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摘要[目的]应用固相萃取（SPE）及高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS-MS）分析技术，建立养殖水体中的18种磺胺类药物残留量测定方法。[方法]水样中的磺胺类药物通过HLB萃取小柱富集后，以C18反相柱为分析柱，0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相，采用HPLC-MS-MS进行定量分析。[结果]HPLC-MS-MS选择多反应监测（MRM）正离子模式测定，可同时对养殖水体中的18种磺胺类药物进行定性和定量。磺胺类药物的检出限均低于1.0 ng/mL，方法的平均回收率为70%～120%。[结论]该方法能够简便、快捷、有效地实现养殖水体中18种磺胺类药物残留的快速检测。
关键词固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；磺胺类药物；养殖用水
中图分类号S949文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0088-03
Abstract[Objective] Using solid phase extraction （SPE） and HPLCMSMS analysis technology，determination method for 18 kinds of sulfa drugs residues in aquaculture water was established.[Method] Sulfa drugs in water sample were enriched through HLB extraction column，with C18 reversedphase column as analytical column，0.1% formic acid aqueous solution and acetonitrile as mobile phase，using HPLCMSMS to conduct quantitative analysis.[Result] Applying HPLCMSMS selective reaction monitoring （SRM） positive ion mode to determine，at the same time qualitative and quantitative analysis of 18 kinds of SAs in aquaculture water was conducted.The detection limits of SAs were less than 1.0 ng/mL，the range of the average recovery was 70%-120%.[Conclusion] The method is simple，quick and effective to realize rapid detection of 18 kinds of sulfa drugs residues in aquaculture water.
Key wordsSolid phase extraction；HPLCMSMS；SAs；Aquaculture water
磺胺類药物（SAs）是一种广谱抗菌药，在水产养殖行业中可作为饲料添加剂，且在动物疾病治疗中也被广泛应用[1]。随着我国水产养殖业的快速发展，磺胺类药物的不合理使用，导致其通过动物粪便排入养殖水体的浓度增加。受污染的养殖水体汇入附近河流的地表水体后，会产生严重的环境污染及生态破坏问题[2]。因此，有必要建立养殖水体中磺胺类药物的检测方法，便于了解养殖水体及河流地表水体的污染状况，及时采取有效的措施进行控制，降低环境的污染和生态的破坏程度。
目前，针对水体中的磺胺类药物残留的检测方法有高效液相色谱法、酶联免疫法等[3-4]。酶联免疫法作为筛选方法得到了广泛应用，但容易出现假阳性；液相色谱法灵敏度低、选择性差。近年来，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS-MS）技术因其灵敏度高、特异性强而被广泛用于极性药物的分析[5-6]。笔者利用固相萃取（SPE）富集净化技术，结合HPLC-MS-MS分析技术，建立养殖水体中的18种磺胺类药物残留量的测定方法，以实现养殖水体中药物残留的快速检测。
1材料与方法
1.1材料主要仪器设备：高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪（Agilent 6410B）；固相萃取装置；氮吹仪；HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。
18种磺胺类药物标准品：磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺吡啶（SMPD）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺恶唑（Sulfamoxol）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（Sulfadoxine）、磺胺甲恶唑（磺胺甲基异恶唑，SMZ）、磺胺异恶唑（磺胺二甲基异恶唑，SIZ）、磺胺喹恶啉（SQX）、苯甲酰磺胺（Sulfabenzamide）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺苯吡唑（SPP）。
主要试剂：甲醇；超纯水；甲酸；乙腈；乙二胺四乙酸（EDTA）；硫酸。
1.2方法
1.2.1样品前处理。采集1 L水样保存在棕色瓶中。水样经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤后，加入2 g EDTA，用0.2 mol/L硫酸调节pH为3，待富集净化。
HLB固相萃取小柱分别用6 mL甲醇和6 mL水活化。取500 mL处理过的水样，以6 mL/min的速度过柱，然后用10 mL超纯水淋洗，氮吹去除水分，再用6 mL甲醇洗脱，收集流出液。流出液在45 ℃下氮吹吹干，以1.0 mL初始流动相定容，过0.22 μm滤膜后上机。
1.2.2仪器分析条件。
1.2.2.1色谱条件。色谱柱：Agilent Ecplipe Plus C18柱（100.0 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，流速为0.5 mL/min，梯度洗脱程序见表1；进样量为10 μL。 1.2.2.2质谱条件。电离模式：ESI（+），扫描模式：多反应监测 （MRM）；离子源温度100 ℃；毛细管电压4 000 V；洗脱溶剂温度350 ℃；雾化气流速 10 L/min，压力344.74 kPa。其他质谱条件見表2。
2结果与分析
2.1HPLC-MS-MS条件的优化
2.1.1色谱条件。将常用的几种试剂作为流动相的有机相进行试验，从基线稳定情况及分离效果上看，使用0.1%甲酸水溶液及乙腈作为流动相优于其他试剂。
2.1.2质谱条件。根据目标化合物的分子结构及物理化学性质，选择ESI为离子源，在正离子电离模式下，用流动注射进样方式对磺胺类药物的母离子进行扫描，得到其准分子离子峰，以适当的碰撞能量对准分子离子进行子离子扫射，选择响应值最强的子离子作为定量离子，选择响应值相对较强的离子作为定性离子。选择MRM扫描模式对母离子与子离子进行碎裂电压及碰撞能量的优化，优化后的参数见表2。
2.2固相萃取条件的优化在淋洗HLB固相萃取小柱去除杂质试验时，结果发现采用6 mL甲醇和6 mL水活化既能保证回收率又能得到较为满意的除杂效果。因此，得到优化后的萃取条件为取500 mL处理过的水样，以6 mL/min的速度过柱，再用10 mL超纯水淋洗，挤干氮吹去除水分，然后用6 mL甲醇洗脱，收集流出液。流出液在45 ℃下氮吹吹干，以1.0 mL初始流动相定容，过0.22 μm滤膜后上机。
2.3定量及方法的精密度与准确度养殖水体中含有的溶解性有机物浓度较高，可能导致HPLC-MS-MS信号的强弱变化不定，从而影响定量结果的准确性和可靠性。
以磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）等18种磺胺类药物标准品进行定量内标，配制2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列工作标准溶液，绘制标准工作曲线。以待测物与内标的峰面积比为纵坐标，待测物的质量浓度为横坐标进行线性回归，结果表明，18种磺胺类药物线性关系良好，相关系数均大于0.99。当信噪比S/N大于3的情况下，方法检出限低于1 ng/mL；S/N大于10的情况下，方法定量限低于3 ng/mL。图1为磺胺醋酰（SA）的标准工作曲线。
2.4加标回收率试验以待测的样品做添加回收试验，空白样品为对照。在养殖水样中添加5、20 μg/L的磺胺类药物混合标准溶液，每个浓度5个平行样品，测定18种磺胺类药物的回收率（n=5）和相对标准偏差（RSD），其结果如表3所示。
由表3可知，18种磺胺类药物的平均加标回收率为70%～120%，相对标准偏差（RSD）为0.4%～5.1%。
2.5水样检测试验为了检验方法的准确度，采取了2个养殖水体的水样进行分析，检测结果如表4所示。
由表4可知，水样1的SA、Sulfamoxol、Sulfabenzamide 3种未检出，其余的浓度低于检出限；水样2的SD、Sulfamoxol、SMZ、Sulfabenzamide未检出，其余的浓度低于检出限。
3结论
该试验建立了养殖水体中18种磺胺类药物残留量的HPLC-MS-MS测定方法。磺胺类药物的检出限（RSN=3）低于1 ng/mL，定量限为（RSN=10）3 ng/mL。方法的平均回收率70%～120%，相对标准偏差（RSD）为0.4%～5.1%。该方法能够简便、准确、快速地测定出养殖水体中的18种磺胺类药物残留量，有效提高检测分析中的工作效率，降低水产养殖行业因药物残留问题带来的风险，保障我国水产养殖行业的稳定健康持续发展。
参考文献
[1] 刘佳佳，佘永新，刘洪斌，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中24种磺胺类药物残留[J].分析试验室，2011，30（2）：9-13.
[2] 唐才明，黄秋鑫，余以义，等.高效液相色谱-串联质谱法对水环境中微量磺胺、大环内酯类抗生素、甲氧苄胺嘧啶与氯霉素的检测[J].分析测试学报，2009，28（8）：909-913.
[3] 孙伟红，冷凯良，王志杰，等.HPLC-MS/MS内标法同时测定水产品中18种磺胺类药物残留[J].食品科学，2009，30（24）：294-298.
[4] 朱世超，钱卓真，吴成业.水产品中7种大环内酯类抗生素残留量的HPLC-MS/MS测定法[J].南方水产科学，2012，8（1）：54-60.
[5] 赵鹏，刘鑫，孙希彦，等.HPLC-MS/MS法测定水产品中14种磺胺类药物 [J].食品研究与开发，2013，34（23）：80-83.
[6] 郭时金.水产品中磺胺类药物残留检测方法的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2011（9）：29-30.
关键词固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；磺胺类药物；养殖用水
中图分类号S949文献标识码A文章编号0517-6611（2017）11-0088-03
Abstract[Objective] Using solid phase extraction （SPE） and HPLCMSMS analysis technology，determination method for 18 kinds of sulfa drugs residues in aquaculture water was established.[Method] Sulfa drugs in water sample were enriched through HLB extraction column，with C18 reversedphase column as analytical column，0.1% formic acid aqueous solution and acetonitrile as mobile phase，using HPLCMSMS to conduct quantitative analysis.[Result] Applying HPLCMSMS selective reaction monitoring （SRM） positive ion mode to determine，at the same time qualitative and quantitative analysis of 18 kinds of SAs in aquaculture water was conducted.The detection limits of SAs were less than 1.0 ng/mL，the range of the average recovery was 70%-120%.[Conclusion] The method is simple，quick and effective to realize rapid detection of 18 kinds of sulfa drugs residues in aquaculture water.
Key wordsSolid phase extraction；HPLCMSMS；SAs；Aquaculture water
磺胺類药物（SAs）是一种广谱抗菌药，在水产养殖行业中可作为饲料添加剂，且在动物疾病治疗中也被广泛应用[1]。随着我国水产养殖业的快速发展，磺胺类药物的不合理使用，导致其通过动物粪便排入养殖水体的浓度增加。受污染的养殖水体汇入附近河流的地表水体后，会产生严重的环境污染及生态破坏问题[2]。因此，有必要建立养殖水体中磺胺类药物的检测方法，便于了解养殖水体及河流地表水体的污染状况，及时采取有效的措施进行控制，降低环境的污染和生态的破坏程度。
目前，针对水体中的磺胺类药物残留的检测方法有高效液相色谱法、酶联免疫法等[3-4]。酶联免疫法作为筛选方法得到了广泛应用，但容易出现假阳性；液相色谱法灵敏度低、选择性差。近年来，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS-MS）技术因其灵敏度高、特异性强而被广泛用于极性药物的分析[5-6]。笔者利用固相萃取（SPE）富集净化技术，结合HPLC-MS-MS分析技术，建立养殖水体中的18种磺胺类药物残留量的测定方法，以实现养殖水体中药物残留的快速检测。
1材料与方法
1.1材料主要仪器设备：高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪（Agilent 6410B）；固相萃取装置；氮吹仪；HLB固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。
18种磺胺类药物标准品：磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺吡啶（SMPD）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺恶唑（Sulfamoxol）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（Sulfadoxine）、磺胺甲恶唑（磺胺甲基异恶唑，SMZ）、磺胺异恶唑（磺胺二甲基异恶唑，SIZ）、磺胺喹恶啉（SQX）、苯甲酰磺胺（Sulfabenzamide）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺苯吡唑（SPP）。
主要试剂：甲醇；超纯水；甲酸；乙腈；乙二胺四乙酸（EDTA）；硫酸。
1.2方法
1.2.1样品前处理。采集1 L水样保存在棕色瓶中。水样经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤后，加入2 g EDTA，用0.2 mol/L硫酸调节pH为3，待富集净化。
HLB固相萃取小柱分别用6 mL甲醇和6 mL水活化。取500 mL处理过的水样，以6 mL/min的速度过柱，然后用10 mL超纯水淋洗，氮吹去除水分，再用6 mL甲醇洗脱，收集流出液。流出液在45 ℃下氮吹吹干，以1.0 mL初始流动相定容，过0.22 μm滤膜后上机。
1.2.2仪器分析条件。
1.2.2.1色谱条件。色谱柱：Agilent Ecplipe Plus C18柱（100.0 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，流速为0.5 mL/min，梯度洗脱程序见表1；进样量为10 μL。 1.2.2.2质谱条件。电离模式：ESI（+），扫描模式：多反应监测 （MRM）；离子源温度100 ℃；毛细管电压4 000 V；洗脱溶剂温度350 ℃；雾化气流速 10 L/min，压力344.74 kPa。其他质谱条件見表2。
2结果与分析
2.1HPLC-MS-MS条件的优化
2.1.1色谱条件。将常用的几种试剂作为流动相的有机相进行试验，从基线稳定情况及分离效果上看，使用0.1%甲酸水溶液及乙腈作为流动相优于其他试剂。
2.1.2质谱条件。根据目标化合物的分子结构及物理化学性质，选择ESI为离子源，在正离子电离模式下，用流动注射进样方式对磺胺类药物的母离子进行扫描，得到其准分子离子峰，以适当的碰撞能量对准分子离子进行子离子扫射，选择响应值最强的子离子作为定量离子，选择响应值相对较强的离子作为定性离子。选择MRM扫描模式对母离子与子离子进行碎裂电压及碰撞能量的优化，优化后的参数见表2。
2.2固相萃取条件的优化在淋洗HLB固相萃取小柱去除杂质试验时，结果发现采用6 mL甲醇和6 mL水活化既能保证回收率又能得到较为满意的除杂效果。因此，得到优化后的萃取条件为取500 mL处理过的水样，以6 mL/min的速度过柱，再用10 mL超纯水淋洗，挤干氮吹去除水分，然后用6 mL甲醇洗脱，收集流出液。流出液在45 ℃下氮吹吹干，以1.0 mL初始流动相定容，过0.22 μm滤膜后上机。
2.3定量及方法的精密度与准确度养殖水体中含有的溶解性有机物浓度较高，可能导致HPLC-MS-MS信号的强弱变化不定，从而影响定量结果的准确性和可靠性。
以磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）等18种磺胺类药物标准品进行定量内标，配制2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列工作标准溶液，绘制标准工作曲线。以待测物与内标的峰面积比为纵坐标，待测物的质量浓度为横坐标进行线性回归，结果表明，18种磺胺类药物线性关系良好，相关系数均大于0.99。当信噪比S/N大于3的情况下，方法检出限低于1 ng/mL；S/N大于10的情况下，方法定量限低于3 ng/mL。图1为磺胺醋酰（SA）的标准工作曲线。
2.4加标回收率试验以待测的样品做添加回收试验，空白样品为对照。在养殖水样中添加5、20 μg/L的磺胺类药物混合标准溶液，每个浓度5个平行样品，测定18种磺胺类药物的回收率（n=5）和相对标准偏差（RSD），其结果如表3所示。
由表3可知，18种磺胺类药物的平均加标回收率为70%～120%，相对标准偏差（RSD）为0.4%～5.1%。
2.5水样检测试验为了检验方法的准确度，采取了2个养殖水体的水样进行分析，检测结果如表4所示。
由表4可知，水样1的SA、Sulfamoxol、Sulfabenzamide 3种未检出，其余的浓度低于检出限；水样2的SD、Sulfamoxol、SMZ、Sulfabenzamide未检出，其余的浓度低于检出限。
3结论
该试验建立了养殖水体中18种磺胺类药物残留量的HPLC-MS-MS测定方法。磺胺类药物的检出限（RSN=3）低于1 ng/mL，定量限为（RSN=10）3 ng/mL。方法的平均回收率70%～120%，相对标准偏差（RSD）为0.4%～5.1%。该方法能够简便、准确、快速地测定出养殖水体中的18种磺胺类药物残留量，有效提高检测分析中的工作效率，降低水产养殖行业因药物残留问题带来的风险，保障我国水产养殖行业的稳定健康持续发展。
参考文献
[1] 刘佳佳，佘永新，刘洪斌，等.高效液相色谱-串联质谱法同时测定动物源性食品中24种磺胺类药物残留[J].分析试验室，2011，30（2）：9-13.
[2] 唐才明，黄秋鑫，余以义，等.高效液相色谱-串联质谱法对水环境中微量磺胺、大环内酯类抗生素、甲氧苄胺嘧啶与氯霉素的检测[J].分析测试学报，2009，28（8）：909-913.
[3] 孙伟红，冷凯良，王志杰，等.HPLC-MS/MS内标法同时测定水产品中18种磺胺类药物残留[J].食品科学，2009，30（24）：294-298.
[4] 朱世超，钱卓真，吴成业.水产品中7种大环内酯类抗生素残留量的HPLC-MS/MS测定法[J].南方水产科学，2012，8（1）：54-60.
[5] 赵鹏，刘鑫，孙希彦，等.HPLC-MS/MS法测定水产品中14种磺胺类药物 [J].食品研究与开发，2013，34（23）：80-83.
[6] 郭时金.水产品中磺胺类药物残留检测方法的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2011（9）：29-30.