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【摘 要】目的：本研究旨在建立一种快速准确的方法，用于乙肝患者拉米夫定治疗过程中的耐药突变的检测与监控。方法：通过运用通用模板和Taqman探针，我们建立了一种用于检测YMDD突变的实时PCR的方法，通过I反应，V反应，和对照组的C反应，可以检测到YIDD，YVDD突变，以及HBV的總量。当ΔCt <3.5时，即可确认突变存在。含有乙肝病毒聚合酶基因YMDD变异株的质粒经过梯度稀释，并进行检测验证。本研究对163例接受拉米夫定治疗的乙肝患者血清样本采用这种方法进行检测，结果与DNA测序法一致。 结果：检测范围可至103拷贝/ml，并且可以排除非特异性扩增。在163例样本中，有51例可以检测到耐药突变。 结论：这种通用模板实时PCR方法对于接受拉米夫定治疗乙肝患者的YMDD突变的定量是快速准确的，可以用于拉米夫定治疗前以及治疗过程中耐药突变的监控。
【关键词】HBV；YMDD；突变；UT-PCR
【文章编号】1004-7484（2014）05-2899-02
据估计，全世界约有3.5亿人感染慢性乙肝病毒，HBV是导致肝硬化，肝癌的主要原因，80%的肝癌由此引起。通过拉米夫定等抗病毒药物的运用，HBV已得到有效治疗。但是，长期单一治疗通常不能完全抑制病毒的复制，而会出现耐药突变，当YMDD突变为YIDD，YVDD时，就会发生拉米夫定耐药【1，2】。
耐药突变株的病毒聚合酶基因通过选择性扩增部分PCR片段后，扩增产物直接进行测序，可以被检测到。但是这种方法费用昂贵，操作繁琐，耗时间长，而且灵敏度低，通常只能检测20%的病毒量。其他的分子生物学技术，如RFLP技术，5’核酸酶杂交技术，线性探针杂交技术，肽核苷酸介导的PCR嵌入技术，寡核苷酸芯片技术，可以克服测序法的部分缺点，但是也很耗时且费用昂贵。最近对实时PCR技术的研究得到了定量的结果，但仍不能避免非特异性扩增【3，4】。
在本研究中，我们得到了一种快速、准确的可用于HBV中拉米夫定耐药突变的检测方法。这种方法基于实时PCR技术，采用通用模板，并设置了阳性对照和阴性对照来评估该方法的检测效果。
1 材料与方法
1.1 样本来源与HBV DNA提取
血清样本取自163例感染慢性乙肝，并且接受拉米夫定治疗1～2年的患者。该项研究符合医学伦理委员会的要求，并且也争得患者的同意。血清中HBV DNA的提取采用Qiagen的试剂盒。
1.2 引物与探针
本研究中采用的引物与探针如表1所示，两种不同的反向引物可以选择性扩增YVDD（rtM204V）和YIDD（rtM204I），针对聚合酶开放读框中的一段高度保守序列设计的通用引物可用于与反向引物一起区分两种不同的突变体。实时PCR技术通过连接引物的通用模板与Taqman探针粘连，可以检测到扩增产物，通用的正向引物用于所有特定序列扩增的参照，通用模板连接在每个引物上，如上文所述。简言之，通用模板序列长21bp，连接在YMDD突变体引物的5’端。通用模板的探针5’端用FAM标记，3’端用DABCYL标记，在退火阶段，通用模板探针与其引物特异性配对，引物的3’端与靶序列特异性配对，然后延伸，由于DNA聚合酶5’核酸外切酶的作用，杂交的通用模板探针被水解，导致报告基因与淬灭基因分离，产生荧光信号，这种荧光信号可以被ABI7000实时PCR系统检测到。
1.3 实时PCR
扩增在ABI7000上进行，反应体系是50ul，反应在50℃预热2分钟，95℃预热5分钟之后，按94℃20秒和55℃30秒的条件进行40个循环，反应体系包括下列组分：1×PCR缓冲液，引物和探针浓度均为100nmol/L，dATP、dGTP、dCTP、dUTP浓度均为400umol/L，Taq酶为1U，UNG酶为0.2U，MgCl2为3mmol/L，KCL为20mmol/L。采用复星诊断试剂可得到较好的扩增效果。YIDD和YVDD的突变体和HBV的总病毒在各自的反应中扩增，当ΔCt <3.5时，结果为阳性突变。（ΔCt =I反应或V反应的Ct- C反应的Ct ）。
1.4 DNA测序
HBV聚合酶基因C区序列的测序分析如以往所述。简言之，HBV DNA由血清样本提取后进行PCR扩增，扩增产物纯化后用ABI310测序仪进行测序。
2 结果
2.1 引物和探针的特异性
交错的模板和引物（野生型模板与突变型引物反应，突变型模板与野生型引物反应）用于验证结果的正确性。采用不同的浓度梯度108、106、104copies/mL，用交错的引物进行PCR扩增，在模板浓度为106和108 copies/m时，出现非特异性扩增，但在104 copies/mL时未出现非特异性扩增。而且非特异扩增与特异性扩增相差4个数量级以上，这与以往的研究结果一致。为排除非特异性扩增的影响，阳性结果根据ΔCt<3.5来判读。
2.2 检测灵敏度与检测下限
为确认检测的灵敏度，进行了质粒混合实验，突变体与野生型质粒混合，按照0：1，1：1，1：10，1：100，1：1000的比例，终浓度为105，106，107，108 copies/mL。在所有的混合物中，最低检测下限是103 copies/mL。
2.3 实时UT-PCR与测序方法的比较
163例接受拉米夫定治疗1～2年、HBV DNA阳性的乙肝患者血清采用UT-PCR检测来验证该方法的检验效果。样本检测时均设有阳性对照和阴性对照做参照。样本中有31%检测出YVDD（见图1）或YIDD突变（112例中有YMDD，21例中有YIDD，27例中YVDD，3例中有YIDD，YVDD共存）。接受治疗1年的患者中有19%发生了YMDD突变，接受治疗2年的患者中有40%发生YMDD突变。随机抽取15例样本进行测序，测序结果与实时UT-PCR检测结果一致（见表格2）。 3 討论
为了对拉米夫定治疗前及治疗过程中YMDD突变进行检测并量化结果，需要一种比测序法和RFLP更准确快速的方法。实时UT-PCR技术已经在大量病人中用于YMDD突变的检测，检测极限为103copies/mL的突变体，在105 copies/mL血清的混合病毒群体中，可检测出1%的突变，实时UT-PCR技术比测序法更灵敏。除此之外，检测结果通过突变管和对照管之间Ct值的差异可以很容易判读出来，而不需要定量标准【5，6】。
实时UT-PCR方法有两大主要优点：一是通用探针可以检测很多靶序列；二是与其他序列特异性荧光PCR技术相比，价格便宜【7，8】。本研究中检测不同YMDD突变采用的是针对各自靶DNA特异性引物和与通用模板互补的特异性探针。对于同时检测不同的序列，这种方法是经济便捷的。
本研究中接受拉米夫定治疗1年和2年的患者发生YMDD突变的比例分别是19%和40%，这与以往发表过的研究结果一致。在3例患者样本中发现有YIDD、YVDD混合突变。
本研究中用于检测rtM2041的引物是根据ATT序列设计的，所以检测不到ATG和ATC对应的基因序列，但是可以用如下方法加以改进来检测YIDD突变：向反应体系中添加特异于ATG和ATC序列的反向引物。
检测YMDD突变有多种实时PCR的方法，选择性引物已经使用过，本研究的最大优点在于突变结果可以很容易地由突变管和对照管之间Ct值的差异来确认，而不需增加额外定量标准品；而且，因为非特异性扩增与特异性扩增相差4个数量级以上，所以可以用ΔCt <3.5排除非特异性扩增，这样就减少了交叉反应引起偏差所带来的影响，但是这样确定的临界值会降低检测的灵敏度，这种实时UT-PCR对大规模临床诊断是经济、便捷的。
总而言之，本研究建立的实时PCR方法对于拉米夫定治疗前及治疗过程中耐药突变的检测是一种快速，准确的手段。
参考文献
[1] Leung NW， Lai Chang TT， Guan R， Lee CM， Ng KY， et al. Extended lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B enhances hepatitis B eantigen seroconversion rates： results after 3 years of therapy. Hepatology 2001； 33：1527-32.
[2] Hu KQ.A practical approach to management of chronic hepatitis B. Int J Med Sci 2005； 2：17-23.
[3] Allen MI， Deslauriers M， Andrews C， Tipples GA， Walters KA， Tyrrell DL， et al. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Lamivudine clinical investigation group. Hepatology 1998； 27：1670-7.
[4] Niesters HG， De Man RA， Pas SD， Fries E， Osterhaus AD， Identification of a new variant in the YMDD motif of the hepatitis B virus polymerase gene selected during lamivudine therapy. J Med Microbiol 2002； 51： 695-9.
[5] Pillier C， Castera L， Soulier A， Hezode C， Nordmann P， Dhumeaux D， et al. Dynamica of hepatitis B virus resistance to lamivudine. J Virol 2006； 80：643-53.
[6] Sablon E， Shapiro F. Advances in molecular diagnosis of HBV infection and drug resistance. Int J Med Sci 2005； 2：8-16.
[7] Cane PA， Cook P， Ratcliffe D， Mutimer D， Pillay D. Use of real-time PCR and fluorimetry to detect lamivudine resistance-associated mutations in hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chenother 1999； 43：1600-8.
[8] Bernard PS， Wittwer CT. Real-time PCR technologyfor cancer diagnostics. Clin Chem 2002； 48：1178-85.
【关键词】HBV；YMDD；突变；UT-PCR
【文章编号】1004-7484（2014）05-2899-02
据估计，全世界约有3.5亿人感染慢性乙肝病毒，HBV是导致肝硬化，肝癌的主要原因，80%的肝癌由此引起。通过拉米夫定等抗病毒药物的运用，HBV已得到有效治疗。但是，长期单一治疗通常不能完全抑制病毒的复制，而会出现耐药突变，当YMDD突变为YIDD，YVDD时，就会发生拉米夫定耐药【1，2】。
耐药突变株的病毒聚合酶基因通过选择性扩增部分PCR片段后，扩增产物直接进行测序，可以被检测到。但是这种方法费用昂贵，操作繁琐，耗时间长，而且灵敏度低，通常只能检测20%的病毒量。其他的分子生物学技术，如RFLP技术，5’核酸酶杂交技术，线性探针杂交技术，肽核苷酸介导的PCR嵌入技术，寡核苷酸芯片技术，可以克服测序法的部分缺点，但是也很耗时且费用昂贵。最近对实时PCR技术的研究得到了定量的结果，但仍不能避免非特异性扩增【3，4】。
在本研究中，我们得到了一种快速、准确的可用于HBV中拉米夫定耐药突变的检测方法。这种方法基于实时PCR技术，采用通用模板，并设置了阳性对照和阴性对照来评估该方法的检测效果。
1 材料与方法
1.1 样本来源与HBV DNA提取
血清样本取自163例感染慢性乙肝，并且接受拉米夫定治疗1～2年的患者。该项研究符合医学伦理委员会的要求，并且也争得患者的同意。血清中HBV DNA的提取采用Qiagen的试剂盒。
1.2 引物与探针
本研究中采用的引物与探针如表1所示，两种不同的反向引物可以选择性扩增YVDD（rtM204V）和YIDD（rtM204I），针对聚合酶开放读框中的一段高度保守序列设计的通用引物可用于与反向引物一起区分两种不同的突变体。实时PCR技术通过连接引物的通用模板与Taqman探针粘连，可以检测到扩增产物，通用的正向引物用于所有特定序列扩增的参照，通用模板连接在每个引物上，如上文所述。简言之，通用模板序列长21bp，连接在YMDD突变体引物的5’端。通用模板的探针5’端用FAM标记，3’端用DABCYL标记，在退火阶段，通用模板探针与其引物特异性配对，引物的3’端与靶序列特异性配对，然后延伸，由于DNA聚合酶5’核酸外切酶的作用，杂交的通用模板探针被水解，导致报告基因与淬灭基因分离，产生荧光信号，这种荧光信号可以被ABI7000实时PCR系统检测到。
1.3 实时PCR
扩增在ABI7000上进行，反应体系是50ul，反应在50℃预热2分钟，95℃预热5分钟之后，按94℃20秒和55℃30秒的条件进行40个循环，反应体系包括下列组分：1×PCR缓冲液，引物和探针浓度均为100nmol/L，dATP、dGTP、dCTP、dUTP浓度均为400umol/L，Taq酶为1U，UNG酶为0.2U，MgCl2为3mmol/L，KCL为20mmol/L。采用复星诊断试剂可得到较好的扩增效果。YIDD和YVDD的突变体和HBV的总病毒在各自的反应中扩增，当ΔCt <3.5时，结果为阳性突变。（ΔCt =I反应或V反应的Ct- C反应的Ct ）。
1.4 DNA测序
HBV聚合酶基因C区序列的测序分析如以往所述。简言之，HBV DNA由血清样本提取后进行PCR扩增，扩增产物纯化后用ABI310测序仪进行测序。
2 结果
2.1 引物和探针的特异性
交错的模板和引物（野生型模板与突变型引物反应，突变型模板与野生型引物反应）用于验证结果的正确性。采用不同的浓度梯度108、106、104copies/mL，用交错的引物进行PCR扩增，在模板浓度为106和108 copies/m时，出现非特异性扩增，但在104 copies/mL时未出现非特异性扩增。而且非特异扩增与特异性扩增相差4个数量级以上，这与以往的研究结果一致。为排除非特异性扩增的影响，阳性结果根据ΔCt<3.5来判读。
2.2 检测灵敏度与检测下限
为确认检测的灵敏度，进行了质粒混合实验，突变体与野生型质粒混合，按照0：1，1：1，1：10，1：100，1：1000的比例，终浓度为105，106，107，108 copies/mL。在所有的混合物中，最低检测下限是103 copies/mL。
2.3 实时UT-PCR与测序方法的比较
163例接受拉米夫定治疗1～2年、HBV DNA阳性的乙肝患者血清采用UT-PCR检测来验证该方法的检验效果。样本检测时均设有阳性对照和阴性对照做参照。样本中有31%检测出YVDD（见图1）或YIDD突变（112例中有YMDD，21例中有YIDD，27例中YVDD，3例中有YIDD，YVDD共存）。接受治疗1年的患者中有19%发生了YMDD突变，接受治疗2年的患者中有40%发生YMDD突变。随机抽取15例样本进行测序，测序结果与实时UT-PCR检测结果一致（见表格2）。 3 討论
为了对拉米夫定治疗前及治疗过程中YMDD突变进行检测并量化结果，需要一种比测序法和RFLP更准确快速的方法。实时UT-PCR技术已经在大量病人中用于YMDD突变的检测，检测极限为103copies/mL的突变体，在105 copies/mL血清的混合病毒群体中，可检测出1%的突变，实时UT-PCR技术比测序法更灵敏。除此之外，检测结果通过突变管和对照管之间Ct值的差异可以很容易判读出来，而不需要定量标准【5，6】。
实时UT-PCR方法有两大主要优点：一是通用探针可以检测很多靶序列；二是与其他序列特异性荧光PCR技术相比，价格便宜【7，8】。本研究中检测不同YMDD突变采用的是针对各自靶DNA特异性引物和与通用模板互补的特异性探针。对于同时检测不同的序列，这种方法是经济便捷的。
本研究中接受拉米夫定治疗1年和2年的患者发生YMDD突变的比例分别是19%和40%，这与以往发表过的研究结果一致。在3例患者样本中发现有YIDD、YVDD混合突变。
本研究中用于检测rtM2041的引物是根据ATT序列设计的，所以检测不到ATG和ATC对应的基因序列，但是可以用如下方法加以改进来检测YIDD突变：向反应体系中添加特异于ATG和ATC序列的反向引物。
检测YMDD突变有多种实时PCR的方法，选择性引物已经使用过，本研究的最大优点在于突变结果可以很容易地由突变管和对照管之间Ct值的差异来确认，而不需增加额外定量标准品；而且，因为非特异性扩增与特异性扩增相差4个数量级以上，所以可以用ΔCt <3.5排除非特异性扩增，这样就减少了交叉反应引起偏差所带来的影响，但是这样确定的临界值会降低检测的灵敏度，这种实时UT-PCR对大规模临床诊断是经济、便捷的。
总而言之，本研究建立的实时PCR方法对于拉米夫定治疗前及治疗过程中耐药突变的检测是一种快速，准确的手段。
参考文献
[1] Leung NW， Lai Chang TT， Guan R， Lee CM， Ng KY， et al. Extended lamivudine treatment in patients with chronic hepatitis B enhances hepatitis B eantigen seroconversion rates： results after 3 years of therapy. Hepatology 2001； 33：1527-32.
[2] Hu KQ.A practical approach to management of chronic hepatitis B. Int J Med Sci 2005； 2：17-23.
[3] Allen MI， Deslauriers M， Andrews C， Tipples GA， Walters KA， Tyrrell DL， et al. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Lamivudine clinical investigation group. Hepatology 1998； 27：1670-7.
[4] Niesters HG， De Man RA， Pas SD， Fries E， Osterhaus AD， Identification of a new variant in the YMDD motif of the hepatitis B virus polymerase gene selected during lamivudine therapy. J Med Microbiol 2002； 51： 695-9.
[5] Pillier C， Castera L， Soulier A， Hezode C， Nordmann P， Dhumeaux D， et al. Dynamica of hepatitis B virus resistance to lamivudine. J Virol 2006； 80：643-53.
[6] Sablon E， Shapiro F. Advances in molecular diagnosis of HBV infection and drug resistance. Int J Med Sci 2005； 2：8-16.
[7] Cane PA， Cook P， Ratcliffe D， Mutimer D， Pillay D. Use of real-time PCR and fluorimetry to detect lamivudine resistance-associated mutations in hepatitis B virus. Antimicrob Agents Chenother 1999； 43：1600-8.
[8] Bernard PS， Wittwer CT. Real-time PCR technologyfor cancer diagnostics. Clin Chem 2002； 48：1178-85.