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【文章编号】1004-7484（2014）01-0102-02
在人体，肠道菌群是一个复杂的微生态系统，目前在肠道中细菌已知多达 500 余种，大约1013～1014个，厌氧菌约占98%以上。肠道菌群的种类和数量是相对稳定的， 受饮食、内分泌、卫生习惯、地理环境、年龄及卫生条件的影响而变动。本研究以不同年龄阶段的健康人群为对象，通过常规细菌培养及荧光定量PCR来检测其肠道菌群的数量，进一步研究肠道众多菌群与年龄关系，希望找到长寿老人相关肠道菌群。
1 对象与方法
1.1 对象
共收集健康人群粪便标本81例，其中：少年组26例，男性16例，女性10例，年龄范围8-15岁，平均年龄12.3岁；青壮年人群30例，男性17例，女性13例，年龄范围27-50岁，平均年龄36.7岁； 老年人群25例，男性15例，女性10例，年龄范围65-80岁，平均年龄71.2岁。三组人群采样前无腹泻便秘等胃肠道疾病、肝胆疾病及心脑肾等重要脏器疾病史，4周内未用过微生态活菌制剂（如酸奶）及抗生素。
1.2 方法
1.2.1实验者留取粪便标本于无菌袋中，置入厌氧罐内，立即送检分离，所需时间严格控制在30min之内。
1.2.2目的菌群定性、定量检测方法
常规细菌培养：无菌获取新鲜粪便1g，置稀释液A内，振荡器制匀浆，依次连续10倍稀释到10-8，于不同稀释度取标本液50uL并用“L”棒涂抹于不同培养基上，依据研究目的，对所选目的菌进行定性定量检测。
非选择性培养基：肠道厌氧菌培养基BL、肠道需氧菌培养基；
选择性培养基：双歧杆菌培养基、类杆菌培养基、乳杆菌培养基、肠杆菌培养基、肠球菌培养基、酵母菌培养基。
培养条件：厌氧菌培养采用厌氧盒，于37℃培养48 h～72 h；需氧菌用普通温箱37℃培养48h。
菌种鉴定：厌氧菌三级鉴定法。采用API生化鉴定系统，将细菌鉴定到属水平。检测下限为2×10-1 CFU/g湿便。
荧光定量PCR：粪便总DNA抽提：采用QIAamp? DNA粪便袖珍试剂盒（Qiagen， Hilden， German）抽提粪便总DNA，按试剂盒说明操作。所有抽提获得的粪便总DNA置于-80℃保存备用。PCR扩增：采用相应特异性引物，在不同条件下扩增肠杆菌、乳酸杆菌、类杆菌以及双歧杆菌（4种菌属）DNA。定量PCR仪检测：采用MJ Opticon 2定量PCR仪（Bio-Rad， USA）及MJ Opticon MonitorTM分析软件（Version 3.1）分析粪便中细菌基因拷贝数。
1.3统计学处理
所有数据用均数±标准差表达，两组比较采用成组的检验，多组比较采用方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义，所有的统计学分析均用SPSS10.0进行处理。
2结果
2.1 粪便细菌培养结果
2.1.1少年组、靑壮年组、老年组三组肠道菌群值及B/E值比较
老年组肠杆菌较少年组及靑壮年组明显增加（8.51±0.99VS 9.57±1.11 p<0.05；8.29±1.09 VS 9.57±1.11 p<0.01），少年组及青壮年组之间对比无差异；肠球菌及类杆菌菌群值与少年组及靑壮年组对比有增加，经统计学分析明显差异；双歧杆菌及双歧杆菌与肠杆菌的比值（B/E值）老年组则明显降低，见表 1。
3讨论
肠道微生态与人的寿命、 健康密切相关。微生态平衡时，肠内细菌就有益于人体，而在微生态失衡时，有害菌产生的毒性物质或内毒素的释放，以及肠内细菌导致的内源性感染等又会引发疾病的产生， 加速衰老和死亡。老年人正常微生物种类与数量的改变与疾病的发生、 发展之间存在着非常微妙的关系。体肠道是一个巨大的细菌库， 人的胃肠道栖息着大约30 属550 多种细菌， 主要由厌氧菌 兼性厌氧菌和需氧菌组成， 其中专性厌氧菌占99%以上， 而仅拟杆菌及双歧杆菌就占细菌总数90%以上[1]，沿着胃肠道，肠道微生态的分布不同[2- 3]。人体肠道正常菌群在肠腔内形成3个生物层：深层近黏膜为膜菌群，由双歧杆菌和乳酸杆菌组成，属共生菌；中层为厌氧菌，包括消化链球菌、优杆菌等； 表层为腔菌群，主要是大肠杆菌、肠球菌等需氧和兼性厌氧菌。它们以一定的数量和比例，存在人体的肠道中，起营养、生物拮抗、免疫、 促进生长、抗肿瘤和防止衰老的作用[4]。双歧杆菌通过利用短链糖类物质而大量繁殖，形成竞争的微生态环境，从而抑制致病菌的生长，乳杆菌则是通过产酸降低肠道的pH值，从而达到形成不利有害菌生长的酸性环境，它们已是公认的肠道益生菌，与宿主终生相伴。菌群失调是指肠道原籍菌发生定性或定量的改变，出现益生菌与致病菌比例明显改变。双歧菌与肠杆菌的比值（B/E 值）可以用来作为肠道定植抗力的指标，肠道定植力即指包括双岐杆菌在内的专属厌氧菌对肠道需氧的潜在致病菌群的抑制作用，其比值小于1 表示肠道定植抗力受损[5] 。通过本次研究发现老年组双歧杆菌值较少年组及青壮年组明显减少，（9.25±0.86 vs 8.56±0.89 p<0.05； 9.44±0.72 vs 8.56±0.89 p<0.01 ）见表1；荧光定量PCR分析发现老年组乳酸杆菌值较青壮年组下降（6.95±0.53vs 7.65±0.26 p<0.05），见表2，而传统的细菌培养两者见无差异，见表1。我们同时对各组间的B/E值进行对比，发现本组老年组的B/E值小于1，与少年组及青壮年组对比明显下降，经对比有明显统计学差异（0.89±0.13vs1.09±0.15 p<0.01；0.89±0.13vs1.14±0.20 p<0.01，以上均说明性老年人的肠道生物屏障功能减弱，定植抗力下降， 易发生肠道菌群的失调。
肠球菌及肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分，肠道受到外界影响处于病理状态或用药不合理的情况下会转变为致病菌，是院内感染的重要病原菌，此次研究我们发现老年组无论肠杆菌还是肠球菌值较少年组及青壮年组均增加，特别是肠杆菌，增加明显（9.57±1.11vs8.51±0.99 p<0.05； 9.57±1.11vs8.29±1.09 p<0.01 ）。提示在同样的外界刺激下，老年更容易致病。
综上所述，随着年龄的增长，肠道肠杆菌、肠球菌的菌数量明显增加，双歧杆菌、乳杆菌数量显著减少，B/E 值下降，肠道微生态出现演替性变化，肠道定植抗力减弱，抵抗病原菌侵袭能力降低，易于引起感染。下一步我们将继续就如何调节老年人肠道微生态，保护肠粘膜展开研究。
参考文献：
[1] Biagi E，Nylund L，Candela M，et al.Through ageing，and beyond：gut microbiota and inammatory status in seniors and centenarians[J].PLoS ONE，2010，5（ 5）： e10667.
[2] Ouwehand A，Vesterlund S.Health aspects of probiotics[J].Idrugs，2003，6（ 6）： 573- 580.
[3] M?kivuokko H，Tiihonen K，Tynkkynen S，et al.The effect of age and non-steroidal anti- inflammatory drugs on human intestinal microbiota composition[J].Br J Nutr，2010， 103（ 2）：227- 234.
[4] 徐志毅.肠道正常菌群与人体的关系[J].微生物学通报，2005，32（3）：117.
[5] 吴仲文，李兰娟，马伟杭，等.肠道微生物定植抗力的新指标-B/E值[J].浙江预防医学，2000，12（7）：4-5.
在人体，肠道菌群是一个复杂的微生态系统，目前在肠道中细菌已知多达 500 余种，大约1013～1014个，厌氧菌约占98%以上。肠道菌群的种类和数量是相对稳定的， 受饮食、内分泌、卫生习惯、地理环境、年龄及卫生条件的影响而变动。本研究以不同年龄阶段的健康人群为对象，通过常规细菌培养及荧光定量PCR来检测其肠道菌群的数量，进一步研究肠道众多菌群与年龄关系，希望找到长寿老人相关肠道菌群。
1 对象与方法
1.1 对象
共收集健康人群粪便标本81例，其中：少年组26例，男性16例，女性10例，年龄范围8-15岁，平均年龄12.3岁；青壮年人群30例，男性17例，女性13例，年龄范围27-50岁，平均年龄36.7岁； 老年人群25例，男性15例，女性10例，年龄范围65-80岁，平均年龄71.2岁。三组人群采样前无腹泻便秘等胃肠道疾病、肝胆疾病及心脑肾等重要脏器疾病史，4周内未用过微生态活菌制剂（如酸奶）及抗生素。
1.2 方法
1.2.1实验者留取粪便标本于无菌袋中，置入厌氧罐内，立即送检分离，所需时间严格控制在30min之内。
1.2.2目的菌群定性、定量检测方法
常规细菌培养：无菌获取新鲜粪便1g，置稀释液A内，振荡器制匀浆，依次连续10倍稀释到10-8，于不同稀释度取标本液50uL并用“L”棒涂抹于不同培养基上，依据研究目的，对所选目的菌进行定性定量检测。
非选择性培养基：肠道厌氧菌培养基BL、肠道需氧菌培养基；
选择性培养基：双歧杆菌培养基、类杆菌培养基、乳杆菌培养基、肠杆菌培养基、肠球菌培养基、酵母菌培养基。
培养条件：厌氧菌培养采用厌氧盒，于37℃培养48 h～72 h；需氧菌用普通温箱37℃培养48h。
菌种鉴定：厌氧菌三级鉴定法。采用API生化鉴定系统，将细菌鉴定到属水平。检测下限为2×10-1 CFU/g湿便。
荧光定量PCR：粪便总DNA抽提：采用QIAamp? DNA粪便袖珍试剂盒（Qiagen， Hilden， German）抽提粪便总DNA，按试剂盒说明操作。所有抽提获得的粪便总DNA置于-80℃保存备用。PCR扩增：采用相应特异性引物，在不同条件下扩增肠杆菌、乳酸杆菌、类杆菌以及双歧杆菌（4种菌属）DNA。定量PCR仪检测：采用MJ Opticon 2定量PCR仪（Bio-Rad， USA）及MJ Opticon MonitorTM分析软件（Version 3.1）分析粪便中细菌基因拷贝数。
1.3统计学处理
所有数据用均数±标准差表达，两组比较采用成组的检验，多组比较采用方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义，所有的统计学分析均用SPSS10.0进行处理。
2结果
2.1 粪便细菌培养结果
2.1.1少年组、靑壮年组、老年组三组肠道菌群值及B/E值比较
老年组肠杆菌较少年组及靑壮年组明显增加（8.51±0.99VS 9.57±1.11 p<0.05；8.29±1.09 VS 9.57±1.11 p<0.01），少年组及青壮年组之间对比无差异；肠球菌及类杆菌菌群值与少年组及靑壮年组对比有增加，经统计学分析明显差异；双歧杆菌及双歧杆菌与肠杆菌的比值（B/E值）老年组则明显降低，见表 1。
3讨论
肠道微生态与人的寿命、 健康密切相关。微生态平衡时，肠内细菌就有益于人体，而在微生态失衡时，有害菌产生的毒性物质或内毒素的释放，以及肠内细菌导致的内源性感染等又会引发疾病的产生， 加速衰老和死亡。老年人正常微生物种类与数量的改变与疾病的发生、 发展之间存在着非常微妙的关系。体肠道是一个巨大的细菌库， 人的胃肠道栖息着大约30 属550 多种细菌， 主要由厌氧菌 兼性厌氧菌和需氧菌组成， 其中专性厌氧菌占99%以上， 而仅拟杆菌及双歧杆菌就占细菌总数90%以上[1]，沿着胃肠道，肠道微生态的分布不同[2- 3]。人体肠道正常菌群在肠腔内形成3个生物层：深层近黏膜为膜菌群，由双歧杆菌和乳酸杆菌组成，属共生菌；中层为厌氧菌，包括消化链球菌、优杆菌等； 表层为腔菌群，主要是大肠杆菌、肠球菌等需氧和兼性厌氧菌。它们以一定的数量和比例，存在人体的肠道中，起营养、生物拮抗、免疫、 促进生长、抗肿瘤和防止衰老的作用[4]。双歧杆菌通过利用短链糖类物质而大量繁殖，形成竞争的微生态环境，从而抑制致病菌的生长，乳杆菌则是通过产酸降低肠道的pH值，从而达到形成不利有害菌生长的酸性环境，它们已是公认的肠道益生菌，与宿主终生相伴。菌群失调是指肠道原籍菌发生定性或定量的改变，出现益生菌与致病菌比例明显改变。双歧菌与肠杆菌的比值（B/E 值）可以用来作为肠道定植抗力的指标，肠道定植力即指包括双岐杆菌在内的专属厌氧菌对肠道需氧的潜在致病菌群的抑制作用，其比值小于1 表示肠道定植抗力受损[5] 。通过本次研究发现老年组双歧杆菌值较少年组及青壮年组明显减少，（9.25±0.86 vs 8.56±0.89 p<0.05； 9.44±0.72 vs 8.56±0.89 p<0.01 ）见表1；荧光定量PCR分析发现老年组乳酸杆菌值较青壮年组下降（6.95±0.53vs 7.65±0.26 p<0.05），见表2，而传统的细菌培养两者见无差异，见表1。我们同时对各组间的B/E值进行对比，发现本组老年组的B/E值小于1，与少年组及青壮年组对比明显下降，经对比有明显统计学差异（0.89±0.13vs1.09±0.15 p<0.01；0.89±0.13vs1.14±0.20 p<0.01，以上均说明性老年人的肠道生物屏障功能减弱，定植抗力下降， 易发生肠道菌群的失调。
肠球菌及肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分，肠道受到外界影响处于病理状态或用药不合理的情况下会转变为致病菌，是院内感染的重要病原菌，此次研究我们发现老年组无论肠杆菌还是肠球菌值较少年组及青壮年组均增加，特别是肠杆菌，增加明显（9.57±1.11vs8.51±0.99 p<0.05； 9.57±1.11vs8.29±1.09 p<0.01 ）。提示在同样的外界刺激下，老年更容易致病。
综上所述，随着年龄的增长，肠道肠杆菌、肠球菌的菌数量明显增加，双歧杆菌、乳杆菌数量显著减少，B/E 值下降，肠道微生态出现演替性变化，肠道定植抗力减弱，抵抗病原菌侵袭能力降低，易于引起感染。下一步我们将继续就如何调节老年人肠道微生态，保护肠粘膜展开研究。
参考文献：
[1] Biagi E，Nylund L，Candela M，et al.Through ageing，and beyond：gut microbiota and inammatory status in seniors and centenarians[J].PLoS ONE，2010，5（ 5）： e10667.
[2] Ouwehand A，Vesterlund S.Health aspects of probiotics[J].Idrugs，2003，6（ 6）： 573- 580.
[3] M?kivuokko H，Tiihonen K，Tynkkynen S，et al.The effect of age and non-steroidal anti- inflammatory drugs on human intestinal microbiota composition[J].Br J Nutr，2010， 103（ 2）：227- 234.
[4] 徐志毅.肠道正常菌群与人体的关系[J].微生物学通报，2005，32（3）：117.
[5] 吴仲文，李兰娟，马伟杭，等.肠道微生物定植抗力的新指标-B/E值[J].浙江预防医学，2000，12（7）：4-5.