【摘 要】
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通过RT-PCR方法克隆了日本脑炎病毒(JEV)N基因片段序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,同时根据GenBank中的靶序列设计了荧光定量RT-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件
【机 构】
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广东省动物防疫监督总所,广东省农业科学院兽医研究所,西北农林科技大学动物科技学院,云南出入境检验检疫局
【基金项目】
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国家食品安全重大专项(2001BA804A31);广东省农业科技攻关项目(2003B21404和20052490100);广东省自然基金重点项目(06105311)
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通过RT-PCR方法克隆了日本脑炎病毒(JEV)N基因片段序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,同时根据GenBank中的靶序列设计了荧光定量RT-PCR的1对引物和1条TaqMan探针。通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了JEV检测的荧光定量PCR方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108和1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为17.33、20.52和23.90,变异系数分别为0.54%、0.74%和0.53%,均小于5%。对阳性组织病料的检测表明该方法的灵敏度高出常规PCR,与套式PCR(nested-PCR,nPCR)具有相近的灵敏度。
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