hek293中获得带有hFC标签的CD24蛋白。结论 本研究成功表达出了具有免疫原性的CD24蛋白。
[关键词] CD24；表达；Western
[中图分类号] R741 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）29-0047-02
CD24基因编码唾液酸糖蛋白锚定在细胞表面糖基磷脂酰肌醇链上，在成熟的粒细胞和许多B细胞中都有表达[1]，它作为黏附分子对调节肿瘤细胞生长、增殖及侵袭等均具有重要作用[2]，且其高表达及表达模式与患者生存率及预后密切相关，是多种肿瘤有价值的诊断和预后指标[3]。
真核表达系统表达水平高，表达产物可进行翻译后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似等特点，被广泛应用于各种不同外源基因的表达。本文以真核表达系统表达CD24基因，对表达产物的特异性进行鉴定，并对核蛋白的免疫原性进行初步研究，为CD24基因工程亚单位疫苗的研制及诊断抗原的研究做进一步的探索。
1 材料与方法
1.1材料
CD24模版购自美国open biosysterms公司，DH10α感受态细胞自己制备，限制性内切酶HindIII、BamHI购自NEB公司，T4连接酶、 Taq DNA聚合酶购自美国TAKARA公司，Hek293细胞株、F17培养基、F68、脂质体cellfectine、抽质粒试剂盒均购自invitrogen公司，Anti-CD24鼠抗购自Abcam公司，HRP标记羊抗鼠IgGFc购自Sigma。
1.2 细胞培养
细胞培养参照文献[4]进行，具体步骤如下，Hek293细胞培养基：F17无血清培养基，培养条件：27℃，5%CO2。悬浮培养：细胞接种到无菌的三角瓶置于恒温摇床培养，转速120转/min，加入1%的F68，悬浮细胞密度一般维持在（0.5×106~1×106）cells/mL之间，一般传代（2～3）次/周。
1.3 目的基因扩增
根据CD24模板，PCR扩增全长基因。上游引物P1为5’GCCGTCTCGGATCCATGGGCAGAGCAATGGTGGC 3’，5’端加上BamHI酶切位点；下游引物P2为5’GCCGTCTCAAGCTTAAGAGTAGAGATGCAGAAGAG 3’，5’端加上HindIII酶切位点。扩增片断为240 bp，含有完整的CD24基因，引物由南京金思特科技有限公司合成。
1.4重组质粒构建
将PCR产物CD24经BamHI和HindIII双酶切，酶切条件：37℃，2 h，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离回收（按说明书操作），回收的目的片段与pYD5载体连接，连接产物pYD5-CD24热击转化大肠杆菌感受态DH10α，涂布LB平板（平板中含有Amp），37℃培养过夜，挑独立的克隆接种于10 mL LB培养基中（Amp）震荡培养过夜。
1.5酶切及测序
收集细胞抽质粒进行酶切鉴定，1 mL送测序，1.5 mL保种。若测序正确，将保存菌种扩大培养抽质粒（按Invitrogen公司试剂盒说明书操作）。
1.6细胞转染及表达分析
转染在6孔板中进行，当细胞生长密度达到1×106 cells/mL时，利用脂质体（cellfectine）介导转染，转染后72 h左右收集细胞培养上清加入 loadingbuffer制得裂解液，根据Western bloting常规操作做WB检测。一抗：CD24单克隆抗体。二抗：是HRP标记羊抗鼠IgGFc。
2 结果与分析
2.1 目的基因扩增结果
PCR扩增出的CD24基因，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大约240 bp的特异性条带，与预期片段大小相符（图1）。
图1 CD24的PCR分析
1：2000 marker；2：CD24
2.2 重组质粒鉴定结果
重组质粒pYD5-CD24转化感受态细胞DH10α，在含有氨苄抗生素的LB培养板上挑取独立克隆培养，抽出质粒进行双酶切，酶切结果如图2。酶切后得到大约6 kb和240 bp两片段，分别与pYD5载体和CD24基因分子质量一致。测序结果证明载体pYD5和CD24基因接头连接处正确，大小和读码框架正确完整。
2.3 Western bloting分析结果
Western bloting结果如图3，转入CD24的Hek293细胞表达得到一条37 kD左右的带，与预测的37.4 kD相符，说明表达出来的真核蛋白能与CD24单克隆抗体发生免疫反应。
3 结论
研究发现CD24可促进大肠癌细胞的增殖，同时激活Raf-ERK通路及p38MAPK激酶[5]，也与卵巢上皮性肿瘤恶性程度相关[6]，此外与乳腺癌标本中CD44 CD24-细胞E-钙黏连水平明显下降[7]。CD24的表达与胃癌肿瘤病理学分级、临床分期及淋巴结转移有相关性，同时CD24的异常表达可能与胃癌的早期发生有关[8]。CD24可能与食管鳞癌（ESCC）淋巴结转移（LNM）相关[9]。树突状细胞受脂多糖刺激后CD24表达显著增高，这有利于DC-T细胞簇的形成及抗原的递呈，从而导致DC免疫功能的增强[10]。CD24表达可能是反映前列腺癌发生、进展、生物学行为和预后的重要癌干细胞标记物[11]。CD24在病理分级高的胰腺癌中表达高于分级低者，且恶性程度高的原发癌患者CD24表达明显增强[12]。这些提示CD24在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色[13]。 本研究采用真核表达系统在Hek293细胞中表达重组CD24蛋白，真核系统与大肠杆菌等原核表达系统相比，能更好地保持蛋白的免疫原性，且pYD5载体为CD24加入hFC标签以利于蛋白的纯化。用Western Blot方法进行检测，确定在Hek293细胞中表达出了真核蛋白，分子量约为37.4 kD，与预计的结果相符，且与CD24单克隆抗体发生良好的免疫反应，这表明重组核蛋白保持了天然核蛋白的免疫原性，为进一步研究该蛋白奠定了基础。
[参考文献]
[1] Kollaee A， Ghaffarpor M， Pourmahmoudian H，et al. Investigation of CD24 and its expression in Iranian relapsing-remitting multiple sclerosis[J]. Int J Neurosci，2011，121（12）：684-690.
[2] Ju J H，Jang K，Lee K M，et al. CD24 enhances DNA damage-induced apoptosis by modulating NF-kappaB signaling in CD44-expressing breast cancer cells[J]. Carcinogenesis，2011，32（10）：1474-1483.
[3] Shipitsin M，Campbeii LL，Arqani P，et al. Molecular identification of breast tumor heterogenity[J]. Cancer Cell，2007，11（3）： 259-273.
[4] 王杨，罗映晖. hIAP-2-siRNA 对hepG2肝癌细胞抑制作用[J]. 肿瘤药学，2011，1（5）：426-430.
[5] Yong C S， Ou Y C， Chou Y H，et al. CD44/CD24 expression in recurrent gastric cancer： a retrospective analysis[J]. BMC Gastroenterol，2012，12（1）：95.
[6] Lee KM，Ju JH，Jang K，et al. CD24 regulates cell proliferation and transforming growth factor beta-induced epithelial to mesenchymal transition through modulation of integrin beta1 stability[J]. Cell Signal，2012，24（11）：2132-2142.
[7] 任华益，曾勇，谢仲秋，等. 上皮间质转化与肿瘤干细胞在化疗耐药中作用的研究进展[J]. 肿瘤药学，2012，2（1）：7-9.
[8] Lin Y， Zhong Y， Guan H，et al. CD44 /CD24-phenotype contributes to malignant relapse following surgical resection and chemotherapy in patients with invasive ductal carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res，2012， 31（1）：59.
[9] Su N，Peng L，Xia B，et al. Lyn is involved in CD24-induced ERK1/2 activation in colorectal cancer[J]. Mol Cancer，2012，11（1）：43.
[10] Liu C，Luo Y，Liu X，et al. Clinical implications of CD44 /CD24- tumor cell ratio in breast cancer[J]. Cancer Biother Radiopharm，2012，27（5）：324-328.
[11] Wei HJ，Yin T，Zhu Z，et al. Expression of CD44， CD24 and ESA in pancreatic adenocarcinoma cell lines varies with local microenvironment[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2011，10（4）：428-434.
[12] Jacob J，Bellach J，Grutzmann R. Expression of CD24 in adenocarcinomas of the pancreas correlates with higher tumor grades[J]. Pancreatology，2004，4（5）：454-460.
[13] 李坤，武正华，朱奇，等. 促肿瘤转移蛋白AGR2研究进展[J]. 现代生物医学进展，2011，11（24）：4750-4755.
（收稿日期：2012-09-03）
[关键词] CD24；表达；Western
[中图分类号] R741 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）29-0047-02
CD24基因编码唾液酸糖蛋白锚定在细胞表面糖基磷脂酰肌醇链上，在成熟的粒细胞和许多B细胞中都有表达[1]，它作为黏附分子对调节肿瘤细胞生长、增殖及侵袭等均具有重要作用[2]，且其高表达及表达模式与患者生存率及预后密切相关，是多种肿瘤有价值的诊断和预后指标[3]。
真核表达系统表达水平高，表达产物可进行翻译后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似等特点，被广泛应用于各种不同外源基因的表达。本文以真核表达系统表达CD24基因，对表达产物的特异性进行鉴定，并对核蛋白的免疫原性进行初步研究，为CD24基因工程亚单位疫苗的研制及诊断抗原的研究做进一步的探索。
1 材料与方法
1.1材料
CD24模版购自美国open biosysterms公司，DH10α感受态细胞自己制备，限制性内切酶HindIII、BamHI购自NEB公司，T4连接酶、 Taq DNA聚合酶购自美国TAKARA公司，Hek293细胞株、F17培养基、F68、脂质体cellfectine、抽质粒试剂盒均购自invitrogen公司，Anti-CD24鼠抗购自Abcam公司，HRP标记羊抗鼠IgGFc购自Sigma。
1.2 细胞培养
细胞培养参照文献[4]进行，具体步骤如下，Hek293细胞培养基：F17无血清培养基，培养条件：27℃，5%CO2。悬浮培养：细胞接种到无菌的三角瓶置于恒温摇床培养，转速120转/min，加入1%的F68，悬浮细胞密度一般维持在（0.5×106~1×106）cells/mL之间，一般传代（2～3）次/周。
1.3 目的基因扩增
根据CD24模板，PCR扩增全长基因。上游引物P1为5’GCCGTCTCGGATCCATGGGCAGAGCAATGGTGGC 3’，5’端加上BamHI酶切位点；下游引物P2为5’GCCGTCTCAAGCTTAAGAGTAGAGATGCAGAAGAG 3’，5’端加上HindIII酶切位点。扩增片断为240 bp，含有完整的CD24基因，引物由南京金思特科技有限公司合成。
1.4重组质粒构建
将PCR产物CD24经BamHI和HindIII双酶切，酶切条件：37℃，2 h，酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离回收（按说明书操作），回收的目的片段与pYD5载体连接，连接产物pYD5-CD24热击转化大肠杆菌感受态DH10α，涂布LB平板（平板中含有Amp），37℃培养过夜，挑独立的克隆接种于10 mL LB培养基中（Amp）震荡培养过夜。
1.5酶切及测序
收集细胞抽质粒进行酶切鉴定，1 mL送测序，1.5 mL保种。若测序正确，将保存菌种扩大培养抽质粒（按Invitrogen公司试剂盒说明书操作）。
1.6细胞转染及表达分析
转染在6孔板中进行，当细胞生长密度达到1×106 cells/mL时，利用脂质体（cellfectine）介导转染，转染后72 h左右收集细胞培养上清加入 loadingbuffer制得裂解液，根据Western bloting常规操作做WB检测。一抗：CD24单克隆抗体。二抗：是HRP标记羊抗鼠IgGFc。
2 结果与分析
2.1 目的基因扩增结果
PCR扩增出的CD24基因，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大约240 bp的特异性条带，与预期片段大小相符（图1）。
图1 CD24的PCR分析
1：2000 marker；2：CD24
2.2 重组质粒鉴定结果
重组质粒pYD5-CD24转化感受态细胞DH10α，在含有氨苄抗生素的LB培养板上挑取独立克隆培养，抽出质粒进行双酶切，酶切结果如图2。酶切后得到大约6 kb和240 bp两片段，分别与pYD5载体和CD24基因分子质量一致。测序结果证明载体pYD5和CD24基因接头连接处正确，大小和读码框架正确完整。
2.3 Western bloting分析结果
Western bloting结果如图3，转入CD24的Hek293细胞表达得到一条37 kD左右的带，与预测的37.4 kD相符，说明表达出来的真核蛋白能与CD24单克隆抗体发生免疫反应。
3 结论
研究发现CD24可促进大肠癌细胞的增殖，同时激活Raf-ERK通路及p38MAPK激酶[5]，也与卵巢上皮性肿瘤恶性程度相关[6]，此外与乳腺癌标本中CD44 CD24-细胞E-钙黏连水平明显下降[7]。CD24的表达与胃癌肿瘤病理学分级、临床分期及淋巴结转移有相关性，同时CD24的异常表达可能与胃癌的早期发生有关[8]。CD24可能与食管鳞癌（ESCC）淋巴结转移（LNM）相关[9]。树突状细胞受脂多糖刺激后CD24表达显著增高，这有利于DC-T细胞簇的形成及抗原的递呈，从而导致DC免疫功能的增强[10]。CD24表达可能是反映前列腺癌发生、进展、生物学行为和预后的重要癌干细胞标记物[11]。CD24在病理分级高的胰腺癌中表达高于分级低者，且恶性程度高的原发癌患者CD24表达明显增强[12]。这些提示CD24在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色[13]。 本研究采用真核表达系统在Hek293细胞中表达重组CD24蛋白，真核系统与大肠杆菌等原核表达系统相比，能更好地保持蛋白的免疫原性，且pYD5载体为CD24加入hFC标签以利于蛋白的纯化。用Western Blot方法进行检测，确定在Hek293细胞中表达出了真核蛋白，分子量约为37.4 kD，与预计的结果相符，且与CD24单克隆抗体发生良好的免疫反应，这表明重组核蛋白保持了天然核蛋白的免疫原性，为进一步研究该蛋白奠定了基础。
[参考文献]
[1] Kollaee A， Ghaffarpor M， Pourmahmoudian H，et al. Investigation of CD24 and its expression in Iranian relapsing-remitting multiple sclerosis[J]. Int J Neurosci，2011，121（12）：684-690.
[2] Ju J H，Jang K，Lee K M，et al. CD24 enhances DNA damage-induced apoptosis by modulating NF-kappaB signaling in CD44-expressing breast cancer cells[J]. Carcinogenesis，2011，32（10）：1474-1483.
[3] Shipitsin M，Campbeii LL，Arqani P，et al. Molecular identification of breast tumor heterogenity[J]. Cancer Cell，2007，11（3）： 259-273.
[4] 王杨，罗映晖. hIAP-2-siRNA 对hepG2肝癌细胞抑制作用[J]. 肿瘤药学，2011，1（5）：426-430.
[5] Yong C S， Ou Y C， Chou Y H，et al. CD44/CD24 expression in recurrent gastric cancer： a retrospective analysis[J]. BMC Gastroenterol，2012，12（1）：95.
[6] Lee KM，Ju JH，Jang K，et al. CD24 regulates cell proliferation and transforming growth factor beta-induced epithelial to mesenchymal transition through modulation of integrin beta1 stability[J]. Cell Signal，2012，24（11）：2132-2142.
[7] 任华益，曾勇，谢仲秋，等. 上皮间质转化与肿瘤干细胞在化疗耐药中作用的研究进展[J]. 肿瘤药学，2012，2（1）：7-9.
[8] Lin Y， Zhong Y， Guan H，et al. CD44 /CD24-phenotype contributes to malignant relapse following surgical resection and chemotherapy in patients with invasive ductal carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res，2012， 31（1）：59.
[9] Su N，Peng L，Xia B，et al. Lyn is involved in CD24-induced ERK1/2 activation in colorectal cancer[J]. Mol Cancer，2012，11（1）：43.
[10] Liu C，Luo Y，Liu X，et al. Clinical implications of CD44 /CD24- tumor cell ratio in breast cancer[J]. Cancer Biother Radiopharm，2012，27（5）：324-328.
[11] Wei HJ，Yin T，Zhu Z，et al. Expression of CD44， CD24 and ESA in pancreatic adenocarcinoma cell lines varies with local microenvironment[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2011，10（4）：428-434.
[12] Jacob J，Bellach J，Grutzmann R. Expression of CD24 in adenocarcinomas of the pancreas correlates with higher tumor grades[J]. Pancreatology，2004，4（5）：454-460.
[13] 李坤，武正华，朱奇，等. 促肿瘤转移蛋白AGR2研究进展[J]. 现代生物医学进展，2011，11（24）：4750-4755.
（收稿日期：2012-09-03）