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摘要[目的]对盐芥EsABI1基因进行克隆及功能预测。[方法]克隆盐芥EsABI1基因cDNA序列，对其蛋白保守结构域和系统进化进行分析。[结果]EsABI1与AtABI1属于进化上的同一分支，有最近的亲缘关系，都含有包含PP2C蛋白磷酸酶催化活性位点在内的11个保守功能域。定量PCR检测发现，盐芥EsABI1沉默植株中EsABI1表达水平较野生型均有不同程度的降低。60 μmol/L ABA分别处理EsABI1沉默植株0、3和6 h后，发现EsABI1基因表达水平受ABA诱导上调，而且相比于盐芥野生型，EsABI1沉默植株中EsABI1受ABA诱导上调表达更加明显。[结论]EsABI1是ABA信号转导途径中的负调控因子，参与了盐芥对环境胁迫的响应。
关键词盐芥；EsABI1；ABA；基因沉默；基因表达
中图分类号S188文献标识码
A文章编号0517-6611（2017）30-0134-06
Abstract[Objective]To clone the EsABI1 of Eutrema salsugineum and predict the function.[Method]The cDNA sequence of EsABI1 of E.salsugineum was cloned to study the protein conserved domain and phyletic evolution.[Result]EsABI1 and AtABI1 had highest similarity and belonged to one branch in evolution，which contained 11 conserved domains，including PP2C protein phosphatase catalytic active site.Quantitative PCR detection showed that the expression level of EsABI1 in EsABI1 silent plants was lower than that in the wild type.The expression of EsABI1 had been upregulated under 60 μmol/L ABA for 0，3，6 hours in E.salsugineum，and the higher upregulated expression of EsABI1 compared with wide type.[Conclusion] EsABI1 acted as a negative regulator in ABA signal transduction pathway of E.salsugineum，which participated in the response of E.salsugineum to environmental stress.
Key wordsEutrema salsugineum；EsABI1；Abscisic acid；Gene silencing；Gene expression
植物在生長发育过程中经常遭受干旱、盐、极端温度等非生物胁迫的伤害，脱落酸（ABA）作为主要的逆境相关激素参与植物对外界胁迫的应答，研究表明多数情况下ABA负调控植物对环境胁迫的响应[1-2]。蛋白激酶和蛋白磷酸酶是ABA信号转导中的核心组分，参与植物蛋白的可逆磷酸化反应，是许多生理过程的主要调节机制[3-4]。
蛋白磷酸酶主要分为2个类型：Ser/Thr蛋白磷酸酶（Ser/Thr phosphatases）和Try蛋白磷酸酶（Ttry phosphatases）。Ser/Thr蛋白磷酸酶家族在信号传递、细胞分裂周期调控、细胞分化和新陈代谢中具不可或缺的作用，根据其作用底物的专一性、对抑制剂的敏感性以及是否需要二价阳离子可分为PP1、PP2A、PP2B和PP2C[5-6]。不同于其他Ser/Thr蛋白磷酸酶家族，PP2C（Ser/Thr phosphatases protein 2C）家族进化最明显，为单体酶，其不受调控亚基的调控，而是通过结构的改变行使功能；PP2C功能受表达水平、胞内定位和第二信使等的调节[5，7]。真核生物PP2C结构具有共性，即蛋白的N端或C端具有11个保守基序的催化区域[8]。植物中PP2C保守催化域多位于C端，如拟南芥ABI1的催化结构域就在C端；而PP2C的N端保守性较低，其具有其他功能，如ABI1蛋白靠近N末端位置有一可与Ca2+结合的类似EF指基序[8-9]。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）PP2C家族的成员主要包括ABI1、ABI2、HAB1、AHG3和PP2CA，它们均为ABA信号途径的负调控因子。目前，拟南芥中至少已发现了69个PP2C基因，其中ABI1与ABI2分别由ABI1、ABI2基因编码，是拟南芥ABA信号转导途径中重要的负调控因子，可削弱植物对ABA的敏感性，影响与ABA信号转导相关的植物表型和生理性状[1]。abi1-1和abi2-1突变体均为甘氨酸替换为天冬氨酸的单错义突变体，所不同的是前者突变在其等位基因的第180位，而后者在第168位，二者对ABA的响应较之于野生型均减弱，即abi1-1和abi2-1均导致植株ABA的耐受性增强[10]。
多项研究发现，高等植物中PP2C广泛参与ABA诱导的种子萌发和休眠[11-14]、气孔关闭[15]、保卫细胞[16]和离子通道的调控[17]以及逆境胁迫的应答[18-20]等。Finkelstein等[21]研究发现，在外源ABA处理的 abi1、abi2突变体中其脯氨酸积累量明显低于野生型，说明ABI1与ABI2是植物耐逆相关基因。在ABA不敏感突变体abi1-1和abi2-1中，其气孔关闭的调控机制受损，因而它们均对水分胁迫非常敏感[18，22]。苜蓿中的PP2C受环境胁迫诱导且为MAPK途径的负调控因子[23]。Thtiharju等[19]报道PP2CA为冷胁迫下拟南芥ABA信号途径的负调节因子，通过对PP2CA基因沉默植株的研究发现，植株对冷胁迫的耐受性大大增强，而对于ABA则更为敏感。研究表明，PP2CA过量表达植株较野生型表现出对ABA的更加不敏感，而pp2ca-1和pp2ca-2插入突变体表现出对ABA的敏感性增强[15，24]。 植物体内 PP2C的广泛多样性表明其在不同组织和器官中信号转导机制的多样性。鉴于ABI1 为拟南芥ABA信号通路最主要的负调控因子，在ABA诱导的植物保卫细胞气孔运动中发挥重要作用，该研究以拟南芥近缘的耐逆模式植物——盐芥（Eutrema salsugineum，之前名称为 Thellungiella halophila或Thellungiella salsugineum）为试材，通过构建EsABI1沉默表达载体获得盐芥EsABI1沉默植株，研究EsABI1在ABA诱导下的表达特点，为进一步研究盐芥EsABI1功能及ABA信号转导机制提供基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究材料。盐芥的种子采自山东省东营盐碱地，幼苗时生长于22 ℃光照培养箱约14 d，再4 ℃低温春化约30 d移至22～25 ℃人工气候室。
1.1.2载体和菌种。pBluescript KS、pRT101、pCAMBIA3301克隆载体以及大肠杆菌DH10B、农杆菌GV3101均由笔者所在实验室保存。
1.1.3试剂。限制性内切酶、连接酶、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司。IPTG、XGal、Ampicillin、kanamycin购自Sigma 公司，除草剂FINALE Herbicide（Glufosinateammonium 11.33%，其他成分88.67%）购自Bayer Environmental Science公司。质粒提取液、Geneclean回收系统为笔者所在实验室自制。其他化学试剂均为国产或进口分析纯。所用引物由上海生物工程公司合成。
1.2方法
1.2.1Trizol法提取盐芥总RNA。将25 ℃光照培养14～21 d的盐芥按Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度和A260/A280，放于-80 ℃贮存备用。
1.2.2引物设计与PCR扩增。根据盐芥EsABI1和EsActin等基因序列，利用 Primer 5.0软件设计用于EsABI1基因沉默构建和实时定量PCR等引物，引物序列见表1。
1.2.3反转录PCR和EsABI1基因cDNA克隆。Oligo（dT） 1 μL，RNA 0.1～2.0 μg，DEPCH2O x μL，总体积 12 μL，混匀，离心后70 ℃，5 min；5×RTBuffer 4 μL，RNase inhibitor 1 μg，dNTP 2 μL，反转录酶1 μL，总体积 20 μL，混匀后离心，进行RT：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，得到20 μL反转录的cDNA。使用EsABI1基因cDNA全长引物，Pyrobest taq酶PCR扩增EsABI1基因cDNA全长序列； Geneclean法回收基因片段。將以上DNA的回收片段与酶切后的KS载体进行连接，转化大肠杆菌后的阳性克隆进行测序，得到正确的KS∷EsABI1重组子。
1.2.4盐芥EsABI1基因沉默载体的构建和农杆菌转化。以上测序正确的KS∷EsABI1质粒为模板，使用EsABI1基因沉默引物，Pyrobest taq酶进行高保真PCR反应，Geneclean法回收约218 bp用于EsABI1基因沉默片段。BamH Ⅰ酶切以上PCR产物，BamH Ⅰ和SmaⅠ双酶切载体PINT4 （在pRT101中）；将这两酶切产物连接、转化。再以EcoR Ⅰ酶切以上PCR产物，以EcoR Ⅰ和Pml Ⅰ双酶切以上检测为阳性克隆的质粒，连接组成含有反向互补片断的载体，并用BamH Ⅰ酶切检测；用Hind Ⅲ分别酶切上步中的重组质粒和pCAMBIA3301质粒，连接成重组质粒。转化大肠杆菌DH10B，提质粒后用Hind Ⅲ酶切验证。构建成除草剂Basta为筛选标记的EsABI1∷pCAMBIA3301沉默载体。EsABI1基因沉默载体转化根癌农杆菌，Kan和Rif筛选阳性菌落，酶切验证正确的单克隆进行其农杆菌培养，用于盐芥的转化。
1.2.5盐芥EsABI1沉默载体的植物转化和转化子的筛选。使用含EsABI1基因沉默载体的根癌农杆菌，用Floral dipping法[25]转化盐芥。收获T1代种子，Basta除草剂筛选转基因苗；播种T1代种子，幼苗出土7～21 d后，Basta筛选转基因植株，单株收取T2代种子；种植T2代种子，统计黄苗和绿苗的棵数；播种T2代种子，Basta筛选纯合T3代转基因株系。提取转基因植株的DNA，进行Basta基因序列的PCR分子检测。
1.2.6盐芥EsABI1沉默植株的分子鉴定。CTAB法提取盐芥EsABI1沉默植株和野生型的基因组DNA，以该DNA为模板、Basta基因序列为引物，进行Bar基因的PCR扩增。
1.2.7盐芥EsABI1沉默植株的实时定量PCR检测。Trizol法提取盐芥野生型和EsABI1沉默植株的总RNA，用TaKaRa公司的RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0进行反转录，得到10 μL cDNA，稀释10倍，作为实时定量PCR反应的模板。根据DNA Engine Opticon Continuous Fluorescence Detection System对实时定量PCR体系的要求，引物退火温度设计为60 ℃左右，扩增模板的长度为90～110 bp。根据盐芥EsABI1基因序列设计引物，所用的内标基因为盐芥Actin2基因，根据NCBI上提供的盐芥EsActin2基因序列设计引物，引物序列见表1。进行Realtime PCR反应：SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，稀释的cDNA模板1 μL， Primer-F：0.4 μL， Primer-R：0.4 μL，加ddH2O至20 μL；进行PCR反应（94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，终点读板，82 ℃ 1 s，终点读板，39 个循环；72 ℃ 7 min；熔解曲线分析：72～95 ℃逐步升温，0.2 ℃/步，每个温度停留1 s；结束）。 1.3分析软件主要有CluastalX、Primer premier 5、DNAMAN、Blast等。
2结果与分析
2.1盐芥EsABI1基因分子克隆、序列和蛋白结构域分析
对实验室构建的盐芥EST库中含EsABI1 cDNA的质粒测序，得到长约2 121 bp的EsABI1 cDNA序列，根据NCBI Blast分析，其中开放阅读框架为1 320 bp，其编码439个氨基酸，5’非编码区为469 bp，3’非编码区为332 bp，全序列测序结果及氨基酸编码情况如图1所示。
用Trizol试剂提取盐芥总RNA，使用反转录试剂盒（TaKaRa）进行盐芥总RNA的反转录，得到cDNA；以该cDNA为模板，以EsABI1基因序列设计引物进行PCR，EsABI1基因大小约为1 320 bp（图2），与预期一致；回收该PCR产物，连入KS载体后测序验证。
对盐芥EsABI1进行蛋白质Blast分析，发现EsABI1属于PP2C蛋白磷酸酶家族，其与AtABI1氨基酸序列具92%的相似性。盐芥EsABI1蛋白的第132～420个氨基酸含有PP2C蛋白磷酸酶催化活性的保守结构域（图3）。利用在线工具进一步分析发现EsABI1蛋白第177～185个氨基酸为PP2C蛋白磷酸酶催化位点FFGVYDGHG，如图1、4中方框所示。
将盐芥EsABI1与拟南芥几种重要的PP2C蛋白氨基酸序列进行比对，发现盐芥EsABI1与这几种PP2C蛋白在氨基酸水平上具有较高的序列相似性，它们都含有包括PP2C蛋白磷酸酶活性催化位点在内的11个较保守的功能结构域，且这些保守区域都集中在氨基酸序列的中间到C端的区域（图4）。
2.2盐芥EsABI1的系统谱系分析
使用DNAMAN软件，将盐芥EsABI1氨基酸序列与多个物种的ABI1等PP2C蛋白的氨基酸序列進行比对分析，建立包括盐芥、拟南芥、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、山毛榉（Fagus sylvatica）、小麦（Triticum aestivum）和烟草（Nicotiana tabacum）等不同物种的PP2C类蛋白氨基酸序列的系谱分析图（图5），结果显示EsABI1与AtABI1属于进化上的同一分支，二者的亲缘关系最近，EsABI1与AtABI1、AtABI2、AtHAB1、AtHAB2同处于一个较大的分支，AtAHG3则另属于一个独立的分支。
2.3盐芥EsABI1沉默植株的获得
2.3.1盐芥EsABI1沉默载体的构建。以含EsABI1 cDNA的质粒为模板，用Pyrobest taq酶进行PCR反应，扩增后凝胶电泳分离得到218 bp左右的片段，Geneclean法回收PCR产物。BamH Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切载体PINT4 （在pRT101中），连接EsABI1基因的反向片段，用EcoR Ⅰ和Pml Ⅰ双酶切上步的重组质粒，连入正向片段，阳性克隆可用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切检测；再用Hind Ⅲ酶切上步中的阳性克隆质粒和pCAMBIA3301载体，连接、转化，提质粒后用Hind Ⅲ酶切验证。构建成除草剂Basta为筛选标记的EsABI1∷pCAMBIA3301沉默载体（图6A）。
2.3.2盐芥EsABI1沉默株系的筛选。用Floral dipping[26]法进行盐芥野生型遗传转化，收获T1代种子；将转化后的T1
代种子种植到营养土中，在幼苗出土14 d后喷施0.2%Basta溶液。非转化苗在喷洒Basta溶液后开始黄化，并停止生长，7 d左右枯死；而抗性苗在喷洒Basta溶液后保持绿色（图6B）。
2.3.3盐芥EsABI1沉默株系的分子鉴定。将获得的盐芥EsABI1沉默植株，微量提取其基因组DNA；以转基因植株及对照植株的DNA为模板、Bar基因特异引物进行PCR扩增反应，结果发现，6株转基因盐芥植株可扩增出Bar基因的特异条带，大小约为500 bp，与预期一致；而野生型对照植株未出现阳性条带（图6C）。初步表明EsABI1∷pCAMBIA3301已整合到盐芥基因组中。
提取盐芥EsABI1 RNAi植株总RNA，反转录得到cDNA；选择盐芥EsActin2基因作为内标，定量PCR检测EsABI1基因的表达水平，结果发现，EsABI1 RNAi-1、2、3和4株系的EsABI1基因表达水平较对照均有不同程度的下降，分别为对照的0.581、 0.489、 0.617、0.446倍（图6D）。
2.4ABA处理下盐芥EsABI1沉默株系中EsABI1表达分析
对生长28 d的盐芥野生型植株进行以下处理：①200 mmol/L甘露醇模拟干旱处理9 h，EsABI1基因的表达水平约为对照（未处理）的7.50倍；②400 mmol/L NaCl处理24 h，EsABI1基因的表达水平约为对照的3.67倍；③4 ℃冷处理24 h，EsABI1基因的表达水平约为对照的2.20倍；④60 μmmol/L ABA处理12 h，EsABI1基因的表达水平约为对照的7.69倍。由此看出，EsABI1基因受干旱、NaCl、冷胁迫和ABA的诱导后表达上调，其中以干旱和ABA处理后的EsABI1表达上调最为显著[27]。
该试验使用60 μmol/L ABA均匀喷施于盐芥野生型、EsABI1 RNAi转基因株系2和4的叶片，分别在3、6 h后取样进行RNA的提取，以盐芥内源的EsActin2为内标、未作ABA处理的盐芥为对照，进行Realtime PCR检测分析，发现 60 μmol/L ABA处理3、6 h后，EsABI1 RNAi-2株系中EsABI1的表达水平分别为对照的4.09和5.10倍，EsABI1 RNAi-4株系中EsABI1的表达水平分别为对照的3.34和3.87倍；而盐芥野生型株系在60 μmol/L ABA处理3和6 h后EsABI1基因的表达水平为对照的1.55和2.79倍（图7）。其结果说明，ABA处理EsABI1基因沉默株系后，EsABI1的表达水平受外源ABA诱导后其上调程度大于野生型。 3討论
拟南芥的生物学和分子遗传学研究表明，PP2C蛋白磷酸酶是植物信号转导过程的关键因子，广泛参与脱落酸的各种信号途径，作为大多数信号途径的负调控因子。PP2C能与激酶、其他调控蛋白结合或直接与DNA 结合，调控相关基因的表达。目前，使用正、反向遗传学及生化分析等方法已在植物中鉴定了ABA信号通路的多种组分及ABA的多个作用靶点，特别是PP2C家族中ABI1、ABI2、AHG3、ATPP2CA和HAB1等蛋白活性、调控、基因表达及其与逆境胁迫关系的研究[27-30]，为深入探究ABA信号通路奠定了基础。
盐芥野生型在干旱、盐、冷和ABA处理下，EsABI1表达均有不同程度的上调，其中干旱和ABA处理下EsABI1表达水平的上调最明显，说明EsABI1基因的表达受以上胁迫的诱导，尤以干旱和ABA更敏感。对60 μmol/L ABA处理盐芥野生型和EsABI1基因沉默株系后3、6 h的定量检测发现，不论是盐芥野生型还是EsABI1沉默株系，其EsABI1的表达水平均受ABA的诱导而表达上调，而且EsABI1表达水平在ABA处理3、6 h后的上调较野生型均更为显著，说明盐芥EsABI1基因与拟南芥AtABI1基因一样，均是ABA信号转导途径中的负调控因子，可削弱植物对ABA的敏感性，进而在植物的生长发育及其对逆境胁迫的应答中起调控作用。
4结论
盐芥EsABI1基因是其ABA信号通路的负调控因子，可能在其耐逆功能中起到一定的作用。后续研究将探讨不同逆境胁迫下EsABI1基因表达水平的变化及其与下游互作蛋白间的关系，寻找ABA信号通路的新组分及其与盐芥耐逆性的关系。
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关键词盐芥；EsABI1；ABA；基因沉默；基因表达
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Abstract[Objective]To clone the EsABI1 of Eutrema salsugineum and predict the function.[Method]The cDNA sequence of EsABI1 of E.salsugineum was cloned to study the protein conserved domain and phyletic evolution.[Result]EsABI1 and AtABI1 had highest similarity and belonged to one branch in evolution，which contained 11 conserved domains，including PP2C protein phosphatase catalytic active site.Quantitative PCR detection showed that the expression level of EsABI1 in EsABI1 silent plants was lower than that in the wild type.The expression of EsABI1 had been upregulated under 60 μmol/L ABA for 0，3，6 hours in E.salsugineum，and the higher upregulated expression of EsABI1 compared with wide type.[Conclusion] EsABI1 acted as a negative regulator in ABA signal transduction pathway of E.salsugineum，which participated in the response of E.salsugineum to environmental stress.
Key wordsEutrema salsugineum；EsABI1；Abscisic acid；Gene silencing；Gene expression
植物在生長发育过程中经常遭受干旱、盐、极端温度等非生物胁迫的伤害，脱落酸（ABA）作为主要的逆境相关激素参与植物对外界胁迫的应答，研究表明多数情况下ABA负调控植物对环境胁迫的响应[1-2]。蛋白激酶和蛋白磷酸酶是ABA信号转导中的核心组分，参与植物蛋白的可逆磷酸化反应，是许多生理过程的主要调节机制[3-4]。
蛋白磷酸酶主要分为2个类型：Ser/Thr蛋白磷酸酶（Ser/Thr phosphatases）和Try蛋白磷酸酶（Ttry phosphatases）。Ser/Thr蛋白磷酸酶家族在信号传递、细胞分裂周期调控、细胞分化和新陈代谢中具不可或缺的作用，根据其作用底物的专一性、对抑制剂的敏感性以及是否需要二价阳离子可分为PP1、PP2A、PP2B和PP2C[5-6]。不同于其他Ser/Thr蛋白磷酸酶家族，PP2C（Ser/Thr phosphatases protein 2C）家族进化最明显，为单体酶，其不受调控亚基的调控，而是通过结构的改变行使功能；PP2C功能受表达水平、胞内定位和第二信使等的调节[5，7]。真核生物PP2C结构具有共性，即蛋白的N端或C端具有11个保守基序的催化区域[8]。植物中PP2C保守催化域多位于C端，如拟南芥ABI1的催化结构域就在C端；而PP2C的N端保守性较低，其具有其他功能，如ABI1蛋白靠近N末端位置有一可与Ca2+结合的类似EF指基序[8-9]。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）PP2C家族的成员主要包括ABI1、ABI2、HAB1、AHG3和PP2CA，它们均为ABA信号途径的负调控因子。目前，拟南芥中至少已发现了69个PP2C基因，其中ABI1与ABI2分别由ABI1、ABI2基因编码，是拟南芥ABA信号转导途径中重要的负调控因子，可削弱植物对ABA的敏感性，影响与ABA信号转导相关的植物表型和生理性状[1]。abi1-1和abi2-1突变体均为甘氨酸替换为天冬氨酸的单错义突变体，所不同的是前者突变在其等位基因的第180位，而后者在第168位，二者对ABA的响应较之于野生型均减弱，即abi1-1和abi2-1均导致植株ABA的耐受性增强[10]。
多项研究发现，高等植物中PP2C广泛参与ABA诱导的种子萌发和休眠[11-14]、气孔关闭[15]、保卫细胞[16]和离子通道的调控[17]以及逆境胁迫的应答[18-20]等。Finkelstein等[21]研究发现，在外源ABA处理的 abi1、abi2突变体中其脯氨酸积累量明显低于野生型，说明ABI1与ABI2是植物耐逆相关基因。在ABA不敏感突变体abi1-1和abi2-1中，其气孔关闭的调控机制受损，因而它们均对水分胁迫非常敏感[18，22]。苜蓿中的PP2C受环境胁迫诱导且为MAPK途径的负调控因子[23]。Thtiharju等[19]报道PP2CA为冷胁迫下拟南芥ABA信号途径的负调节因子，通过对PP2CA基因沉默植株的研究发现，植株对冷胁迫的耐受性大大增强，而对于ABA则更为敏感。研究表明，PP2CA过量表达植株较野生型表现出对ABA的更加不敏感，而pp2ca-1和pp2ca-2插入突变体表现出对ABA的敏感性增强[15，24]。 植物体内 PP2C的广泛多样性表明其在不同组织和器官中信号转导机制的多样性。鉴于ABI1 为拟南芥ABA信号通路最主要的负调控因子，在ABA诱导的植物保卫细胞气孔运动中发挥重要作用，该研究以拟南芥近缘的耐逆模式植物——盐芥（Eutrema salsugineum，之前名称为 Thellungiella halophila或Thellungiella salsugineum）为试材，通过构建EsABI1沉默表达载体获得盐芥EsABI1沉默植株，研究EsABI1在ABA诱导下的表达特点，为进一步研究盐芥EsABI1功能及ABA信号转导机制提供基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1研究材料。盐芥的种子采自山东省东营盐碱地，幼苗时生长于22 ℃光照培养箱约14 d，再4 ℃低温春化约30 d移至22～25 ℃人工气候室。
1.1.2载体和菌种。pBluescript KS、pRT101、pCAMBIA3301克隆载体以及大肠杆菌DH10B、农杆菌GV3101均由笔者所在实验室保存。
1.1.3试剂。限制性内切酶、连接酶、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、DNA 聚合酶购自TaKaRa 公司。IPTG、XGal、Ampicillin、kanamycin购自Sigma 公司，除草剂FINALE Herbicide（Glufosinateammonium 11.33%，其他成分88.67%）购自Bayer Environmental Science公司。质粒提取液、Geneclean回收系统为笔者所在实验室自制。其他化学试剂均为国产或进口分析纯。所用引物由上海生物工程公司合成。
1.2方法
1.2.1Trizol法提取盐芥总RNA。将25 ℃光照培养14～21 d的盐芥按Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度和A260/A280，放于-80 ℃贮存备用。
1.2.2引物设计与PCR扩增。根据盐芥EsABI1和EsActin等基因序列，利用 Primer 5.0软件设计用于EsABI1基因沉默构建和实时定量PCR等引物，引物序列见表1。
1.2.3反转录PCR和EsABI1基因cDNA克隆。Oligo（dT） 1 μL，RNA 0.1～2.0 μg，DEPCH2O x μL，总体积 12 μL，混匀，离心后70 ℃，5 min；5×RTBuffer 4 μL，RNase inhibitor 1 μg，dNTP 2 μL，反转录酶1 μL，总体积 20 μL，混匀后离心，进行RT：42 ℃ 60 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，得到20 μL反转录的cDNA。使用EsABI1基因cDNA全长引物，Pyrobest taq酶PCR扩增EsABI1基因cDNA全长序列； Geneclean法回收基因片段。將以上DNA的回收片段与酶切后的KS载体进行连接，转化大肠杆菌后的阳性克隆进行测序，得到正确的KS∷EsABI1重组子。
1.2.4盐芥EsABI1基因沉默载体的构建和农杆菌转化。以上测序正确的KS∷EsABI1质粒为模板，使用EsABI1基因沉默引物，Pyrobest taq酶进行高保真PCR反应，Geneclean法回收约218 bp用于EsABI1基因沉默片段。BamH Ⅰ酶切以上PCR产物，BamH Ⅰ和SmaⅠ双酶切载体PINT4 （在pRT101中）；将这两酶切产物连接、转化。再以EcoR Ⅰ酶切以上PCR产物，以EcoR Ⅰ和Pml Ⅰ双酶切以上检测为阳性克隆的质粒，连接组成含有反向互补片断的载体，并用BamH Ⅰ酶切检测；用Hind Ⅲ分别酶切上步中的重组质粒和pCAMBIA3301质粒，连接成重组质粒。转化大肠杆菌DH10B，提质粒后用Hind Ⅲ酶切验证。构建成除草剂Basta为筛选标记的EsABI1∷pCAMBIA3301沉默载体。EsABI1基因沉默载体转化根癌农杆菌，Kan和Rif筛选阳性菌落，酶切验证正确的单克隆进行其农杆菌培养，用于盐芥的转化。
1.2.5盐芥EsABI1沉默载体的植物转化和转化子的筛选。使用含EsABI1基因沉默载体的根癌农杆菌，用Floral dipping法[25]转化盐芥。收获T1代种子，Basta除草剂筛选转基因苗；播种T1代种子，幼苗出土7～21 d后，Basta筛选转基因植株，单株收取T2代种子；种植T2代种子，统计黄苗和绿苗的棵数；播种T2代种子，Basta筛选纯合T3代转基因株系。提取转基因植株的DNA，进行Basta基因序列的PCR分子检测。
1.2.6盐芥EsABI1沉默植株的分子鉴定。CTAB法提取盐芥EsABI1沉默植株和野生型的基因组DNA，以该DNA为模板、Basta基因序列为引物，进行Bar基因的PCR扩增。
1.2.7盐芥EsABI1沉默植株的实时定量PCR检测。Trizol法提取盐芥野生型和EsABI1沉默植株的总RNA，用TaKaRa公司的RNA PCR Kit （AMV）Ver.3.0进行反转录，得到10 μL cDNA，稀释10倍，作为实时定量PCR反应的模板。根据DNA Engine Opticon Continuous Fluorescence Detection System对实时定量PCR体系的要求，引物退火温度设计为60 ℃左右，扩增模板的长度为90～110 bp。根据盐芥EsABI1基因序列设计引物，所用的内标基因为盐芥Actin2基因，根据NCBI上提供的盐芥EsActin2基因序列设计引物，引物序列见表1。进行Realtime PCR反应：SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，稀释的cDNA模板1 μL， Primer-F：0.4 μL， Primer-R：0.4 μL，加ddH2O至20 μL；进行PCR反应（94 ℃ 3 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，终点读板，82 ℃ 1 s，终点读板，39 个循环；72 ℃ 7 min；熔解曲线分析：72～95 ℃逐步升温，0.2 ℃/步，每个温度停留1 s；结束）。 1.3分析软件主要有CluastalX、Primer premier 5、DNAMAN、Blast等。
2结果与分析
2.1盐芥EsABI1基因分子克隆、序列和蛋白结构域分析
对实验室构建的盐芥EST库中含EsABI1 cDNA的质粒测序，得到长约2 121 bp的EsABI1 cDNA序列，根据NCBI Blast分析，其中开放阅读框架为1 320 bp，其编码439个氨基酸，5’非编码区为469 bp，3’非编码区为332 bp，全序列测序结果及氨基酸编码情况如图1所示。
用Trizol试剂提取盐芥总RNA，使用反转录试剂盒（TaKaRa）进行盐芥总RNA的反转录，得到cDNA；以该cDNA为模板，以EsABI1基因序列设计引物进行PCR，EsABI1基因大小约为1 320 bp（图2），与预期一致；回收该PCR产物，连入KS载体后测序验证。
对盐芥EsABI1进行蛋白质Blast分析，发现EsABI1属于PP2C蛋白磷酸酶家族，其与AtABI1氨基酸序列具92%的相似性。盐芥EsABI1蛋白的第132～420个氨基酸含有PP2C蛋白磷酸酶催化活性的保守结构域（图3）。利用在线工具进一步分析发现EsABI1蛋白第177～185个氨基酸为PP2C蛋白磷酸酶催化位点FFGVYDGHG，如图1、4中方框所示。
将盐芥EsABI1与拟南芥几种重要的PP2C蛋白氨基酸序列进行比对，发现盐芥EsABI1与这几种PP2C蛋白在氨基酸水平上具有较高的序列相似性，它们都含有包括PP2C蛋白磷酸酶活性催化位点在内的11个较保守的功能结构域，且这些保守区域都集中在氨基酸序列的中间到C端的区域（图4）。
2.2盐芥EsABI1的系统谱系分析
使用DNAMAN软件，将盐芥EsABI1氨基酸序列与多个物种的ABI1等PP2C蛋白的氨基酸序列進行比对分析，建立包括盐芥、拟南芥、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、山毛榉（Fagus sylvatica）、小麦（Triticum aestivum）和烟草（Nicotiana tabacum）等不同物种的PP2C类蛋白氨基酸序列的系谱分析图（图5），结果显示EsABI1与AtABI1属于进化上的同一分支，二者的亲缘关系最近，EsABI1与AtABI1、AtABI2、AtHAB1、AtHAB2同处于一个较大的分支，AtAHG3则另属于一个独立的分支。
2.3盐芥EsABI1沉默植株的获得
2.3.1盐芥EsABI1沉默载体的构建。以含EsABI1 cDNA的质粒为模板，用Pyrobest taq酶进行PCR反应，扩增后凝胶电泳分离得到218 bp左右的片段，Geneclean法回收PCR产物。BamH Ⅰ和Sma Ⅰ双酶切载体PINT4 （在pRT101中），连接EsABI1基因的反向片段，用EcoR Ⅰ和Pml Ⅰ双酶切上步的重组质粒，连入正向片段，阳性克隆可用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切检测；再用Hind Ⅲ酶切上步中的阳性克隆质粒和pCAMBIA3301载体，连接、转化，提质粒后用Hind Ⅲ酶切验证。构建成除草剂Basta为筛选标记的EsABI1∷pCAMBIA3301沉默载体（图6A）。
2.3.2盐芥EsABI1沉默株系的筛选。用Floral dipping[26]法进行盐芥野生型遗传转化，收获T1代种子；将转化后的T1
代种子种植到营养土中，在幼苗出土14 d后喷施0.2%Basta溶液。非转化苗在喷洒Basta溶液后开始黄化，并停止生长，7 d左右枯死；而抗性苗在喷洒Basta溶液后保持绿色（图6B）。
2.3.3盐芥EsABI1沉默株系的分子鉴定。将获得的盐芥EsABI1沉默植株，微量提取其基因组DNA；以转基因植株及对照植株的DNA为模板、Bar基因特异引物进行PCR扩增反应，结果发现，6株转基因盐芥植株可扩增出Bar基因的特异条带，大小约为500 bp，与预期一致；而野生型对照植株未出现阳性条带（图6C）。初步表明EsABI1∷pCAMBIA3301已整合到盐芥基因组中。
提取盐芥EsABI1 RNAi植株总RNA，反转录得到cDNA；选择盐芥EsActin2基因作为内标，定量PCR检测EsABI1基因的表达水平，结果发现，EsABI1 RNAi-1、2、3和4株系的EsABI1基因表达水平较对照均有不同程度的下降，分别为对照的0.581、 0.489、 0.617、0.446倍（图6D）。
2.4ABA处理下盐芥EsABI1沉默株系中EsABI1表达分析
对生长28 d的盐芥野生型植株进行以下处理：①200 mmol/L甘露醇模拟干旱处理9 h，EsABI1基因的表达水平约为对照（未处理）的7.50倍；②400 mmol/L NaCl处理24 h，EsABI1基因的表达水平约为对照的3.67倍；③4 ℃冷处理24 h，EsABI1基因的表达水平约为对照的2.20倍；④60 μmmol/L ABA处理12 h，EsABI1基因的表达水平约为对照的7.69倍。由此看出，EsABI1基因受干旱、NaCl、冷胁迫和ABA的诱导后表达上调，其中以干旱和ABA处理后的EsABI1表达上调最为显著[27]。
该试验使用60 μmol/L ABA均匀喷施于盐芥野生型、EsABI1 RNAi转基因株系2和4的叶片，分别在3、6 h后取样进行RNA的提取，以盐芥内源的EsActin2为内标、未作ABA处理的盐芥为对照，进行Realtime PCR检测分析，发现 60 μmol/L ABA处理3、6 h后，EsABI1 RNAi-2株系中EsABI1的表达水平分别为对照的4.09和5.10倍，EsABI1 RNAi-4株系中EsABI1的表达水平分别为对照的3.34和3.87倍；而盐芥野生型株系在60 μmol/L ABA处理3和6 h后EsABI1基因的表达水平为对照的1.55和2.79倍（图7）。其结果说明，ABA处理EsABI1基因沉默株系后，EsABI1的表达水平受外源ABA诱导后其上调程度大于野生型。 3討论
拟南芥的生物学和分子遗传学研究表明，PP2C蛋白磷酸酶是植物信号转导过程的关键因子，广泛参与脱落酸的各种信号途径，作为大多数信号途径的负调控因子。PP2C能与激酶、其他调控蛋白结合或直接与DNA 结合，调控相关基因的表达。目前，使用正、反向遗传学及生化分析等方法已在植物中鉴定了ABA信号通路的多种组分及ABA的多个作用靶点，特别是PP2C家族中ABI1、ABI2、AHG3、ATPP2CA和HAB1等蛋白活性、调控、基因表达及其与逆境胁迫关系的研究[27-30]，为深入探究ABA信号通路奠定了基础。
盐芥野生型在干旱、盐、冷和ABA处理下，EsABI1表达均有不同程度的上调，其中干旱和ABA处理下EsABI1表达水平的上调最明显，说明EsABI1基因的表达受以上胁迫的诱导，尤以干旱和ABA更敏感。对60 μmol/L ABA处理盐芥野生型和EsABI1基因沉默株系后3、6 h的定量检测发现，不论是盐芥野生型还是EsABI1沉默株系，其EsABI1的表达水平均受ABA的诱导而表达上调，而且EsABI1表达水平在ABA处理3、6 h后的上调较野生型均更为显著，说明盐芥EsABI1基因与拟南芥AtABI1基因一样，均是ABA信号转导途径中的负调控因子，可削弱植物对ABA的敏感性，进而在植物的生长发育及其对逆境胁迫的应答中起调控作用。
4结论
盐芥EsABI1基因是其ABA信号通路的负调控因子，可能在其耐逆功能中起到一定的作用。后续研究将探讨不同逆境胁迫下EsABI1基因表达水平的变化及其与下游互作蛋白间的关系，寻找ABA信号通路的新组分及其与盐芥耐逆性的关系。
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