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[摘要] 目的 探討冬凌草甲素（Ori）对大鼠脑出血（ICH）后继发性脑损伤的神经保护作用及其机制。
方法 将大鼠随机分为假手术组、ICH组、溶剂组以及Ori低、中、高剂量组，其中后5组大鼠采用右侧基底核区注射胶原酶的方法制备ICH模型。Ori低、中、高剂量组分别给予5、15、25 mg/kg的Ori腹腔注射，溶剂组腹腔注射等体积的生理盐水。手术或药物处理72 h后进行神经行为学检测，之后处死大鼠提取脑组织，通过测量脑含水量评价脑水肿情况，采用Fluoro Jade-C染色检测神经元损伤情况，采用Western blot检测核因子κB（NF-κB）、红系衍生的核转录相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，采用酶联免疫吸附试验检测促炎因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的表达，采用免疫荧光染色检测Nrf2和HO-1的表达。
结果 Ori中、高剂量组神经行为学评分、变性神经元的数量、脑含水量均较ICH组和溶剂组明显下降。ICH组和溶剂组大鼠脑组织NF-κB、Nrf2和HO-1的蛋白表达均较假手术组升高，经中、高剂量Ori处理后NF-κB表达降低，而Nrf2和HO-1表达进一步升高，差异均有显著性（F=15.17～61.18，P<0.05）。经中剂量Ori处理后ICH大鼠脑内TNF-α、IL-1β和IL-6的表达下降（F=24.53～69.26，P<0.05）。
结论 Ori可减轻ICH后神经元的损伤和脑水肿程度，促进神经功能的恢复，具有神经保护作用，其机制可能是通过促进Nrf2/HO-1抗氧化信号通路和抑制NF-κB炎症通路来减轻ICH后脑损伤。
[关键词] 冬凌草素;脑出血;氧化性应激;炎症;神经保护;大鼠
[中图分类号] R743.3
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2020）03-0275-06
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.116
[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200611.1338.002.html;2020-06-11 13：42
PROTECTIVE MECHANISM OF ORIDONIN IN SECONDARY BRAIN INJURY AFTER INTRACEREBRAL HEMORRHAGE IN RATS
＼ XIONG Jing， LU Donglin， WANG Zixuan， XING Ang
＼ （Departments of Geriatrics Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）
[ABSTRACT]＼ Objective＼ To investigate the neuroprotective effect and mechanism of action of oridonin （Ori） in secondary brain injury after intracerebral hemorrhage （ICH） in rats.
＼ Methods＼ All rats were randomly divided into sham group， ICH group， solvent group （intraperitoneal injection of an equal volume of normal saline to Ori）， low-dose Ori group （intraperitoneal injection of Ori at 5 mg/kg）， medium-dose Ori group （intraperitoneal injection of Ori at 15 mg/kg）， and high-dose Ori group （intraperitoneal injection of Ori at 25 mg/kg）. A rat model of ICH was established by injection of collagenase into the right basal ganglia in the last five groups. The neurobehavioral performance of the rats was observed 72 h after treatment. Then the rats were sacrificed to obtain the brain tissue; brain water content was determined to evaluate brain edema， and Fluoro-Jade C staining was used to detect neuronal damage. Western blot was applied to measure the expression of nuclear factor kappa B （NF-κB）， nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， and heme oxygenase-1 （HO-1）. Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to determine the expression of the pro-inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-6 （IL-6）. Immunofluorescent staining was used to measure the expression of Nrf2 and HO-1. ＼ Results＼ The medium-dose and high-dose Ori groups had significantly reduced neurobehavioral score， number of degenerative neurons， and brain water content than the ICH group and solvent group. Compared with the sham group， the expression of NF-κB， Nrf2， and HO-1 in the brain tissue was significantly increased in the ICH group and solvent group; either medium-dose or high-dose Ori significantly decreased the up-regulated expression of NF-κB， and further significantly increased the expression of Nrf2 and HO-1 （F=15.17-61.18，P<0.05）. Medium-dose Ori significantly reduced the expression of TNF-α， IL-1β， and IL-6 in the brain tissue of the ICH rats （F=24.53-69.26，P<0.05）.
＼ Conclusion＼ Ori can alleviate neuronal damage and cerebral edema following ICH， and contribute to recovery of neurological function and exert a neuroprotective effect， possibly through promoting the Nrf2/HO-1 antioxidant pathway and inhibiting the NF-κB inflammatory pathway.
[KEY WORDS]＼ RUBESCENSINE; cerebral hemorrhage; oxidative stress; inflammation; neuroprotection; rats
脑出血（ICH）是第二常见的脑卒中类型，致死率和致残率高[1-2]。迄今为止，ICH治疗干预的重点是早期预防血肿扩张，包括止血和抗高血压疗法，但并不能够有效减少血肿的扩张以及改善预后[3]。ICH分为原发和继发性损伤，脑血管外渗的血液在实质中形成血肿，使局部压力增大，导致原发性脑损伤，随后血肿降解又会引起细胞损伤、氧化应激和炎症反应，进而出现细胞死亡、脑水肿和神经行为缺陷等，导致继发性损伤[4]。越来越多研究表明，血肿形成后炎症反应和氧化应激与ICH诱发的继发性脑损伤和神经功能障碍密切相关，针对治疗脑血肿和ICH相关药物研发一直以来都是研究的热点[5-6]。冬凌草甲素（Ori）属于二萜类化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学作用[7-8]。有研究表明，Ori可减轻脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞的炎症反应[9]。Ori也可直接抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体以及核因子κB（NF-κB）炎癥通路，减轻卡拉胶诱导的小鼠胸膜炎[10]。此外，Ori还可以激活Kelch样环氧氯丙烷相关联蛋白1（KEAP-1）/核转录相关因子2（Nrf2）信号通路的表达，从而发挥抗氧化的作用[10]。但是，Ori在ICH中的作用及机制尚不明确，故本研究对大鼠ICH模型进行Ori干预，观察不同剂量Ori对ICH大鼠神经功能、神经元变性、NF-κB及Nrf2/血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路表达水平的影响，以探讨Ori在ICH中的作用及其可能的机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠150只，体质量250～280 g，购自北京维通利华实验动物公司。每笼6只群养于青岛大学医学部动物中心大鼠饲养室。饲养条件：环境清洁，温度及湿度舒适，12 h昼夜交替，自由饮水和摄入食物。该动物实验获青岛大学附属医院医学伦理委员会同意。
1.1.2 药品和试剂 Ori购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（货号：28957-04-2）;胶原酶和Fluoro Jade-C（FJC）染料购自美国Sigma公司;肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;NF-κB抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;Nrf2、HO-1多克隆抗体购自美国Affinity公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及处理 将大鼠随机分为假手术组（Sham组，A组）、ICH组（B组）、溶剂组（ICH+Veh组，C组）、Ori低剂量组（ICH+LOri组，D组）、Ori中剂量组（ICH+MOri组，E组）、Ori高剂量组（ICH+HOri组，F组）。实验大鼠在实验前8 h禁止饮食。除Sham组外，其余5组大鼠使用胶原酶诱导建立ICH模型[11]。大鼠麻醉后固定在脑立体定向仪上，以前囟为原点，向右3.5 mm、向前0.2 mm作为穿刺点，进针深度5.5 mm，用10 μL微量注射泵以1 μL/min注入1 μL胶原酶Ⅳ（3 U），留针10 min，缓慢退针，用骨蜡封闭其骨孔，消毒缝合切口，将大鼠置于笼中观察，待其麻醉复苏。待大鼠麻醉清醒，Ori低、中、高剂量组于术后2、24和48 h分别给予Ori 5、15、25 mg/kg的腹腔注射（由于Ori可透过血-脑脊液屏障，故本次药物注射的方式采用腹腔注射），ICH+Veh组腹腔注射等体积的生理盐水。Sham组操作与ICH组相同，但不注射胶原酶。150只大鼠进行手术，其中114只手术成功，36只手术失败或死亡。 1.2.2 神经行为学检测 手术或药物处理72 h后，每组取6只大鼠，使用改良神经功能缺损程度评分（mNSS）对大鼠的神经功能进行评定，包括提尾试验、行走试验、感觉试验、平衡木试验等。对这些项目进行综合评分，总分0～18分，评分越高，神经系统损害就越严重。
1.2.3 脑含水量测定 神经功能评定后处死大鼠取全脑，去除嗅球和脑干，将其分为左脑、右脑、小脑等3部分，迅速称湿质量。然后将脑组织放到烘箱，在100 ℃温度下烘干24 h，称干质量。脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。
1.2.4 Western blot检测NF-κB、Nrf2和HO-1蛋白表达 在手术和药物处理72 h后，每组取6只大鼠，提取其脑组织置于-80 ℃冰箱里冷冻保存。取出冷冻的脑组织放在冰板上面，用刀片将ICH区域的脑组织分成5等份，取血肿周围组织提取蛋白质（后续实验取样的脑组织均为血肿周围组织），用BCA法测量蛋白质的浓度，SDS-PAGE凝胶跑胶，每孔上样10 μg蛋白，电泳（80 V，30 min，再120 V跑到底），转PVDF膜（250 mA，1.5 h），应用体积分数0.05牛奶封闭1.5 h，加一抗4 ℃过夜，加二抗室温1.5 h，显影。
1.2.5 ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6表达 取Sham组、ICH组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织，采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。在酶标板中加100 μL标准品工作液或样本，37 ℃孵育90 min，弃液，加100 μL生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次;每孔加入100 μL HRP酶结合物工作液，37 ℃孵育30 min，弃液，洗板5次;每孔加90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min，每孔加50 μL终止液，立即读取450 nm波长处的吸光度值。
1.2.6 免疫荧光染色检测Nrf2、HO-1的表达 取Sham组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织进行免疫荧光染色。首先用40 g/L的多聚甲醛灌注取脑，蔗糖梯度沉糖后，进行冷冻切片;固定、通透、封闭切片，加Nrf2、HO-1一抗4 ℃过夜，加荧光二抗室温1 h;用含DAPI的封片剂封片，萤光显微镜下观察阳性细胞数。
1.2.7 FJC染色检测神经元损伤情况 取Sham组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织进行FJC染色。脑组织冷冻切片室温复温30 min，用双蒸水浸泡2 min，50 ℃烘干30 min，置于含10 g/L NaOH的体积分数0.80乙醇中浸泡5 min，置于体积分数0.70乙醇中浸泡2 min，以双蒸水浸洗2 min;将切片放入0.6 g/L高锰酸钾溶液中反应10 min，用蒸馏水浸洗2 min;将切片放入FJC溶液中反应20 min，以双蒸水浸洗3次，每次2 min;再置50 ℃的烘箱中烘干，二甲苯透明2 min;最后用DPX封片液封片，在荧光显微镜下计数FJC阳性细胞并拍照。
1.3 统计学分析
应用Graph Pad Prism 5.0软件进行统计学分析，计量数据以±s形式表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组比较，然后用Tukey法进行组间两两比较。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 Ori对ICH大鼠神经功能评分的影响
手术或药物处理72 h后，Sham组、ICH组、ICH+Veh组、ICH±LOri组、ICH+MOri组和ICH+HOri组的mNSS评分分别为0.67±0.58、10.33±1.53、10.00±1.73、8.00±1.00、6.67±0.58和6.33±0.58（n=6）。与Sham组比较，ICH组和
ICH+Veh组的mNSS评分明显升高（F=30.33，
q=15.140、14.620，P<0.05），而ICH组与ICH+Veh组比较差异无显著性（P>0.05）;与ICH组和ICH+Veh组相比，Ori处理各组mNSS评分均有下降，其中ICH+MOri组、ICH+HOri组的差异具有显著性（q=5.222～5.745，P<0.05），而ICH+MOri组和ICH+HOri组mNSS评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 各组脑组织含水量比较
各组大鼠左半脑和小脑含水量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。ICH后大鼠右半脑含水量显著增加，经过中、高剂量Ori处理后，大鼠右半脑含水量显著降低（F=21.76，q=6.924～8.527，P<0.05），而ICH+MOri组和ICH+HOri组间脑水肿减轻的程度差异无统计学意义（P>0.05），ICH组与ICH+Veh组间相比较差异也无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.3 Ori对ICH大鼠脑组织中NF-κB、Nrf2以及HO-1表达的影响
ICH组和ICH+Veh组大鼠脑组织中NF-κB、Nrf2和HO-1的蛋白表达均较Sham组升高，经中、高剂量Ori处理后NF-κB表达降低，而Nrf2和HO-1的表达则进一步升高，差异均有统计学意义（F=15.17～61.18，q=6.303～10.110，P<0.05）;ICH+MOri组和ICH+HOri组间各指標比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1、表2。
2.4 Ori对ICH大鼠脑组织炎症因子表达的影响
综合上述神经行为学、脑含水量以及Western blot的检测结果，可知Ori在中、高剂量时均对ICH大鼠有神经保护作用，并且两组治疗效果无明显差别，因此Ori处理各组中仅选择ICH+MOri组进行后续实验。 ICH后脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著升高，在Ori处理后各指标的表达明显下降（F=24.53～69.26，q=6.208～17.120，P<0.05）。见表3。
2.5 各组脑组织中Nrf2和HO-1的荧光表达比较
ICH后抗氧化蛋白Nrf2及其下游蛋白HO-1的表达均增加，经中剂量Ori处理后，ICH+MOri组Nrf2和HO-1的表达较ICH+Veh组明显增高，差异均具有统计学意义（F=347.30、61.14，q=4.780～18.880，P<0.05）。见图2、表4。
2.6 各组神经元损伤情况比较
与Sham组相比，ICH+Veh组血肿周围绿色荧光的数量明显增多（F=97.99，q=19.970，P<0.05），而ICH+MOri组绿色荧光的数量较ICH+Veh组减少（q=13.180，P<0.05）。见图3、表4。
3 讨论
ICH早期致死率、致残率都很高，目前还没有理想的治疗方法[12-13]。越来越多的证据表明，氧化应激和炎症在ICH后继发性脑损伤中发挥着重要作用[14-16]，这种继发过程会导致ICH后病人的神经功能恶化[17]。本文的研究结果显示，ICH+MOri组和ICH+HOri组大鼠的mNSS评分、FJC阳性神经元数量以及促炎因子表达均显著下降，表明15和25 mg/kg的Ori均能够改善ICH后早期脑损伤和神经功能缺陷，并且15 mg/kg为理想剂量。
小胶质细胞介导的炎症损伤在ICH中起至关重要的作用用[18-19]。ICH发生后，小胶质细胞中的
NF-kB會被激活，进而使促炎因子的释放增加，导致
早期脑损伤用[20]，而这些促炎因子又作为NF-κB的激活剂，正反馈促进NF-κB的转录，进而加重炎症反应[21]。NF-κB作为一个关键的核转录因子，一直被公认是炎症反应的关键调节器[22]，抑制NF-κB的活性可以减轻神经功能损伤[23]。已有多项研究表明，Ori在抗肿瘤、促凋亡、抗炎、抗氧化、神经调节等方面有着十分重要的作用[14-25]，但其在ICH中的作用尚未见报道。ZHAO等[26]的研究结果显示，Ori通过调节Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号通路抑制促炎因子的表达，在小鼠急性肺损伤中起保护作用。有研究表明，Ori能够抑制NF-κB通路和Aβ1-42诱导的神经炎症[27]。本研究也证实了Ori的抗炎作用，在大鼠ICH后，15 mg/kg的Ori能够抑制NF-κB的表达和促炎因子的释放，减轻ICH后脑内的炎症反应。
此外，氧化应激是ICH后继发性脑损伤的重要原因[28]，Nrf2作为氧化应激反应中的关键转录因子和主要调节剂，在ICH后其表达逐渐增加，并诱导抗氧化基因的表达，在保护脑组织免受ICH后的氧化损伤中起重要作用[29]。研究已表明，Ori还可通过抑制NADPH氧化酶，促进KEAP-1与Nrf2解离，这样就会使Nrf2进入细胞核中转录并激活下游
蛋白HO-1，在疾病中发挥抗氧化作用[10]。ZENG等[30]研究表明，异黄体生成素可以加快激活Nrf2介导的抗氧化信号通路从而减少对实验性ICH后的早期脑损伤。这与本研究结果类似，提示Ori可能通过促进Nrf2/HO-1抗氧化作用，减轻ICH大鼠的早期脑损伤，起到神经保护作用。
综上所述，Ori对ICH模型大鼠早期脑损伤具有一定的保护作用，其机制可能为Ori通过促进Nrf2/HO-1抗氧化作用以及抑制NF-κB介导的炎症通路，减少氧化应激和炎症细胞浸润，从而在ICH早期脑损伤中起到神经保护作用。
[参考文献]
[1]MORGENSTERN L B， HEMPHILL I J， ANDERSON C， et al. Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association[J]. Stroke， 2010，41（9）：2108-2129.
[2]STEINER T， AL-SHAHI SALMAN R， BEER R， et al. European stroke organisation （ESO） guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage[J]. International Journal of Stroke： Official Journal of the International Stroke Society， 2014，9（7）：840-855.
[3]LEI Chunyan， CHEN Tao， CHEN Chun， et al. Pre-intracerebral hemorrhage and in-hospital statin use in intracerebral hemorrhage： a systematic review and meta-analysis[J]. World Neurosurgery， 2018，111：47-54.
[4]RICHARD F K， ZHOU N N， XIANG J M， et al. Vascular disruption and blood-brain barrier dysfunction in intracerebral hemorrhage[J]. Fluids and Barriers of the CNS， 2014，11（1）：18. [5]WANG Jian. Preclinical and clinical research on inflammation after intracerebral hemorrhage[J]. Progress in Neurobiology， 2010，92（4）：463-477.
[6]CHEN Sheng， YANG Qingwu， CHEN Gang， et al. An update on inflammation in the acute phase of intracerebral he-
morrhage[J]. Translational Stroke Research， 2015，6（1）：4-8.
[7]LUO H， VONG C T， CHEN H B， et al. Naturally occurring anti-cancer compounds： shining from Chinese herbal medicine[J]. Chinese Medicine， 2019，14（1）：48.
[8]LI Dahong， HAN Tong， LISO Jie， et al. Oridonin， a promi-
sing ent-Kaurane diterpenoid lead compound[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（9）：1395.
[9]XU Yan， XUE Yang， WANG Ying， et al. Multiple-modulation effects of Oridonin on the production of proinflammatory cytokines and neurotrophic factors in LPS-activated microglia[J]. International Immunopharmacology， 2009，9（3）：360-365.
[10]YANG Huahong， HUANG Jingbo， GAO Yanli， et al. Oridonin attenuates carrageenan-induced pleurisy via activation of the KEAP-1/Nrf2 pathway and inhibition of the TXNIP/NLRP3 and NF-κB pathway in mice[J]. Inflammopharmacology， 2020，28（2）：513-523.
[11]CHEN Chunli， ZHOU Fang， ZENG Liuwang， et al. Methy-
lene blue offers neuroprotection after intracerebral hemorrhage in rats through the PI3K/Akt/GSK3β signaling pathway[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019，234（4）：5304-5318.
[12]KEEP R F， HUA Y， XI G. Intracerebral haemorrhage： mechanisms of injury and therapeutic targets[J]. Lancet Neurol， 2012，11（8）：720-731.
[13]VANASCH C J， LUITSE M J， RINKEL G J， et al. Incidence， case fatality， and functional outcome of intracerebral haemorrhage over time， according to age， sex， and ethnic origin： a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Neurol， 2010，9（2）：167-176.
[14]白威，楊薛康，杨国栋. 钠氢交换蛋白1抑制剂对脓毒症大鼠心脏损伤保护作用的实验研究[J]. 陕西医学杂志， 2015，44（6）：643-645.
[15]XI G H， KEEP R F， HOFF J T. Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage[J]. The Lancet Neurology， 2006，5（1）：53-63.
[16]DUAN X， WEN Z， SHEN H， et al. Intracerebral hemorrhage， oxidative stress， and antioxidant therapy[J]. Oxid Med Cell Longev， 2016，2016：1203285.
[17]WANG J， DORE S. Inflammation after intracerebral he-
morrhage[J]. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism： Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism， 2007，27（5）：894-908. [18]ZHAO Yang， YU Anyong， LIU Yongping， et al. Regulatory T cells inhibit microglia activation and protect against inflammatory injury in intracerebral hemorrhage[J]. International Immunopharmacology， 2014，22（2）：522-525.
[19]HARRY G J， KRAFT A D. Microglia in the developing brain： a potential target with lifetime effects[J]. Neurotoxicology， 2012，33（2）：191-206.
[20]FRAKES A E， FERRAIUOLO L， HAIDET-PHILLIPS A M， et al. Microglia induce motor neuron death via the classical NF-kappaB pathway in amyotrophic lateral sclerosis[J]. Neuron， 2014，81（5）：1009-1023.
[21]HANG Chunhua， SHI Jixin， LI Jieshou， et al. Expressions of intestinal NF-κB， TNF-α， and IL-6 following traumatic brain injury in rats[J]. Journal of Surgical Research， 2005，123（2）：188-193.
[22]BAHAR M， MATTHEW C C. Nuclear factor-kappaB in autoimmunity： man and mouse[J]. Frontiers in Immunology， 2018，9：613.
[23]LIN Sen， YIN Qing， ZHONG Qi， et al. Heme activates TLR4-mediated inflammatory injury via MyD88/TRIF signaling pathway in intracerebral hemorrhage[J]. Journal of Neuroinflammation， 2012，9（1）：46.
[24]WANG Yanyan， LV Yanfang， LU Lu， et al. Oridonin inhibits mTOR signaling and the growth of lung cancer tumors[J]. Anti-Cancer Drugs， 2014，25（10）：1192-1200.
[25]XU J M， ERIC W， YE D， et al. Therapeutic potential of oridonin and its analogs： from anticancer and antiinflammation to neuroprotection[J]. Molecules， 2018，23（2）：474.
[26]ZHAO Gan， ZHANG Tao， MA Xiaofei， et al. Oridonin atte-
nuates the release of pro-inflammatory cytokines in lipopolysaccharide-induced RAW264.7 cells and acute lung injury[J]. Oncotarget， 2017，8（40）：68153-68164.
[27]WANG Sulei， YANG Hui， YU Linjie， et al. Oridonin attenuates Aβ1-42-induced neuroinflammation and inhibits NF-κB pathway[J]. PLoS One， 2014，9（8）：e104745.
[28]HU X， TAO C， GAN Q， et al. Oxidative stress in intracerebral hemorrhage： sources， mechanisms， and therapeutic targets[J]. Oxid Med Cell Longev， 2016，2016：3215391.
[29]SHANG H， YANG D， ZHANG W， et al. Time course of Keap1-Nrf2 pathway expression after experimental intracerebral haemorrhage： correlation with brain oedema and neurological deficit[J]. Free Radic Res， 2013，47（5）：368-375.
[30]ZENG Jun， CHEN Yizhao， DING Rui， et al. Isoliquiritigenin alleviates early brain injury after experimental intracerebral hemorrhage via suppressing ROS-and/or NF-κB-mediated NLRP3 inflammasome activation by promoting Nrf2 antioxidant pathway[J]. Journal of Neuroinflammation， 2017，14（1）：119.
（本文編辑 马伟平）
方法 将大鼠随机分为假手术组、ICH组、溶剂组以及Ori低、中、高剂量组，其中后5组大鼠采用右侧基底核区注射胶原酶的方法制备ICH模型。Ori低、中、高剂量组分别给予5、15、25 mg/kg的Ori腹腔注射，溶剂组腹腔注射等体积的生理盐水。手术或药物处理72 h后进行神经行为学检测，之后处死大鼠提取脑组织，通过测量脑含水量评价脑水肿情况，采用Fluoro Jade-C染色检测神经元损伤情况，采用Western blot检测核因子κB（NF-κB）、红系衍生的核转录相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，采用酶联免疫吸附试验检测促炎因子肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β和IL-6的表达，采用免疫荧光染色检测Nrf2和HO-1的表达。
结果 Ori中、高剂量组神经行为学评分、变性神经元的数量、脑含水量均较ICH组和溶剂组明显下降。ICH组和溶剂组大鼠脑组织NF-κB、Nrf2和HO-1的蛋白表达均较假手术组升高，经中、高剂量Ori处理后NF-κB表达降低，而Nrf2和HO-1表达进一步升高，差异均有显著性（F=15.17～61.18，P<0.05）。经中剂量Ori处理后ICH大鼠脑内TNF-α、IL-1β和IL-6的表达下降（F=24.53～69.26，P<0.05）。
结论 Ori可减轻ICH后神经元的损伤和脑水肿程度，促进神经功能的恢复，具有神经保护作用，其机制可能是通过促进Nrf2/HO-1抗氧化信号通路和抑制NF-κB炎症通路来减轻ICH后脑损伤。
[关键词] 冬凌草素;脑出血;氧化性应激;炎症;神经保护;大鼠
[中图分类号] R743.3
[文献标志码] A
[文章编号] 2096-5532（2020）03-0275-06
doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.116
[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]
[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200611.1338.002.html;2020-06-11 13：42
PROTECTIVE MECHANISM OF ORIDONIN IN SECONDARY BRAIN INJURY AFTER INTRACEREBRAL HEMORRHAGE IN RATS
＼ XIONG Jing， LU Donglin， WANG Zixuan， XING Ang
＼ （Departments of Geriatrics Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）
[ABSTRACT]＼ Objective＼ To investigate the neuroprotective effect and mechanism of action of oridonin （Ori） in secondary brain injury after intracerebral hemorrhage （ICH） in rats.
＼ Methods＼ All rats were randomly divided into sham group， ICH group， solvent group （intraperitoneal injection of an equal volume of normal saline to Ori）， low-dose Ori group （intraperitoneal injection of Ori at 5 mg/kg）， medium-dose Ori group （intraperitoneal injection of Ori at 15 mg/kg）， and high-dose Ori group （intraperitoneal injection of Ori at 25 mg/kg）. A rat model of ICH was established by injection of collagenase into the right basal ganglia in the last five groups. The neurobehavioral performance of the rats was observed 72 h after treatment. Then the rats were sacrificed to obtain the brain tissue; brain water content was determined to evaluate brain edema， and Fluoro-Jade C staining was used to detect neuronal damage. Western blot was applied to measure the expression of nuclear factor kappa B （NF-κB）， nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， and heme oxygenase-1 （HO-1）. Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to determine the expression of the pro-inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-6 （IL-6）. Immunofluorescent staining was used to measure the expression of Nrf2 and HO-1. ＼ Results＼ The medium-dose and high-dose Ori groups had significantly reduced neurobehavioral score， number of degenerative neurons， and brain water content than the ICH group and solvent group. Compared with the sham group， the expression of NF-κB， Nrf2， and HO-1 in the brain tissue was significantly increased in the ICH group and solvent group; either medium-dose or high-dose Ori significantly decreased the up-regulated expression of NF-κB， and further significantly increased the expression of Nrf2 and HO-1 （F=15.17-61.18，P<0.05）. Medium-dose Ori significantly reduced the expression of TNF-α， IL-1β， and IL-6 in the brain tissue of the ICH rats （F=24.53-69.26，P<0.05）.
＼ Conclusion＼ Ori can alleviate neuronal damage and cerebral edema following ICH， and contribute to recovery of neurological function and exert a neuroprotective effect， possibly through promoting the Nrf2/HO-1 antioxidant pathway and inhibiting the NF-κB inflammatory pathway.
[KEY WORDS]＼ RUBESCENSINE; cerebral hemorrhage; oxidative stress; inflammation; neuroprotection; rats
脑出血（ICH）是第二常见的脑卒中类型，致死率和致残率高[1-2]。迄今为止，ICH治疗干预的重点是早期预防血肿扩张，包括止血和抗高血压疗法，但并不能够有效减少血肿的扩张以及改善预后[3]。ICH分为原发和继发性损伤，脑血管外渗的血液在实质中形成血肿，使局部压力增大，导致原发性脑损伤，随后血肿降解又会引起细胞损伤、氧化应激和炎症反应，进而出现细胞死亡、脑水肿和神经行为缺陷等，导致继发性损伤[4]。越来越多研究表明，血肿形成后炎症反应和氧化应激与ICH诱发的继发性脑损伤和神经功能障碍密切相关，针对治疗脑血肿和ICH相关药物研发一直以来都是研究的热点[5-6]。冬凌草甲素（Ori）属于二萜类化合物，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学作用[7-8]。有研究表明，Ori可减轻脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞的炎症反应[9]。Ori也可直接抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体以及核因子κB（NF-κB）炎癥通路，减轻卡拉胶诱导的小鼠胸膜炎[10]。此外，Ori还可以激活Kelch样环氧氯丙烷相关联蛋白1（KEAP-1）/核转录相关因子2（Nrf2）信号通路的表达，从而发挥抗氧化的作用[10]。但是，Ori在ICH中的作用及机制尚不明确，故本研究对大鼠ICH模型进行Ori干预，观察不同剂量Ori对ICH大鼠神经功能、神经元变性、NF-κB及Nrf2/血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路表达水平的影响，以探讨Ori在ICH中的作用及其可能的机制。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠150只，体质量250～280 g，购自北京维通利华实验动物公司。每笼6只群养于青岛大学医学部动物中心大鼠饲养室。饲养条件：环境清洁，温度及湿度舒适，12 h昼夜交替，自由饮水和摄入食物。该动物实验获青岛大学附属医院医学伦理委员会同意。
1.1.2 药品和试剂 Ori购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（货号：28957-04-2）;胶原酶和Fluoro Jade-C（FJC）染料购自美国Sigma公司;肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-6酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;NF-κB抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;Nrf2、HO-1多克隆抗体购自美国Affinity公司。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及处理 将大鼠随机分为假手术组（Sham组，A组）、ICH组（B组）、溶剂组（ICH+Veh组，C组）、Ori低剂量组（ICH+LOri组，D组）、Ori中剂量组（ICH+MOri组，E组）、Ori高剂量组（ICH+HOri组，F组）。实验大鼠在实验前8 h禁止饮食。除Sham组外，其余5组大鼠使用胶原酶诱导建立ICH模型[11]。大鼠麻醉后固定在脑立体定向仪上，以前囟为原点，向右3.5 mm、向前0.2 mm作为穿刺点，进针深度5.5 mm，用10 μL微量注射泵以1 μL/min注入1 μL胶原酶Ⅳ（3 U），留针10 min，缓慢退针，用骨蜡封闭其骨孔，消毒缝合切口，将大鼠置于笼中观察，待其麻醉复苏。待大鼠麻醉清醒，Ori低、中、高剂量组于术后2、24和48 h分别给予Ori 5、15、25 mg/kg的腹腔注射（由于Ori可透过血-脑脊液屏障，故本次药物注射的方式采用腹腔注射），ICH+Veh组腹腔注射等体积的生理盐水。Sham组操作与ICH组相同，但不注射胶原酶。150只大鼠进行手术，其中114只手术成功，36只手术失败或死亡。 1.2.2 神经行为学检测 手术或药物处理72 h后，每组取6只大鼠，使用改良神经功能缺损程度评分（mNSS）对大鼠的神经功能进行评定，包括提尾试验、行走试验、感觉试验、平衡木试验等。对这些项目进行综合评分，总分0～18分，评分越高，神经系统损害就越严重。
1.2.3 脑含水量测定 神经功能评定后处死大鼠取全脑，去除嗅球和脑干，将其分为左脑、右脑、小脑等3部分，迅速称湿质量。然后将脑组织放到烘箱，在100 ℃温度下烘干24 h，称干质量。脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。
1.2.4 Western blot检测NF-κB、Nrf2和HO-1蛋白表达 在手术和药物处理72 h后，每组取6只大鼠，提取其脑组织置于-80 ℃冰箱里冷冻保存。取出冷冻的脑组织放在冰板上面，用刀片将ICH区域的脑组织分成5等份，取血肿周围组织提取蛋白质（后续实验取样的脑组织均为血肿周围组织），用BCA法测量蛋白质的浓度，SDS-PAGE凝胶跑胶，每孔上样10 μg蛋白，电泳（80 V，30 min，再120 V跑到底），转PVDF膜（250 mA，1.5 h），应用体积分数0.05牛奶封闭1.5 h，加一抗4 ℃过夜，加二抗室温1.5 h，显影。
1.2.5 ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6表达 取Sham组、ICH组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织，采用双抗体夹心ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。在酶标板中加100 μL标准品工作液或样本，37 ℃孵育90 min，弃液，加100 μL生物素化抗体工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次;每孔加入100 μL HRP酶结合物工作液，37 ℃孵育30 min，弃液，洗板5次;每孔加90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min，每孔加50 μL终止液，立即读取450 nm波长处的吸光度值。
1.2.6 免疫荧光染色检测Nrf2、HO-1的表达 取Sham组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织进行免疫荧光染色。首先用40 g/L的多聚甲醛灌注取脑，蔗糖梯度沉糖后，进行冷冻切片;固定、通透、封闭切片，加Nrf2、HO-1一抗4 ℃过夜，加荧光二抗室温1 h;用含DAPI的封片剂封片，萤光显微镜下观察阳性细胞数。
1.2.7 FJC染色检测神经元损伤情况 取Sham组、ICH+Veh组和ICH+MOri组的大鼠脑组织进行FJC染色。脑组织冷冻切片室温复温30 min，用双蒸水浸泡2 min，50 ℃烘干30 min，置于含10 g/L NaOH的体积分数0.80乙醇中浸泡5 min，置于体积分数0.70乙醇中浸泡2 min，以双蒸水浸洗2 min;将切片放入0.6 g/L高锰酸钾溶液中反应10 min，用蒸馏水浸洗2 min;将切片放入FJC溶液中反应20 min，以双蒸水浸洗3次，每次2 min;再置50 ℃的烘箱中烘干，二甲苯透明2 min;最后用DPX封片液封片，在荧光显微镜下计数FJC阳性细胞并拍照。
1.3 统计学分析
应用Graph Pad Prism 5.0软件进行统计学分析，计量数据以±s形式表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组比较，然后用Tukey法进行组间两两比较。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 Ori对ICH大鼠神经功能评分的影响
手术或药物处理72 h后，Sham组、ICH组、ICH+Veh组、ICH±LOri组、ICH+MOri组和ICH+HOri组的mNSS评分分别为0.67±0.58、10.33±1.53、10.00±1.73、8.00±1.00、6.67±0.58和6.33±0.58（n=6）。与Sham组比较，ICH组和
ICH+Veh组的mNSS评分明显升高（F=30.33，
q=15.140、14.620，P<0.05），而ICH组与ICH+Veh组比较差异无显著性（P>0.05）;与ICH组和ICH+Veh组相比，Ori处理各组mNSS评分均有下降，其中ICH+MOri组、ICH+HOri组的差异具有显著性（q=5.222～5.745，P<0.05），而ICH+MOri组和ICH+HOri组mNSS评分比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 各组脑组织含水量比较
各组大鼠左半脑和小脑含水量比较差异均无统计学意义（P>0.05）。ICH后大鼠右半脑含水量显著增加，经过中、高剂量Ori处理后，大鼠右半脑含水量显著降低（F=21.76，q=6.924～8.527，P<0.05），而ICH+MOri组和ICH+HOri组间脑水肿减轻的程度差异无统计学意义（P>0.05），ICH组与ICH+Veh组间相比较差异也无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.3 Ori对ICH大鼠脑组织中NF-κB、Nrf2以及HO-1表达的影响
ICH组和ICH+Veh组大鼠脑组织中NF-κB、Nrf2和HO-1的蛋白表达均较Sham组升高，经中、高剂量Ori处理后NF-κB表达降低，而Nrf2和HO-1的表达则进一步升高，差异均有统计学意义（F=15.17～61.18，q=6.303～10.110，P<0.05）;ICH+MOri组和ICH+HOri组间各指標比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1、表2。
2.4 Ori对ICH大鼠脑组织炎症因子表达的影响
综合上述神经行为学、脑含水量以及Western blot的检测结果，可知Ori在中、高剂量时均对ICH大鼠有神经保护作用，并且两组治疗效果无明显差别，因此Ori处理各组中仅选择ICH+MOri组进行后续实验。 ICH后脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著升高，在Ori处理后各指标的表达明显下降（F=24.53～69.26，q=6.208～17.120，P<0.05）。见表3。
2.5 各组脑组织中Nrf2和HO-1的荧光表达比较
ICH后抗氧化蛋白Nrf2及其下游蛋白HO-1的表达均增加，经中剂量Ori处理后，ICH+MOri组Nrf2和HO-1的表达较ICH+Veh组明显增高，差异均具有统计学意义（F=347.30、61.14，q=4.780～18.880，P<0.05）。见图2、表4。
2.6 各组神经元损伤情况比较
与Sham组相比，ICH+Veh组血肿周围绿色荧光的数量明显增多（F=97.99，q=19.970，P<0.05），而ICH+MOri组绿色荧光的数量较ICH+Veh组减少（q=13.180，P<0.05）。见图3、表4。
3 讨论
ICH早期致死率、致残率都很高，目前还没有理想的治疗方法[12-13]。越来越多的证据表明，氧化应激和炎症在ICH后继发性脑损伤中发挥着重要作用[14-16]，这种继发过程会导致ICH后病人的神经功能恶化[17]。本文的研究结果显示，ICH+MOri组和ICH+HOri组大鼠的mNSS评分、FJC阳性神经元数量以及促炎因子表达均显著下降，表明15和25 mg/kg的Ori均能够改善ICH后早期脑损伤和神经功能缺陷，并且15 mg/kg为理想剂量。
小胶质细胞介导的炎症损伤在ICH中起至关重要的作用用[18-19]。ICH发生后，小胶质细胞中的
NF-kB會被激活，进而使促炎因子的释放增加，导致
早期脑损伤用[20]，而这些促炎因子又作为NF-κB的激活剂，正反馈促进NF-κB的转录，进而加重炎症反应[21]。NF-κB作为一个关键的核转录因子，一直被公认是炎症反应的关键调节器[22]，抑制NF-κB的活性可以减轻神经功能损伤[23]。已有多项研究表明，Ori在抗肿瘤、促凋亡、抗炎、抗氧化、神经调节等方面有着十分重要的作用[14-25]，但其在ICH中的作用尚未见报道。ZHAO等[26]的研究结果显示，Ori通过调节Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号通路抑制促炎因子的表达，在小鼠急性肺损伤中起保护作用。有研究表明，Ori能够抑制NF-κB通路和Aβ1-42诱导的神经炎症[27]。本研究也证实了Ori的抗炎作用，在大鼠ICH后，15 mg/kg的Ori能够抑制NF-κB的表达和促炎因子的释放，减轻ICH后脑内的炎症反应。
此外，氧化应激是ICH后继发性脑损伤的重要原因[28]，Nrf2作为氧化应激反应中的关键转录因子和主要调节剂，在ICH后其表达逐渐增加，并诱导抗氧化基因的表达，在保护脑组织免受ICH后的氧化损伤中起重要作用[29]。研究已表明，Ori还可通过抑制NADPH氧化酶，促进KEAP-1与Nrf2解离，这样就会使Nrf2进入细胞核中转录并激活下游
蛋白HO-1，在疾病中发挥抗氧化作用[10]。ZENG等[30]研究表明，异黄体生成素可以加快激活Nrf2介导的抗氧化信号通路从而减少对实验性ICH后的早期脑损伤。这与本研究结果类似，提示Ori可能通过促进Nrf2/HO-1抗氧化作用，减轻ICH大鼠的早期脑损伤，起到神经保护作用。
综上所述，Ori对ICH模型大鼠早期脑损伤具有一定的保护作用，其机制可能为Ori通过促进Nrf2/HO-1抗氧化作用以及抑制NF-κB介导的炎症通路，减少氧化应激和炎症细胞浸润，从而在ICH早期脑损伤中起到神经保护作用。
[参考文献]
[1]MORGENSTERN L B， HEMPHILL I J， ANDERSON C， et al. Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association[J]. Stroke， 2010，41（9）：2108-2129.
[2]STEINER T， AL-SHAHI SALMAN R， BEER R， et al. European stroke organisation （ESO） guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage[J]. International Journal of Stroke： Official Journal of the International Stroke Society， 2014，9（7）：840-855.
[3]LEI Chunyan， CHEN Tao， CHEN Chun， et al. Pre-intracerebral hemorrhage and in-hospital statin use in intracerebral hemorrhage： a systematic review and meta-analysis[J]. World Neurosurgery， 2018，111：47-54.
[4]RICHARD F K， ZHOU N N， XIANG J M， et al. Vascular disruption and blood-brain barrier dysfunction in intracerebral hemorrhage[J]. Fluids and Barriers of the CNS， 2014，11（1）：18. [5]WANG Jian. Preclinical and clinical research on inflammation after intracerebral hemorrhage[J]. Progress in Neurobiology， 2010，92（4）：463-477.
[6]CHEN Sheng， YANG Qingwu， CHEN Gang， et al. An update on inflammation in the acute phase of intracerebral he-
morrhage[J]. Translational Stroke Research， 2015，6（1）：4-8.
[7]LUO H， VONG C T， CHEN H B， et al. Naturally occurring anti-cancer compounds： shining from Chinese herbal medicine[J]. Chinese Medicine， 2019，14（1）：48.
[8]LI Dahong， HAN Tong， LISO Jie， et al. Oridonin， a promi-
sing ent-Kaurane diterpenoid lead compound[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（9）：1395.
[9]XU Yan， XUE Yang， WANG Ying， et al. Multiple-modulation effects of Oridonin on the production of proinflammatory cytokines and neurotrophic factors in LPS-activated microglia[J]. International Immunopharmacology， 2009，9（3）：360-365.
[10]YANG Huahong， HUANG Jingbo， GAO Yanli， et al. Oridonin attenuates carrageenan-induced pleurisy via activation of the KEAP-1/Nrf2 pathway and inhibition of the TXNIP/NLRP3 and NF-κB pathway in mice[J]. Inflammopharmacology， 2020，28（2）：513-523.
[11]CHEN Chunli， ZHOU Fang， ZENG Liuwang， et al. Methy-
lene blue offers neuroprotection after intracerebral hemorrhage in rats through the PI3K/Akt/GSK3β signaling pathway[J]. Journal of Cellular Physiology， 2019，234（4）：5304-5318.
[12]KEEP R F， HUA Y， XI G. Intracerebral haemorrhage： mechanisms of injury and therapeutic targets[J]. Lancet Neurol， 2012，11（8）：720-731.
[13]VANASCH C J， LUITSE M J， RINKEL G J， et al. Incidence， case fatality， and functional outcome of intracerebral haemorrhage over time， according to age， sex， and ethnic origin： a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet Neurol， 2010，9（2）：167-176.
[14]白威，楊薛康，杨国栋. 钠氢交换蛋白1抑制剂对脓毒症大鼠心脏损伤保护作用的实验研究[J]. 陕西医学杂志， 2015，44（6）：643-645.
[15]XI G H， KEEP R F， HOFF J T. Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage[J]. The Lancet Neurology， 2006，5（1）：53-63.
[16]DUAN X， WEN Z， SHEN H， et al. Intracerebral hemorrhage， oxidative stress， and antioxidant therapy[J]. Oxid Med Cell Longev， 2016，2016：1203285.
[17]WANG J， DORE S. Inflammation after intracerebral he-
morrhage[J]. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism： Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism， 2007，27（5）：894-908. [18]ZHAO Yang， YU Anyong， LIU Yongping， et al. Regulatory T cells inhibit microglia activation and protect against inflammatory injury in intracerebral hemorrhage[J]. International Immunopharmacology， 2014，22（2）：522-525.
[19]HARRY G J， KRAFT A D. Microglia in the developing brain： a potential target with lifetime effects[J]. Neurotoxicology， 2012，33（2）：191-206.
[20]FRAKES A E， FERRAIUOLO L， HAIDET-PHILLIPS A M， et al. Microglia induce motor neuron death via the classical NF-kappaB pathway in amyotrophic lateral sclerosis[J]. Neuron， 2014，81（5）：1009-1023.
[21]HANG Chunhua， SHI Jixin， LI Jieshou， et al. Expressions of intestinal NF-κB， TNF-α， and IL-6 following traumatic brain injury in rats[J]. Journal of Surgical Research， 2005，123（2）：188-193.
[22]BAHAR M， MATTHEW C C. Nuclear factor-kappaB in autoimmunity： man and mouse[J]. Frontiers in Immunology， 2018，9：613.
[23]LIN Sen， YIN Qing， ZHONG Qi， et al. Heme activates TLR4-mediated inflammatory injury via MyD88/TRIF signaling pathway in intracerebral hemorrhage[J]. Journal of Neuroinflammation， 2012，9（1）：46.
[24]WANG Yanyan， LV Yanfang， LU Lu， et al. Oridonin inhibits mTOR signaling and the growth of lung cancer tumors[J]. Anti-Cancer Drugs， 2014，25（10）：1192-1200.
[25]XU J M， ERIC W， YE D， et al. Therapeutic potential of oridonin and its analogs： from anticancer and antiinflammation to neuroprotection[J]. Molecules， 2018，23（2）：474.
[26]ZHAO Gan， ZHANG Tao， MA Xiaofei， et al. Oridonin atte-
nuates the release of pro-inflammatory cytokines in lipopolysaccharide-induced RAW264.7 cells and acute lung injury[J]. Oncotarget， 2017，8（40）：68153-68164.
[27]WANG Sulei， YANG Hui， YU Linjie， et al. Oridonin attenuates Aβ1-42-induced neuroinflammation and inhibits NF-κB pathway[J]. PLoS One， 2014，9（8）：e104745.
[28]HU X， TAO C， GAN Q， et al. Oxidative stress in intracerebral hemorrhage： sources， mechanisms， and therapeutic targets[J]. Oxid Med Cell Longev， 2016，2016：3215391.
[29]SHANG H， YANG D， ZHANG W， et al. Time course of Keap1-Nrf2 pathway expression after experimental intracerebral haemorrhage： correlation with brain oedema and neurological deficit[J]. Free Radic Res， 2013，47（5）：368-375.
[30]ZENG Jun， CHEN Yizhao， DING Rui， et al. Isoliquiritigenin alleviates early brain injury after experimental intracerebral hemorrhage via suppressing ROS-and/or NF-κB-mediated NLRP3 inflammasome activation by promoting Nrf2 antioxidant pathway[J]. Journal of Neuroinflammation， 2017，14（1）：119.
（本文編辑 马伟平）