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摘要 目的：探讨血小板源内皮细胞生长因子（PD-ECGF）在进展期大肠癌中的表达及与其生物学行为的关系，并进行临床病理学评价。方法：以进展期大肠癌86例为研究对象采用免疫组化染色法就其PD-ECGF的表达与临床病理因子及预后进行研究。利用CD6＼8抗体免疫染色确定PD-ECGF与巨噬细胞的关系。同时利用CD31抗体进行血管染色测定肿瘤组织的血管密度，分析PD-ECGF与肿瘤血管新生的相关性。利用计算机图像分析技术将大肠癌分为PD-ECGF高發现群和低发现群，进行统计学分析。结果：PD-ECGF主要发现在肿瘤间质内浸润的巨噬细胞中，而大肠癌细胞中几乎未发现PD-ECGF。PD-ECGF的发现与淋巴及血行转移呈负相关（P<0.05）。PD-ECGF与肿瘤的新生血管未见有明显相关性（P>0.05）。结论：肿瘤间质内浸润的巨噬细胞分泌产生PD-ECGF，而不是癌细胞。PD-ECGF在大肠癌中的表达可能是肿瘤免疫诱导的结果。
关键词 大肠癌；病理学；外科；PD-ECGF；免疫组织化学；巨噬细胞
中图分类号：R574 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）4-011-03
目前研究认为血小板源内皮细胞生长因子（PD-ECGF）是内皮细胞分裂素，参与血管生成活力[1]。国外文献对PD-ECGF在乳癌、胃癌、宫颈癌等有相关报道，但对结肠癌的研究甚少[2]。国内尚无对PD-ECGF的研究报告。本研究选择86例进展期大肠癌病例，采用免疫组化方法，探讨PD-ECGF的产生及其与血管新生、肿瘤转移的关系。
资料和方法
1、标本：取自1998年1月至2001年1月，在施行大肠癌根治术的病人中选择86例进展期大肠癌，标本经病理证实肿瘤浸润深度均至肠壁固有肌层（pm）或浆膜下肌层（sm）。
2、试剂：免疫组化染色试剂盒、抗PD-ECGF单克隆抗体、抗CD31单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体均购自美国DAKO公司。
3、方法：PD-ECGF免疫组化染色：将手术切除的大肠癌标本用10%福尔马林固定的石蜡标本制成3um的连续切片，在微波炉内加热5分钟2次（500W）以使抗原复活，用生物素阻断试剂盒以阻断内源性生物素活性，用3%牛奶表层物孵化标本阻断非特异性反应，稀释200倍抗PD-ECGF单克隆抗体孵化标本在4°下充分反应一夜，次日用PBS缓冲液冲洗标本3分钟3次，滴加PBS稀释100倍的生物素化的抗鼠lgG并在室温下孵化30分钟，PBS冲洗，3分钟3次。PBS液冲洗，PAB显影，蒸馏水漂洗，苏木素反染固定，封片。CD31和CD68免疫组化染色过程同上。
4、免疫组织化学评估：
按照免疫组织化学评价PD-ECGF和CD31表达用计算机影像分析系统（Olympus自动解析装置SP500）进行评价，将病人分成PD-ECGF高表达组和低表达组，高血管密度组和低血管密度组。为表达PD-ECGF特征，即为探讨间质内什么细胞分泌产生PD-ECGF，用人体巨噬细胞标记物CD68抗体对连续切片进行免疫染色。
5、统计与分析：患者临床病理特点与PD-ECGF表达及血管计数相关性用X2检验。生存曲线按Kaplan-meier方法计算并用Wiloxon检验。
结果：
1、PD-ECGF与CD68免疫组织化学染色
86例大肠癌标本中，除了2例癌细胞中有PD-ECGF染色以外，癌细胞中未发现PD-ECGF染色。正常粘膜细胞中亦未发现PD-ECGF染色。PD-ECGF染色阳性细胞主要存在于肿瘤间质组织内。对连续切片进行CD68免疫组化染色，结果发现PD-ECGF阳性细胞主要存在于肿瘤间质内的巨噬细胞内，其中高PD-ECGF表达56例（65.1%），低表达30例（34.9%）。
2、CD31免疫组织化学染色
CD31单克隆抗体用于肿瘤间质血管生成状况研究。其结果高血管密度组31例（36.0%），低血管密度组55例（64.0%）。
3、PD-ECGF表达与临床背景和临床病理学特点的关系。
PD-ECGF表达与病人年龄、性别、肿瘤部位、组织分化程度、浸润深度、淋巴管浸润无关（P>0.05），与淋巴结转移呈逆相关（P<0.05）（见表1）。
4、PD-ECGF表达与血行转移及5年生存率的关系。本组高PD-ECGF表达与低PD-ECGF表达相比具有低血行转移发生率及良好的生存率（P<0.05）（见图1）。
5、血管密度与PD-ECGF表达及临床病理之间的关系。
86例进展期大肠癌PD-ECGF表达与血管密度无关。血管密度与浸润深度、淋巴管浸润、静脉浸润及淋巴结转移无特殊关系（见表2）。血管密度与血行转移无特殊关系（见图2）。
讨论：
国外文献报道依肿瘤种类不同，PD-ECGF表达亦不相同。在乳癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、肺癌和胰腺癌、PD-ECGF染色阳性的细胞存在于癌肿细胞中[3]。Takebayashi等在肠癌的研究中发现强PD-ECGF表达在许多肿瘤细胞的细胞质中，也发现在巨噬细胞和肿瘤间质组织的成纤维细胞中[4]。在我们的研究中，强PD-ECGF表达被发现存在于肿瘤间质的基质细胞中，同一标本的CD68免疫染色证实是巨噬细胞。我们得出的结论是进展期大肠癌间质内浸润的巨噬细胞分泌产生PD-ECGF而不是癌细胞分泌产生PD-ECGF。这与Takehashi在结肠癌和胃癌的研究结果基本相同。
据国外文献报道[5]PD-ECGF在乳癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌及宫颈癌与微血管密度相关，表明PD-ECGF对肿瘤的脉管系统和肿瘤血管发生的形成及发展起重要作用。PD-ECGF表达可做为大肠癌和胃癌预后不良的判定指标。这种与预后的相关性与肿瘤血管发生的作用有关。在大肠癌病人的研究中发现，PD-ECGF表达与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移、淋巴管浸润和静脉浸润有密切关系，高PD-ECGF水平与广泛的肿瘤血管新生密切相关。然而，经仔细分析该研究报道，发现许多早期癌病例，即限于粘膜和粘膜下层的早期癌被包括在内。众所周知，早期癌有良好的预后，在日本东京大学肛肠外科武滕彻一郎教授对早期大肠癌的研究中发现PD-ECGF表达在早期大肠癌中很低。因此，在本次研究中为排除早期癌病例去证实PD-ECGF的精确作用与血管发生及预后的关系，将研究对象集中在浸润固有肌层和浆膜下肌层的进展期癌，以判定PD-ECGF表达对大肠癌生物学特性及预后影响的正确关系。本研究的统计学分析结果表明PD-ECGF表达与新生血管密度、浸润深度、淋巴管及静脉浸润之间无特殊关系，与淋巴结转移及血行转移呈逆相关，即这些高PD-ECGF表达的病例与低PD-ECGF表达的病例相比，具有低的淋巴结及血液转移发生率，具有相对高的存活率及较好的临床预后。这与以前的研究结论不同。 从本研究结果可以看出巨噬细胞浸润肿瘤细胞的间质并分泌产生PD-ECGF，PD-ECGF表达与血管新生无特殊关系，但其表达与淋巴结及血行转移呈逆相关，并具有较好的临床预后。目前PD-ECGF在大肠癌中的作用机制尚不清楚，从我们的研究结果推断肿瘤间质中的巨噬细胞分泌产生PD-ECGF可能是抗腫瘤免疫反应的一部分。
巨噬细胞浸润肿瘤间质和炎性组织，其重要作用在于免疫反应。巨噬细胞是对抗原刺激反应较强的辅细胞，由抗原诱导的辅助T细胞及缺氧介导其活性，并参与激活细胞毒性反应T淋巴细胞（CTL）的免疫过程。在肿瘤组织中，肿瘤特定的和相关抗原刺激传递细胞免疫反应，巨噬细胞被淋巴细胞因子激活并很可能在这个过程中发挥作用。巨噬细胞浸润到肿瘤细胞间质的可能过程是被肿瘤分泌的化学激活作用产物（chemokine）刺激的结果。尽管没有报道关于大肠癌化学激活作用，有报道在肺癌组织中产生的MIP-1α，是一种C-C化学激活因子（chemokine）为化学诱导剂和单核细胞活化剂。虽然巨噬细胞能浸润至肿瘤间质，但他们并不都处于激活状态。最近的研究[6]表明同时活动转移的存在与沿大肠癌浸润边界分布的巨噬细胞的数目呈逆相关。在另外的研究中[7]，在肿瘤间质的巨噬细胞表示不显著的B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表达，分子均被T淋巴细胞激活，表明肿瘤间质内浸润的巨噬细胞处在非激活状态。如果巨噬细胞被癌细胞分泌的化学介质激活则迅速释放血管新生因子诱导肿瘤血管新生的发生和发展，随着肿瘤的浸润进展，PD-ECGF高达表的肿瘤与PD-ECGF低表达的肿瘤相比显示具有较高的肿瘤新生血管密度，并且预后不良。本研究中，具有高PD-ECGF表达的大肠癌与低PD-ECGF表达的大肠癌比较，高表达者具有大量巨噬细胞浸润于间质中，具有较好的预后。表明在抗癌免疫反应的发展过程中巨噬细胞起关键作用，进展期大肠癌PD-ECGF表达可能是肿瘤免疫诱导的结果。
肿瘤间质浸润的巨噬细胞其精确作用如何？是否有PD-ECGF阳性和阴性巨噬细胞而且在功能上发挥不同作用，均有待于进一步研究。
参考文献
1 Griffithls L et al.Cancer Res 1997：57 0-572.
2.Takahashi Y，et al.PD-CEGF in human colon Cancer angiogenesis role of infiltrating cells[J].Natl Cancer Tnst 1996：88（16）1146-51.
3.Takebayashi Y，Yamada K，et al.The activity and expression of thymidire phosphorylase in human solid tumours.Eur J comcer 1996：32A（7）1277-32.
4.Takebayashi Y，et al.Expression of thymidine phosphorylase in human gastric carcinoma Jpn [J] Cancer Res 1996：87（3）288-95.
5.Toi M，et al.Expression of PD-CEGF/thymidine phosphorylase in human breast cancer. Int[J] cancer 1995：64（2）79-82.
6.Moghaddam A，et al.Thymidine phosphorylase is angiogenic and promotes tumor growth . Proc Natl Acad Sci USA 1995：92（4）998-1002.
7.Reynolds K，et al.Association of ovanan malignancy with expression of PD-CEGF. [J] Natl Cancer Inst 1994：86（16）1234-8.
通信作者：金政锡（1954-），男，博士后，教授，硕士研究生导师，黑龙江省医院，普外一科。E-mail：[email protected]
作者简介：刘大伟（1968-），男，主任医师，博士研究生，黑龙江省医院，普外一科
关键词 大肠癌；病理学；外科；PD-ECGF；免疫组织化学；巨噬细胞
中图分类号：R574 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）4-011-03
目前研究认为血小板源内皮细胞生长因子（PD-ECGF）是内皮细胞分裂素，参与血管生成活力[1]。国外文献对PD-ECGF在乳癌、胃癌、宫颈癌等有相关报道，但对结肠癌的研究甚少[2]。国内尚无对PD-ECGF的研究报告。本研究选择86例进展期大肠癌病例，采用免疫组化方法，探讨PD-ECGF的产生及其与血管新生、肿瘤转移的关系。
资料和方法
1、标本：取自1998年1月至2001年1月，在施行大肠癌根治术的病人中选择86例进展期大肠癌，标本经病理证实肿瘤浸润深度均至肠壁固有肌层（pm）或浆膜下肌层（sm）。
2、试剂：免疫组化染色试剂盒、抗PD-ECGF单克隆抗体、抗CD31单克隆抗体、抗CD68单克隆抗体均购自美国DAKO公司。
3、方法：PD-ECGF免疫组化染色：将手术切除的大肠癌标本用10%福尔马林固定的石蜡标本制成3um的连续切片，在微波炉内加热5分钟2次（500W）以使抗原复活，用生物素阻断试剂盒以阻断内源性生物素活性，用3%牛奶表层物孵化标本阻断非特异性反应，稀释200倍抗PD-ECGF单克隆抗体孵化标本在4°下充分反应一夜，次日用PBS缓冲液冲洗标本3分钟3次，滴加PBS稀释100倍的生物素化的抗鼠lgG并在室温下孵化30分钟，PBS冲洗，3分钟3次。PBS液冲洗，PAB显影，蒸馏水漂洗，苏木素反染固定，封片。CD31和CD68免疫组化染色过程同上。
4、免疫组织化学评估：
按照免疫组织化学评价PD-ECGF和CD31表达用计算机影像分析系统（Olympus自动解析装置SP500）进行评价，将病人分成PD-ECGF高表达组和低表达组，高血管密度组和低血管密度组。为表达PD-ECGF特征，即为探讨间质内什么细胞分泌产生PD-ECGF，用人体巨噬细胞标记物CD68抗体对连续切片进行免疫染色。
5、统计与分析：患者临床病理特点与PD-ECGF表达及血管计数相关性用X2检验。生存曲线按Kaplan-meier方法计算并用Wiloxon检验。
结果：
1、PD-ECGF与CD68免疫组织化学染色
86例大肠癌标本中，除了2例癌细胞中有PD-ECGF染色以外，癌细胞中未发现PD-ECGF染色。正常粘膜细胞中亦未发现PD-ECGF染色。PD-ECGF染色阳性细胞主要存在于肿瘤间质组织内。对连续切片进行CD68免疫组化染色，结果发现PD-ECGF阳性细胞主要存在于肿瘤间质内的巨噬细胞内，其中高PD-ECGF表达56例（65.1%），低表达30例（34.9%）。
2、CD31免疫组织化学染色
CD31单克隆抗体用于肿瘤间质血管生成状况研究。其结果高血管密度组31例（36.0%），低血管密度组55例（64.0%）。
3、PD-ECGF表达与临床背景和临床病理学特点的关系。
PD-ECGF表达与病人年龄、性别、肿瘤部位、组织分化程度、浸润深度、淋巴管浸润无关（P>0.05），与淋巴结转移呈逆相关（P<0.05）（见表1）。
4、PD-ECGF表达与血行转移及5年生存率的关系。本组高PD-ECGF表达与低PD-ECGF表达相比具有低血行转移发生率及良好的生存率（P<0.05）（见图1）。
5、血管密度与PD-ECGF表达及临床病理之间的关系。
86例进展期大肠癌PD-ECGF表达与血管密度无关。血管密度与浸润深度、淋巴管浸润、静脉浸润及淋巴结转移无特殊关系（见表2）。血管密度与血行转移无特殊关系（见图2）。
讨论：
国外文献报道依肿瘤种类不同，PD-ECGF表达亦不相同。在乳癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、肺癌和胰腺癌、PD-ECGF染色阳性的细胞存在于癌肿细胞中[3]。Takebayashi等在肠癌的研究中发现强PD-ECGF表达在许多肿瘤细胞的细胞质中，也发现在巨噬细胞和肿瘤间质组织的成纤维细胞中[4]。在我们的研究中，强PD-ECGF表达被发现存在于肿瘤间质的基质细胞中，同一标本的CD68免疫染色证实是巨噬细胞。我们得出的结论是进展期大肠癌间质内浸润的巨噬细胞分泌产生PD-ECGF而不是癌细胞分泌产生PD-ECGF。这与Takehashi在结肠癌和胃癌的研究结果基本相同。
据国外文献报道[5]PD-ECGF在乳癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌及宫颈癌与微血管密度相关，表明PD-ECGF对肿瘤的脉管系统和肿瘤血管发生的形成及发展起重要作用。PD-ECGF表达可做为大肠癌和胃癌预后不良的判定指标。这种与预后的相关性与肿瘤血管发生的作用有关。在大肠癌病人的研究中发现，PD-ECGF表达与肿瘤大小、浸润程度、淋巴结转移、淋巴管浸润和静脉浸润有密切关系，高PD-ECGF水平与广泛的肿瘤血管新生密切相关。然而，经仔细分析该研究报道，发现许多早期癌病例，即限于粘膜和粘膜下层的早期癌被包括在内。众所周知，早期癌有良好的预后，在日本东京大学肛肠外科武滕彻一郎教授对早期大肠癌的研究中发现PD-ECGF表达在早期大肠癌中很低。因此，在本次研究中为排除早期癌病例去证实PD-ECGF的精确作用与血管发生及预后的关系，将研究对象集中在浸润固有肌层和浆膜下肌层的进展期癌，以判定PD-ECGF表达对大肠癌生物学特性及预后影响的正确关系。本研究的统计学分析结果表明PD-ECGF表达与新生血管密度、浸润深度、淋巴管及静脉浸润之间无特殊关系，与淋巴结转移及血行转移呈逆相关，即这些高PD-ECGF表达的病例与低PD-ECGF表达的病例相比，具有低的淋巴结及血液转移发生率，具有相对高的存活率及较好的临床预后。这与以前的研究结论不同。 从本研究结果可以看出巨噬细胞浸润肿瘤细胞的间质并分泌产生PD-ECGF，PD-ECGF表达与血管新生无特殊关系，但其表达与淋巴结及血行转移呈逆相关，并具有较好的临床预后。目前PD-ECGF在大肠癌中的作用机制尚不清楚，从我们的研究结果推断肿瘤间质中的巨噬细胞分泌产生PD-ECGF可能是抗腫瘤免疫反应的一部分。
巨噬细胞浸润肿瘤间质和炎性组织，其重要作用在于免疫反应。巨噬细胞是对抗原刺激反应较强的辅细胞，由抗原诱导的辅助T细胞及缺氧介导其活性，并参与激活细胞毒性反应T淋巴细胞（CTL）的免疫过程。在肿瘤组织中，肿瘤特定的和相关抗原刺激传递细胞免疫反应，巨噬细胞被淋巴细胞因子激活并很可能在这个过程中发挥作用。巨噬细胞浸润到肿瘤细胞间质的可能过程是被肿瘤分泌的化学激活作用产物（chemokine）刺激的结果。尽管没有报道关于大肠癌化学激活作用，有报道在肺癌组织中产生的MIP-1α，是一种C-C化学激活因子（chemokine）为化学诱导剂和单核细胞活化剂。虽然巨噬细胞能浸润至肿瘤间质，但他们并不都处于激活状态。最近的研究[6]表明同时活动转移的存在与沿大肠癌浸润边界分布的巨噬细胞的数目呈逆相关。在另外的研究中[7]，在肿瘤间质的巨噬细胞表示不显著的B7-1（CD80）和B7-2（CD86）表达，分子均被T淋巴细胞激活，表明肿瘤间质内浸润的巨噬细胞处在非激活状态。如果巨噬细胞被癌细胞分泌的化学介质激活则迅速释放血管新生因子诱导肿瘤血管新生的发生和发展，随着肿瘤的浸润进展，PD-ECGF高达表的肿瘤与PD-ECGF低表达的肿瘤相比显示具有较高的肿瘤新生血管密度，并且预后不良。本研究中，具有高PD-ECGF表达的大肠癌与低PD-ECGF表达的大肠癌比较，高表达者具有大量巨噬细胞浸润于间质中，具有较好的预后。表明在抗癌免疫反应的发展过程中巨噬细胞起关键作用，进展期大肠癌PD-ECGF表达可能是肿瘤免疫诱导的结果。
肿瘤间质浸润的巨噬细胞其精确作用如何？是否有PD-ECGF阳性和阴性巨噬细胞而且在功能上发挥不同作用，均有待于进一步研究。
参考文献
1 Griffithls L et al.Cancer Res 1997：57 0-572.
2.Takahashi Y，et al.PD-CEGF in human colon Cancer angiogenesis role of infiltrating cells[J].Natl Cancer Tnst 1996：88（16）1146-51.
3.Takebayashi Y，Yamada K，et al.The activity and expression of thymidire phosphorylase in human solid tumours.Eur J comcer 1996：32A（7）1277-32.
4.Takebayashi Y，et al.Expression of thymidine phosphorylase in human gastric carcinoma Jpn [J] Cancer Res 1996：87（3）288-95.
5.Toi M，et al.Expression of PD-CEGF/thymidine phosphorylase in human breast cancer. Int[J] cancer 1995：64（2）79-82.
6.Moghaddam A，et al.Thymidine phosphorylase is angiogenic and promotes tumor growth . Proc Natl Acad Sci USA 1995：92（4）998-1002.
7.Reynolds K，et al.Association of ovanan malignancy with expression of PD-CEGF. [J] Natl Cancer Inst 1994：86（16）1234-8.
通信作者：金政锡（1954-），男，博士后，教授，硕士研究生导师，黑龙江省医院，普外一科。E-mail：[email protected]
作者简介：刘大伟（1968-），男，主任医师，博士研究生，黑龙江省医院，普外一科