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【摘 要】 目的：研究并建立遵义白及药材HPLC指纹图谱识别方法，方法：采用HPLC色谱法，建立指纹图谱识别共有模式。结果：建立白及药材HPLC指纹图谱识别方法，并对不同产地的白及和白及对照药材进行相似度比较，HPLC指纹图谱标定为13个共有峰，10批不同产地白及药材相似度均大于0.95，3批知母药材相似度均小于0.20。结论：白及药材HPLC指纹图谱具有重复性好、特征性强、方法简便等特点，可用于白及的有效鉴别。
【关键词】 遵义白及；知母；HPLC；指纹图谱
【中图分类号】R282.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）15-0024-03
Abstract：Objective The HPLC fingerpint for the identification of Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.Methods The mutual mode to HPLC fingerprints was set up. Results HPLC fingerprints was set up， and the 13 common peaks were obtaingd.The similarities adulterants samples were all above 0.95， adulterant samples were less than 0.20. Conclusion The method is simple，stable，and reproducible，which can be used to identify Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.
Keywords：Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f；Anemarrhena Asphodeloides Bge；TLC ；Fingerprints
白及為兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.干燥的块茎[1]，具有收敛止血、消肿生肌功效、用于咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒。知母为为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.干燥的块茎，白及和知母药材外形极为相似，特别炮制为饮片后，由于白及与知母在价格上有极大的差异，在民间人们用知母冒充白及药材和白及饮片销售的例子越来越多。笔者采用白及对照药材作为参照，建立HPLC指纹图谱共有模式，为白及药材快速识别提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent LC-1260高效液相色谱议（包括四元泵，DAD，柱温箱，自动进样器，工作站），AB204-S型梅特勒电子天平，KQ-500DV型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试剂与材料 乙睛色谱纯，娃哈哈纯净水，硅胶G薄层板（购于青岛海洋化工有限公司），其它试剂均为分析纯，白及对照药材（批号：121262-201405，中国食品药品检检验研究院）。白及和知母药材，采集于贵州省遵义各地区，白及经遵义市食品药品检验所邓顺超副主任中药师鉴定为兰科植物白及（Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.干燥的块茎，知母为为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.干燥的块茎，样品来源见表1。
2 方法和结果
2.1 指纹图谱建立[3-6]2.1.1 色谱条件 色谱柱：Aglent C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）进行线性梯度洗脱，0～10min，5%A～10% A，10～15min，10%A～20%A，15～35min，20%A～30% A，35～45min，30%A～10% A；45～50min，10%A～5% A，体积流量：1.0mL·min-1；柱温：25℃；检测波长：225nm；运行时间：50min；进样量为10μL。所有组分在50min内出峰完毕。
2.1.2 对照药材溶液制备 取对照药材约1.0g，精密称定，加甲醇20mL，称其重量，超声处理50min，取出，放置室温，用甲醇补足重量，取续滤液，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取白及药材粉末（过2号筛）1.0g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，即得。
2.1.4 方法学考察
2.1.4.1 精密度 取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，测得各共有指纹峰相对保留时间的RSD为1.0%，结果表明仪器精密度好。
2.1.4.2 重复性 取同一批样品6份，制备供试品溶液，分别进样，以对照药材为参照，共有特征峰相对保留时间的RSD为1.8%，结果表明重复性良好。
2.1.4.3 稳定性 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12h进样，测得各共有特征峰相对保留时间的RSD为1.3%，结果表明供试品溶液在12h内稳定。
2.1.5 共有指纹图谱峰的标定 根据11批白及供试品溶液和1批对照药材溶液和3批混淆品知母溶液的HPLC法测定结果，以白及对照药材为参照，比较其色谱图（见图2、图3、图4），以对照药材为参照，共有峰的保留时间和共有峰面积标定共有峰13个，结果表明共有峰的保留时间RSD小于1.0%，符合指纹图谱的要求。HPLC指纹图谱13个共有峰保留时间和峰面积，见表2。
3.6 相似度计算 采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004年A版计算出10批次的白及与1批对照药材和3批知母HPLC指纹图谱的相似度，与共有模式相比较，结果见表3。
3 讨论
通过建立该指纹图谱，对10批白及和1批对照药材和3批混淆品知母药材HPLC图谱进行比较，结果发现10批白及药材HPLC图谱的共有峰保留时间、相对峰面积非常吻合，与对照药材共有模式R比较，相似度均大于0.95。由此可以确定这10批见白及药材质量较为一致，这与药材来源相吻合。共有峰峰面积相差较大外，这可能是药材生长环境因素影响，而3批知母药材相似度均小于0.20。
本法简便、快速，准确度高，特征性强等特点，可用于白及药材的质量控制和识别，同时为遵义白及药材和混淆品知母药材鉴别和质控制提供科学依据。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：103.
[2]冯华，石尚友，罗秀琼，等. 黔产大菟丝子中绿原酸的定性与定量分析[J]. 中国民族民间医药，2017，26（5）：14-16.
[3]杨顺丽，杨枝中，李龙，等. 白及薄层色谱鉴别方法的改进和高效液相指纹图谱研究[J].云南中医学院学报，2015，38（5）：41-45.
[4]冯华，刘英波，刘亮，等. 黔产辣蓼及其混淆品高效液相指纹图谱研究[J].中草药，2015，19（46）：2493-2495.
[5]冯华，石尚友，罗秀琼，等. 黔产见血清药材薄层色谱与HPLC指纹图谱识别[J].时珍国医国药，2017，28（10）：2423-2425.
[6]冯华，聂明华，罗秀琼，等. 土知母药材及其混淆品HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（6）：67-69.
【关键词】 遵义白及；知母；HPLC；指纹图谱
【中图分类号】R282.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2018）15-0024-03
Abstract：Objective The HPLC fingerpint for the identification of Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.Methods The mutual mode to HPLC fingerprints was set up. Results HPLC fingerprints was set up， and the 13 common peaks were obtaingd.The similarities adulterants samples were all above 0.95， adulterant samples were less than 0.20. Conclusion The method is simple，stable，and reproducible，which can be used to identify Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.
Keywords：Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f；Anemarrhena Asphodeloides Bge；TLC ；Fingerprints
白及為兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.干燥的块茎[1]，具有收敛止血、消肿生肌功效、用于咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒。知母为为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.干燥的块茎，白及和知母药材外形极为相似，特别炮制为饮片后，由于白及与知母在价格上有极大的差异，在民间人们用知母冒充白及药材和白及饮片销售的例子越来越多。笔者采用白及对照药材作为参照，建立HPLC指纹图谱共有模式，为白及药材快速识别提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent LC-1260高效液相色谱议（包括四元泵，DAD，柱温箱，自动进样器，工作站），AB204-S型梅特勒电子天平，KQ-500DV型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试剂与材料 乙睛色谱纯，娃哈哈纯净水，硅胶G薄层板（购于青岛海洋化工有限公司），其它试剂均为分析纯，白及对照药材（批号：121262-201405，中国食品药品检检验研究院）。白及和知母药材，采集于贵州省遵义各地区，白及经遵义市食品药品检验所邓顺超副主任中药师鉴定为兰科植物白及（Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.干燥的块茎，知母为为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.干燥的块茎，样品来源见表1。
2 方法和结果
2.1 指纹图谱建立[3-6]2.1.1 色谱条件 色谱柱：Aglent C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）进行线性梯度洗脱，0～10min，5%A～10% A，10～15min，10%A～20%A，15～35min，20%A～30% A，35～45min，30%A～10% A；45～50min，10%A～5% A，体积流量：1.0mL·min-1；柱温：25℃；检测波长：225nm；运行时间：50min；进样量为10μL。所有组分在50min内出峰完毕。
2.1.2 对照药材溶液制备 取对照药材约1.0g，精密称定，加甲醇20mL，称其重量，超声处理50min，取出，放置室温，用甲醇补足重量，取续滤液，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取白及药材粉末（过2号筛）1.0g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，即得。
2.1.4 方法学考察
2.1.4.1 精密度 取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，测得各共有指纹峰相对保留时间的RSD为1.0%，结果表明仪器精密度好。
2.1.4.2 重复性 取同一批样品6份，制备供试品溶液，分别进样，以对照药材为参照，共有特征峰相对保留时间的RSD为1.8%，结果表明重复性良好。
2.1.4.3 稳定性 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12h进样，测得各共有特征峰相对保留时间的RSD为1.3%，结果表明供试品溶液在12h内稳定。
2.1.5 共有指纹图谱峰的标定 根据11批白及供试品溶液和1批对照药材溶液和3批混淆品知母溶液的HPLC法测定结果，以白及对照药材为参照，比较其色谱图（见图2、图3、图4），以对照药材为参照，共有峰的保留时间和共有峰面积标定共有峰13个，结果表明共有峰的保留时间RSD小于1.0%，符合指纹图谱的要求。HPLC指纹图谱13个共有峰保留时间和峰面积，见表2。
3.6 相似度计算 采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004年A版计算出10批次的白及与1批对照药材和3批知母HPLC指纹图谱的相似度，与共有模式相比较，结果见表3。
3 讨论
通过建立该指纹图谱，对10批白及和1批对照药材和3批混淆品知母药材HPLC图谱进行比较，结果发现10批白及药材HPLC图谱的共有峰保留时间、相对峰面积非常吻合，与对照药材共有模式R比较，相似度均大于0.95。由此可以确定这10批见白及药材质量较为一致，这与药材来源相吻合。共有峰峰面积相差较大外，这可能是药材生长环境因素影响，而3批知母药材相似度均小于0.20。
本法简便、快速，准确度高，特征性强等特点，可用于白及药材的质量控制和识别，同时为遵义白及药材和混淆品知母药材鉴别和质控制提供科学依据。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：103.
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[3]杨顺丽，杨枝中，李龙，等. 白及薄层色谱鉴别方法的改进和高效液相指纹图谱研究[J].云南中医学院学报，2015，38（5）：41-45.
[4]冯华，刘英波，刘亮，等. 黔产辣蓼及其混淆品高效液相指纹图谱研究[J].中草药，2015，19（46）：2493-2495.
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[6]冯华，聂明华，罗秀琼，等. 土知母药材及其混淆品HPLC指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2014，20（6）：67-69.