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【摘要】 目的：探讨康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和T细胞亚群间的相关性。方法：抽提康复期强制戒毒人员和正常人淋巴细胞基因组DNA，采用整体甲基化定量试剂盒检测基因组DNA甲基化水平；T细胞亚群检测采用流式细胞术。结果：分别对80例康复期强制戒毒人员和正常健康人群进行淋巴细胞基因组DNA甲基化水平检测发现，康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化百分率为（15.37±3.28）%，显著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。康复期强制戒毒人员CD3+、CD3++CD4+和CD3++CD4+/CD3++CD8+均明显低于正常健康人群（P<0.05）。且CD3+、CD3++CD4+与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平呈正相关（r=0.21，0.36，P<0.05）。结论：康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著低于正常人水平，其淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和CD3+、CD3++CD4+明显相关。
【关键词】 毒品； 甲基化； 淋巴细胞； 细胞免疫
人体免疫系统是由多种免疫细胞、免疫分子共同参与，形成复杂的网络结构而发挥作用。其中淋巴细胞对免疫应答的启动起着至关重要的作用。研究发现，吸毒人群的免疫系统受到极大破坏，淋巴细胞的活性也受到破坏[1]。而在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身性免疫疾病中，均发现其淋巴细胞DNA甲基化水平发生异常[2]。吸毒所导致的免疫力低下，与淋巴细胞甲基化水平是否存在特定规律，这是本研究的主要着眼点。本研究通过检测康复期强制戒毒人员外周血淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和T淋巴细胞亚群变化，研究吸毒者免疫力受损与DNA甲基化的关联，为探讨毒品对免疫病理损伤可能机制提供理论参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本试验于2002年9月-2002年12月间进行。以80例康复期强制戒毒人员为研究对象，其来源于福建省司法厅所属强制戒毒场所自愿参加戒毒的人员，男40例，女40例，平均年龄（32.16±0.98）岁；符合ICD-10阿片类药物依赖诊断标准和苯丙胺类药物依赖诊断标准的脱毒患者；经告知同意，自愿参加，并签署知情同意书；排除HIV、肺结核、肝炎等传染性疾病患者，排除肝、肾、心功能不全者及精神病患者中不能配合者。以80例正常健康人群为对照，采集静脉血样，其来源于福建省二人民医院健康体检中心参加体检且身体健康无重大疾病者，男40例，女40例，平均年龄（29.33±2.41）岁。两组在性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 主要仪器和试剂 多功能酶标仪Infinite M200 F200（奥地利TECAN）；流式细胞分析仪EPICS XL（美国Coulter）；超低温冰箱Premium Range（美国NBS）；超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）；生化培养箱SHP-250（上海精宏）；台式离心机（美国EPPENDORF）；可调式移液器（美国EPPENDORF）。
淋巴细胞基因组DNA抽提试剂盒（美国Omega公司）；整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）；单克隆抗体（美国BD公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 外周血T淋巴细胞亚群检测 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于肝素抗凝管中。取肝素抗凝血100 μL于小试管底部，分别加20 μL荧光标记的单克隆抗体，混匀，室温（18～25 ℃）孵育15 min。加红细胞溶解液1 ml，充分混匀。待红细胞完全溶解后上流式细胞仪检测。在波长488 nm时，计数30 000个细胞。记录分析直方图，数据经ELITE软件处理，以百分率报告。
1.3.2 淋巴细胞基因组DNA的提取 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于EDTA抗凝管中。供试血样淋巴细胞基因组DNA抽提采用SE Blood DNA Kit（美国Omega公司），按试剂盒说明进行，抽提的DNA保存于-20 ℃备用。
1.3.3 DNA含量测定及纯度鉴定 取抽提好的DNA溶于双蒸水中，于超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）上测量260/280 nm光密度值。保证供试样本A260/280比值均在1.7～1.9之间，浓度在50～100 μg/ml，以用于整体DNA甲基化水平的测定。对不符合要求的DNA样本重新进行抽提和定量。
1.3.4 淋巴细胞整体基因组甲基化水平测定 DNA整体甲基化水平采用整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）检测。该试剂盒采用抗原抗体结合的方法，将DNA固定到一个对DNA具有高亲和力的反应孔中，甲基化的DNA能够被5甲基胞嘧啶抗体识别，通过抗原抗体识别反应进行定量，甲基化的DNA与OD值的高低成正比。具体操作步骤按试剂盒说明书操作，DNA甲基化的程度采用如下公式计算：
甲基化%=OD（样本-空白对照）/2×OD（阳性对照-空白对照）
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，相关性分析采用多元回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 整体DNA甲基化水平检测结果 康复期强制戒毒人员淋巴细胞中基因组DNA甲基化百分率为（15.37±3.28）%，显著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.2 T淋巴细胞亚群检测结果 康复期强制戒毒人员CD3+、CD3++CD4+ 和CD3++CD4+/CD3++CD8+值均明显低于正常健康人群，差异具有统计学意义（P<0.05）；康复期强制戒毒人员CD3++CD8+与健康人相比虽有差异，但无统计学意义（P>0.05），见表1。 2.3 淋巴细胞基因组DNA甲基化水平与T淋巴细胞亚群的相关性 以基因组DNA甲基化水平为因变量进行多元线性回归分析发现，CD3+、CD3++CD4+与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平呈正相关（r=0.21，0.36，P<0.05）。CD3++CD8+、CD3++CD4+/CD3++CD8+与其无相关关系（P>0.05）。
3 讨论
本研究表明吸毒者总T细胞（CD3+）减少，CD3++CD4+细胞也显著降低，CD3++CD8+无显著变化，故CD3++CD4+/CD3++CD8+明显下降，说明毒品抑制吸毒者的正常免疫功能。毒品对人体细胞免疫的影响早有报道。早在1974年Brown等[3]就报道，海洛因成瘾者免疫功能缺陷，表现为淋巴细胞转化率显著降低。海洛因广泛抑制机体细胞免疫功能，使淋巴细胞增殖和活性受抑制[4-5]。同时还能引起T淋巴细胞对PHA刺激导致的分化能力下降，分泌IL-2、INF-γ、IL-4能力下降[6]。研究表明，吸毒者整体细胞免疫功能处于抑制状态，其机制可能是海洛因等药物毒性代谢产物抑制了T细胞的活性和增殖能力，也可能是长期滥用外源性阿片样物质引起机体下丘脑神经内分泌激素系统（阿片肽系统）退行性改变，使其对T细胞及其亚群的正常调节作用减退和消失导致细胞免疫功能受损[7]。
DNA甲基化是目前研究较为深入的一种表观遗传学调控机制。在近几年研究中发现，DNA甲基化在自身免疫性疾病中起着重要作用。DNA甲基化水平改变可以影响许多基因的表达，包括一些与黏附因子和细胞因子表达相关的基因，导致T细胞的自身反应性发生改变，从而与疾病发病密切相关。如在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）和系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）患者中，基因组普遍DNA甲基化水平都降低[8-9]。DNA的低甲基化可能通过引起患者的某些基因的异常表达，参与疾病的发生发展[10]。
本文研究结果表明，康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著低于正常人水平，说明毒品对人体淋巴细胞DNA有一定影响，其表观遗传修饰发生改变。同时发现淋巴细胞基因组DNA甲基化水平与CD3+和CD3++CD4+呈正相关，说明吸毒所导致的细胞免疫功能下降与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平存在关联。本研究揭示了康复期戒毒人员的甲基化水平状态，发现细胞免疫功能与淋巴细胞甲基化水平相关性，为今后从分子水平探索毒品对人体免疫病理损伤机制具有重要意义。
参考文献
[1]杨忠礼，李娟，王丽，等.静脉吸毒人群HIV感染者CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞水平定量研究与分析[J].中国艾滋病性病，2004，5（1）：10-12.
[2]李遇梅，李安生，陈志强.DNA甲基化与肿瘤及系统性红斑狼疮的关系[J].国外医学：皮肤性病学分册，2004，30（5）：294-296.
[3] Brown S M，Stimel B，Taub R N，et al.Immunological dysfunction in heroin addicts[J].Arch Intern Med，1974，134（6）：1001-1006.
[4] Carr D J，France C P.Immune alterations in morphine treated rhesus monkeys [J].Pharnmol Exp Ther，1993，267（11）：9-15.
[5] Bhargara H N，Thonas P T，Thorat S，et al.Efects of morphine tolerance and abstinence of cellular immune function[J]. Bra Res，1994，642（122）：1-10.
[6] Zaki N G，Osman A，Moustafa H，et al. Alterations of immune functions in heroin addicts [J].Egypt J Immuno1，2006，13（1）：153-171.
[7] Vallqo R，De Leon Casasola O，Benyamin R.Opioid therapy and immunoanppression：a review [J].Am J Ther，2004，11（5）：354-365.
[8] Swkigawa J，Okada M，Ogasavara H，et al.DNA methylation in systemic lupus erythematogus[J].Lupus，2003，12（2）：79-85.
[9] Riehardson B.Evidence for impaired T cell DNA methylation in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，1990，33（6）：1665-1673.
[10] Xu X Y，Wang M M，Xiao C S，et al.The study of DNA methylation in rheumatoid arthritis[J].ChinRheumatol，2006，10（8）：462-465.
（收稿日期：2013-08-20） （本文编辑：蔡元元）
【关键词】 毒品； 甲基化； 淋巴细胞； 细胞免疫
人体免疫系统是由多种免疫细胞、免疫分子共同参与，形成复杂的网络结构而发挥作用。其中淋巴细胞对免疫应答的启动起着至关重要的作用。研究发现，吸毒人群的免疫系统受到极大破坏，淋巴细胞的活性也受到破坏[1]。而在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身性免疫疾病中，均发现其淋巴细胞DNA甲基化水平发生异常[2]。吸毒所导致的免疫力低下，与淋巴细胞甲基化水平是否存在特定规律，这是本研究的主要着眼点。本研究通过检测康复期强制戒毒人员外周血淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和T淋巴细胞亚群变化，研究吸毒者免疫力受损与DNA甲基化的关联，为探讨毒品对免疫病理损伤可能机制提供理论参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本试验于2002年9月-2002年12月间进行。以80例康复期强制戒毒人员为研究对象，其来源于福建省司法厅所属强制戒毒场所自愿参加戒毒的人员，男40例，女40例，平均年龄（32.16±0.98）岁；符合ICD-10阿片类药物依赖诊断标准和苯丙胺类药物依赖诊断标准的脱毒患者；经告知同意，自愿参加，并签署知情同意书；排除HIV、肺结核、肝炎等传染性疾病患者，排除肝、肾、心功能不全者及精神病患者中不能配合者。以80例正常健康人群为对照，采集静脉血样，其来源于福建省二人民医院健康体检中心参加体检且身体健康无重大疾病者，男40例，女40例，平均年龄（29.33±2.41）岁。两组在性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 主要仪器和试剂 多功能酶标仪Infinite M200 F200（奥地利TECAN）；流式细胞分析仪EPICS XL（美国Coulter）；超低温冰箱Premium Range（美国NBS）；超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）；生化培养箱SHP-250（上海精宏）；台式离心机（美国EPPENDORF）；可调式移液器（美国EPPENDORF）。
淋巴细胞基因组DNA抽提试剂盒（美国Omega公司）；整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）；单克隆抗体（美国BD公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 外周血T淋巴细胞亚群检测 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于肝素抗凝管中。取肝素抗凝血100 μL于小试管底部，分别加20 μL荧光标记的单克隆抗体，混匀，室温（18～25 ℃）孵育15 min。加红细胞溶解液1 ml，充分混匀。待红细胞完全溶解后上流式细胞仪检测。在波长488 nm时，计数30 000个细胞。记录分析直方图，数据经ELITE软件处理，以百分率报告。
1.3.2 淋巴细胞基因组DNA的提取 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于EDTA抗凝管中。供试血样淋巴细胞基因组DNA抽提采用SE Blood DNA Kit（美国Omega公司），按试剂盒说明进行，抽提的DNA保存于-20 ℃备用。
1.3.3 DNA含量测定及纯度鉴定 取抽提好的DNA溶于双蒸水中，于超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）上测量260/280 nm光密度值。保证供试样本A260/280比值均在1.7～1.9之间，浓度在50～100 μg/ml，以用于整体DNA甲基化水平的测定。对不符合要求的DNA样本重新进行抽提和定量。
1.3.4 淋巴细胞整体基因组甲基化水平测定 DNA整体甲基化水平采用整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）检测。该试剂盒采用抗原抗体结合的方法，将DNA固定到一个对DNA具有高亲和力的反应孔中，甲基化的DNA能够被5甲基胞嘧啶抗体识别，通过抗原抗体识别反应进行定量，甲基化的DNA与OD值的高低成正比。具体操作步骤按试剂盒说明书操作，DNA甲基化的程度采用如下公式计算：
甲基化%=OD（样本-空白对照）/2×OD（阳性对照-空白对照）
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，相关性分析采用多元回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 整体DNA甲基化水平检测结果 康复期强制戒毒人员淋巴细胞中基因组DNA甲基化百分率为（15.37±3.28）%，显著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.2 T淋巴细胞亚群检测结果 康复期强制戒毒人员CD3+、CD3++CD4+ 和CD3++CD4+/CD3++CD8+值均明显低于正常健康人群，差异具有统计学意义（P<0.05）；康复期强制戒毒人员CD3++CD8+与健康人相比虽有差异，但无统计学意义（P>0.05），见表1。 2.3 淋巴细胞基因组DNA甲基化水平与T淋巴细胞亚群的相关性 以基因组DNA甲基化水平为因变量进行多元线性回归分析发现，CD3+、CD3++CD4+与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平呈正相关（r=0.21，0.36，P<0.05）。CD3++CD8+、CD3++CD4+/CD3++CD8+与其无相关关系（P>0.05）。
3 讨论
本研究表明吸毒者总T细胞（CD3+）减少，CD3++CD4+细胞也显著降低，CD3++CD8+无显著变化，故CD3++CD4+/CD3++CD8+明显下降，说明毒品抑制吸毒者的正常免疫功能。毒品对人体细胞免疫的影响早有报道。早在1974年Brown等[3]就报道，海洛因成瘾者免疫功能缺陷，表现为淋巴细胞转化率显著降低。海洛因广泛抑制机体细胞免疫功能，使淋巴细胞增殖和活性受抑制[4-5]。同时还能引起T淋巴细胞对PHA刺激导致的分化能力下降，分泌IL-2、INF-γ、IL-4能力下降[6]。研究表明，吸毒者整体细胞免疫功能处于抑制状态，其机制可能是海洛因等药物毒性代谢产物抑制了T细胞的活性和增殖能力，也可能是长期滥用外源性阿片样物质引起机体下丘脑神经内分泌激素系统（阿片肽系统）退行性改变，使其对T细胞及其亚群的正常调节作用减退和消失导致细胞免疫功能受损[7]。
DNA甲基化是目前研究较为深入的一种表观遗传学调控机制。在近几年研究中发现，DNA甲基化在自身免疫性疾病中起着重要作用。DNA甲基化水平改变可以影响许多基因的表达，包括一些与黏附因子和细胞因子表达相关的基因，导致T细胞的自身反应性发生改变，从而与疾病发病密切相关。如在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）和系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）患者中，基因组普遍DNA甲基化水平都降低[8-9]。DNA的低甲基化可能通过引起患者的某些基因的异常表达，参与疾病的发生发展[10]。
本文研究结果表明，康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著低于正常人水平，说明毒品对人体淋巴细胞DNA有一定影响，其表观遗传修饰发生改变。同时发现淋巴细胞基因组DNA甲基化水平与CD3+和CD3++CD4+呈正相关，说明吸毒所导致的细胞免疫功能下降与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平存在关联。本研究揭示了康复期戒毒人员的甲基化水平状态，发现细胞免疫功能与淋巴细胞甲基化水平相关性，为今后从分子水平探索毒品对人体免疫病理损伤机制具有重要意义。
参考文献
[1]杨忠礼，李娟，王丽，等.静脉吸毒人群HIV感染者CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞水平定量研究与分析[J].中国艾滋病性病，2004，5（1）：10-12.
[2]李遇梅，李安生，陈志强.DNA甲基化与肿瘤及系统性红斑狼疮的关系[J].国外医学：皮肤性病学分册，2004，30（5）：294-296.
[3] Brown S M，Stimel B，Taub R N，et al.Immunological dysfunction in heroin addicts[J].Arch Intern Med，1974，134（6）：1001-1006.
[4] Carr D J，France C P.Immune alterations in morphine treated rhesus monkeys [J].Pharnmol Exp Ther，1993，267（11）：9-15.
[5] Bhargara H N，Thonas P T，Thorat S，et al.Efects of morphine tolerance and abstinence of cellular immune function[J]. Bra Res，1994，642（122）：1-10.
[6] Zaki N G，Osman A，Moustafa H，et al. Alterations of immune functions in heroin addicts [J].Egypt J Immuno1，2006，13（1）：153-171.
[7] Vallqo R，De Leon Casasola O，Benyamin R.Opioid therapy and immunoanppression：a review [J].Am J Ther，2004，11（5）：354-365.
[8] Swkigawa J，Okada M，Ogasavara H，et al.DNA methylation in systemic lupus erythematogus[J].Lupus，2003，12（2）：79-85.
[9] Riehardson B.Evidence for impaired T cell DNA methylation in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，1990，33（6）：1665-1673.
[10] Xu X Y，Wang M M，Xiao C S，et al.The study of DNA methylation in rheumatoid arthritis[J].ChinRheumatol，2006，10（8）：462-465.
（收稿日期：2013-08-20） （本文编辑：蔡元元）