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摘要：目的：旨在研究运动对AMPKα2三种不同基因状态鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC1-MEF2结合量的影响，以探讨运动提高骨骼肌MEF2-GLUT4 DNA结合活性的可能机制。方法：野生鼠，AMPKα2基因高表达和敲除鼠各20只，分别随机分为安静对照组和跑台运动组，运动时间均为1 h，跑台速度为20 m/min。运动后3 h取材。结果：野生鼠1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量显著减低，而PGC1和MEF2结合量显著升高；AMPKα2基因高表达及敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量与野生鼠相比均没有显著差异，AMPKα2基因高表达鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量显著高于野生鼠。结论：运动可能通过减少骨骼肌细胞核内MEF2和HDAC5结合量，并提高MEF2和PGC1的结合量而调节MEF2/GLUT4结合活性；AMPKα2参与调解运动诱导的MEF2/GLUT4的结合活性的增加并不是通过降低HDAC5和MEF2结合量实现的，而是通过提高PGC1与MEF2结合量增多而实现。
关键词：葡萄糖运载体4；肌细胞增强因子2；组蛋白去乙酰化酶5；过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1
中图分类号：G8047文献标识码：A文章编号：1007-3612（2012）10-0063-07
Effects of Exercises on the Association Volume of the Nuclear HDAC5/PGC1 Associated with MEF2 in Skeletal Muscle of AMPKα2-WT/KO/OE Mice
GONG Hao-jie1， XIE Jin2， ZHANG Nan2， ZHANG Ying2
（1. College of Physical Education， Henan Scientific and Technical University， Luoyang 471003， Henan China； 2. Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective： The effects of exercise on the content of MEF2–bound HDAC5/PGC1 were investigated in skeletal muscle of AMPKα2-WT/KO/OE mice to explore the possible mechanism of improving the association activity of the MEF2-GLUT4 DNA of skeletal muscle. Methods： Wild-type （WT； n=20）， AMPKα2 over-expression （OE； n=20） and knockout （KO； n=20） C57/BL mice were randomly subdivided into two groups： control group and exercise group. Mice were killed 3 h after treadmill running for 60 min at 20 m/min on the experimental day. Results： After one hour running exercise， MEF2–bound HDAC5 decreased， whereas MEF2–bound PGC1 increased in wild type mice. MEF2 bound HDAC5 was normal in α2-OE and α2-KO muscles after 1 hour exercise. MEF2-combined PGC1 in OE mice was higher than that in WT mice. Conclusion： Exercise increases binding of MEF2A binding by decreasing HDAC5-MEF2 complexes and increasing PGC1-MEF2 complexes； Exercise-induced AMPK activation increases the binding of MEF2A to the Glut4 promoter by a mechanism not involving the decreased nuclear HDAC5-MEF2 complexes， but involving the increased nuclear PGC-1 combined with MEF2.
Key words：GLUT4； MEF2； HDAC5；PGC1
肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）是葡萄糖运载体4（glucose transporter 4，GLUT4）蛋白转录过程的必需因子，MEF2通过和GLUT4启动子区域MEF2结合位点结合而开启GLUT4基因的转录[18，27，36]。大量研究表明运动同样通过提高MEF2/GLUT4结合活性而提高GLUT4的表达[21，33，34]。通过转基因和基因敲除技术，我们[1]前期的研究发现，一小时不同强度跑台运动后腺苷酸活化的蛋白激酶（5’-AMP activated protein kinase，AMPKα2）转基因鼠MEF2/GLUT4结合活性显著高于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠MEF2/GLUT4结合活性显著低于野生鼠，提示了AMPKα2参与调解了运动诱导的MEF2-GLUT4 DNA结合活性的提高，但机制尚不清楚。 有研究发现，组蛋白去乙酰化酶5（Histone deacetylase 5，HDAC5）可与MEF2发生特异性结合[19，24]，并通过改变真核细胞染色质基本结构，抑制MEF2和GLUT4 启动子区域DNA结合位点结合，抑制GLUT4转录。而过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1（ peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator1， PGC1）同样可以与MEF2发生特异性结合[16，28]，并通过招募核呼吸因子1（nuclear respiratory-1，NRF-1）等具有组蛋白乙酰化转移酶（histone acetyhransferases，HATs）活性的共同激活因子，促进MEF2和GLUT4启动子区域DNA结合位点结合，促进GLUT4的转录。利用纯化的AMPK孵育HDAC5蛋白或利用AMPK药物激活剂5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸（5’-aminoimidazole-4carboxamide-riboside，AICAR）刺激骨骼肌细胞[22]，均发现HDAC5 ser259和ser498位点磷酸化水平显著增加。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 亚家族成员P38，作为目前所发现及证实的PGC1上游激酶，对PGC1磷酸化水平有重要调节作用[14，17]，而它的活性同样受到AMPK的调节[23]。由于HDAC5的S295和S498位点的磷酸化，能够引起HDAC5与MEF2的分离[19]，而PGC1的磷酸化，能够引起PGC1和MEF2的结合[28]，推测AMPK可能通过调节HDAC5/PGC1和MEF2的结合量来影响MEF2-GLUT4 DNA结合活性。
本研究在我们以往研究的基础上[1]，进一步研究1 h跑台运动对AMPKα2转基因鼠和AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC1-MEF2结合量，核内HDAC5/PGC1以及总HDAC5蛋白含量的影响，以探讨运动提高骨骼肌细胞核内MEF2/GLUT4结合活性的可能机制。
1材料和方法
1.1实验对象C57BL/6J野生（Wild-type， WT）小鼠、AMPKα2基因高表达（over-expression， OE）和基因敲除鼠（Knockout， KO）各20只，分别随机分为安静对照（control， C）和跑台运动组（Exercise， E），共6组，每组10只[1，2]（表1）。
1.2运动方案和取材运动组小鼠采用跑台运动方式，跑台坡度为 0 角度，跑台速度为 20 m/min，运动时间为1 h[1]，并于运动后3 h取材后，-80℃保存备用[2]。
1.3指标测定
1.3.1HDAC5/PGC1蛋白表达量HDAC5和PGC1蛋白表达量采用免疫印迹（Western Blot）法，结果以实验组目的蛋白表达相对值与安静对照组目的蛋白表达相对值比值表示[1，2]。
1.3.2HDAC5/PGC1-MEF2结合量HDAC5/PGC1-MEF2结合量采用免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation，CoIP）测定，结果以实验组HDAC5/PGC1蛋白表达相对值与安静对照组HDAC5/PGC1蛋白表达相对值比值表示[4，5]。
1.4数据统计实验统计使用SPSS 13.0统计学分析软件完成，实验结果以平均数±标准差（Mean±SD）表示，显著性水平为P<0.05。
2实验结果
2.1总HDAC5蛋白相对表达量由图2看出：无论
图1总HDAC5蛋白表达图谱
图2总HDAC5蛋白相对表达量
是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞总HDAC5蛋白相对表达量与安静对照组相比均没有显著差异。无论是安静对照组还是跑台运动组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞总HDAC5蛋白相对表达量均没有出现显著差异。
2.2核内 HDAC5蛋白相对表达量由图4看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量与安静对照组相比均显著降低。安静对照组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量没有出现显著差异，1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量显著低于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量与野生鼠没有显著差异。
图3核内HDAC5蛋白表达图谱
图4核内HDAC5蛋白相对表达量
注：与安静对照组比较，*P<0.05。与野生鼠比较，#P<0.05。
2.3HDAC5-MEF2结合量由图6看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内HDAC5-MEF2结合量与安静对照组相比均显著降低。无论是安静对照组，还是跑台运动组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内HDAC5-MEF2结合量均没有出现显著差异。
图5HDAC5-MEF2蛋白表达图谱
图6HDAC5-MEF2结合量
注：与安静对照组比较，*P<0.05。
2.4核内 PGC1蛋白相对表达量由图8看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内PGC1蛋白相对表达量与安静对照组相比均没有显著差异。无论是安静对照组还是跑台运动组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内PGC1蛋白相对表达量均没有出现显著差异。
图7核内PGC1蛋白表达图谱 图8核内PGC1蛋白相对表达量
2.5PGC1-MEF2结合量由图10看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内 PGC1-MEF2结合量与安静对照组相比均显著升高。安静对照组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2结合量没有出现显著差异，1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2结合量显著高于野生鼠，而AMPK α2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2结合量与野生鼠没有显著差异。
图9PGC1-MEF2蛋白表达图谱
图10PGC1-MEF2结合量
注：与安静对照组比较，*P<0.05。与野生鼠比较，#P<0.05。
3分析讨论
3.1运动对野生鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC-MEF2结合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影响研究显示，基础状态下，HDAC5和MEF2结合在一起，并抑制MEF2对靶基因的转录[17，22]。尽管HDAC5能抑制MEF2与靶基因DNA的结合，但HDAC5并不是直接连接到MEF2靶基因DNA上[23]。HDAC5通过对真核细胞染色质基本结构单位核小体组蛋白赖氨酸侧链的去乙酰化，并与原本带负电荷的核小体DNA主链紧密结合形成致密的核小体结构，这种致密的核小体结构阻碍了MEF2作为转录因子结合在靶基因启动子区域DNA结合位点开启基因转录的通路，从而抑制转录[26]。HDAC5的活性与其磷酸化水平高度正相关，特别是HDAC5的S295和S498位点的磷酸化，能够引起HDAC5与MEF2分离，并通过与14-3-3蛋白伴侣结合后转移出核，解除对转录因子的活性抑制[12，15]。
随着HDAC5的分离，染色质去乙酰化状态必须恢复到乙酰化状态，这一过程需要HATs参与[23，26]。HATs能使真核细胞染色质基本结构单位核小体组蛋白赖氨酸残基侧链重新乙酰化[23]，从而解除组蛋白和DNA骨架的致密结合，暴露转录因子启动子结合区域，使转录因子能够顺利的与之结合，促进转录的进行[26]。研究显示HATs是主要受PGC1通路的影响[32]，基础状态下，由于PGC1和抑制蛋白结合，抑制了对靶基因转录的调节作用[14，17]。PGC1的活性同样与其磷酸化水平高度正相关，当PGC1被其上游激酶磷酸化后，能够引起PGC1和抑制蛋白的分离[14，17]并与转录因子（如MEF2）结合[13]，之后通过招募NRF1等具有HATs活性的共同激活因子完成对转录因子依赖型基因转录的调节[16，28]。
利用GLUT4荧光素酶报告基因（该片段包含MEF2结合位点）转染人体骨骼肌细胞[22]，发现如果共转染MEF2质粒，荧光霉素活性显著增加；如果共转MEF2和HDAC5 质粒，荧光素酶活性增加并不显著，提示了HDAC5抑制转录因子MEF2对GLUT4基因的转录活性；而如果共转染MEF2和PGC1质粒[11]，荧光霉素活性比单纯转染MFE2质粒增加更为显著，提示了PGC1加强了转录因子MEF2对GLUT4基因的转录活性。如前所述，HDAC5和PGC1作为调节MEF2对目标基因转录的重要调节因子，它们必须与MEF2结合发挥作用，运动能够引起MEF2对GLUT4基因转录活性的增加[21，33，34]，那么运动对HDAC5/PGC1和MFE2结合量会产生什么影响呢？
本实验研究发现野生鼠1 h跑台运动后骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量显著减低，而PGC1和MEF2结合量显著升高，提示了适当强度的一次运动可以引起骨骼肌细胞核内MEF2与HDAC5的分离及与PGC1的结合。研究进一步发现运动后骨骼肌细胞核内HDAC5含量显著降低的同时，细胞总HDAC5含量却没有显著变化，与以往离体研究结果[12，15]相一致，推测运动引起的从MEF2-HDAC5复合体上分离出来的HDAC5同样并不是残留在细胞核内而是转运出核。以往离体研究结果显示，基础状态下细胞核内PGC1与抑制蛋白相结合，当PGC1被激活之后，细胞核内PGC1与抑制蛋白分离，并在细胞核内与MEF2结合，促进基因转录[14，17]。本实验虽然没有测定PGC1与抑制蛋白结合量的多少，但实验发现野生鼠1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内PGC1和MEF2结合量显著升高的同时，骨骼肌细胞核内PGC1含量并没有显著变化，同样提示了和HDAC5结合的PGC1来源于细胞核内部，是细胞核内部PGC1蛋白重新分布的结果。
3.2运动对AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC-MEF2结合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影响运动能够引起MEF2与HDAC5的分离及与PGC1的结合，但机制尚不清楚。体外实验显示，利用纯化的AMPK孵育HDAC5蛋白[22]，HDAC5磷酸化水平显著增加，而如果突变HDAC5蛋白Ser-259和Ser-498位点，HDAC5磷酸化水平则显著降低。如前所述，HDAC5的S295和S498位点的磷酸化，能够引起HDAC5与MEF2分离，并通过与14-3-3蛋白伴侣结合后转移出核，解除对转录因子的活性抑制[12，15]，提示了AMPK对骨骼肌细胞核内HDAC5和MEF2的结合量以及核内HDAC5含量有重要调节作用。这一发现在骨骼肌细胞中得到了进一步证实，利用AMPK药物激活剂AICAR刺激骨骼肌细胞[22]，发现HDAC5 ser259和ser498位点磷酸化均显著增加，细胞核内HDAC5蛋白显著降低，且细胞内总HDAC5蛋白含量没有变化。
关于PGC1和MEF2结合是否受AMPK的直接调节目前尚不清楚，但有研究显示AMPK可以激活PGC1的上游激酶P38[5，14]。作为目前所发现及证实的PGC1上游激酶，P38的激活可以引起PGC1磷酸化水平的显著增高[14，17]。如前所述，PGC1被磷酸化后，能够引起PGC1和抑制蛋白的分离并与MEF2结合，之后通过招募NRF1等具有HATs活性的共同激活因子完成对转录因子依赖型基因转录的调节[28]。由于运动同样激活AMPK[10，35]，这些结果提示了AMPK可能同样参与了运动引起的骨骼肌细胞核内PGC1和MEF2结合量的增加。然而值得注意的是，以上结果只是从离体实验中得出，其不一定能真实地反映在体骨骼肌细胞内转录调控蛋白之间的结合的状况，提示了这些结果具有一定的局限性。 1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量与野生鼠相比没有显著差异，则提示了AMPKα2可能对运动诱导的HDAC5和MEF2的分离并不起主要作用。虽然以往有离体实验研究显示AMPK对HDAC5有磷酸化作用，但相对于在体实验而言，AICAR只是单一的运动模拟信号，远没有在体情况下运动对机体的刺激作用复杂[8，38]。另外，即使是离体实验研究，也只研究了AMPK对HDAC5的调节作用，尚未深入到对AMPKα1和α2亚基对HDAC5调节作用的研究[22]，并不能排除AMPKα1亚基对HDAC5的调节效果更显著的可能，总之可以肯定的是AMPKα2并未对运动诱导的HDAC5-MEF2复合物分解以及HDAC5的转移出核发挥决定性作用。而本研究发现1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量显著高于野生鼠，这个结果与我们实验假设相一致，提示AMPKα2参与调解了运动诱导的PGC1和MEF2的结合量的增加。
AMPKα2转基因鼠，1 h跑台运动后，HDAC5总蛋白与野生鼠相比没有显著差异，而骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白含量显著低于野生鼠，其原因尚不明确。有研究显示HDAC5作为转录共抑制因子，除作用于转录因子MEF2以外还有其他转录因子[9]，如在真核生物发育过程中起重要作用的碱性螺旋-环-螺旋转录因子（Basic helix-loop-helix，BHLH）。因此我们可以推测运动可能不仅减少了HDAC5与MEF2的结合，也减少了HDAC5与其他转录因子的结合。由于AMPKα2的转基因，引起HDAC5和其他转录因子结合量下降及转移出核量更为显著，导致了其核内HDAC5蛋白含量显著低于野生鼠，具体机制尚待研究发现。另外本研究中1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1量显著与野生鼠相比没有显著差异，则进一步提示了与MEF2结合的PGC1并不是来源于细胞核外部，是细胞核内部PGC1重新分布的结果。
3.3运动对AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC-MEF2结合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影响本研究中1 h跑台运动后，AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量，核内HDAC5以及总HDAC5蛋白含量，与野生鼠相比均没有显著差异，则进一步提示了运动诱导的HDAC5和MEF2分离并出核并非通过AMPKα2调节。钙/钙调素依赖性蛋白激酶（Calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CAMK）是一类广泛分布的丝/苏氨酸蛋白激酶家族，早期研究显示，CAMKⅠ和Ⅳ亚型对HDAC5的ser-259和ser-498位点有磷酸化作用，并能促使HDAC5与MEF2分离并与其伴侣蛋白14-3-3结合并转移出细胞核[24，25]。但后来的研究显示CAMKⅠ和Ⅳ在骨骼肌细胞中并不表达[20，29]。Johannes Backs等的[6，7]研究发现，主要存在于骨骼肌中的CAMKⅡ，虽然并不能直接磷酸化HDAC5，但CAMKⅡ可与HDAC4结合并对其有磷酸化作用，而HDAC5在细胞内则是通过N末端结构保守的螺旋状区域与HDAC4形成二聚体，当HDAC4被CAMKⅡ磷酸化的同时，HDAC4也将这一信号传递给HDAC5，即HDAC5通过HDAC4被CAMKⅡ间接磷酸化。
值得注意的是CaMKⅡ对HDAC5的间接磷酸化作用是在心肌肥大模型中发现的，对于骨骼肌细胞是否同样有此作用还有待进一步研究。另有研究显示与CAMK 结构催化区具有高度序列同源性的蛋白激酶D（Protein Kinase D，PKD）也参与细胞核内对HDAC5和MEF2结合的调控作用[37]。PKD可被蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）激活，而PKD被激活之后则能直接磷酸化HDAC5与其伴侣蛋白14-3-3的结合位点，促进HDAC5与之结合后转移出核[37]。由于PKD与CAMKⅡ的高度系列同源性，再加上这两条通路对HDAC5的作用位点相同[9，31]，推测这两条通路很可能同时竞争性的参与了HDAC5与转录因子的结合以及其核内外定位。运动同样激活CAMK和PKC-PKD通路[29，30]，提示了CAMK和PKC-PKD通路，同样参与调节了运动诱导的HDAC5和MEF2的分离。总之，运动对骨骼肌HDAC5的调节是个复杂的过程，本实验中小鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与转录因子MEF2的分离以及转移出核，可能是通过AMPKα1、CAMKⅡ、PKD中的一条或几条通路共同作用的结果，而并非通过AMPKα2途径调节，具体机制有待进一步研究。
本研究中1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量显著高于野生鼠，但AMPKα2基因敲除小鼠1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2的结合量相对野生小鼠没有显著性变化，提示了虽然AMPKα2参与调解了运动诱导的PGC1和MEF2的结合量的增加，但机体还存在有其他的代偿机制。事实上，p38作为PGC1的上游激酶，AMPK的转基因虽然可以引起P38磷酸化水平显著升高，但AMPKα2基因敲除同样没有影响p38的磷酸化水平[3]，因此我们推测，由于AMPKα2的缺失，机体存在的调节P38的其他代偿机制（具体见我们实验室贺强等的研究[3]）可能代偿了AMPKα2对P38的调节作用，导致了AMPKα2基因敲除没有影响运动后骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2的结合量的变化，具体机制有待进一步研究发现。
4结论
通过转基因和基因敲除技术，我们以往的研究[1]发现，一小时不同强度跑台运动后，野生鼠MEF2/GLUT4结合活性显著升高，AMPKα2转基因鼠MEF2/GLUT4结合活性显著高于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠MEF2/GLUT4结合活性显著低于野生鼠，提示了AMPKα2参与调解了运动诱导的MEF2-GLUT4 DNA结合活性的提高。 HDAC5和PGC1作为影响MEF2对GLUT4基因转录活性的主要调节因子，本实验通过研究运动对AMPKα2三种不同基因状态鼠骨骼肌细胞核内HDAC5 /PGC1-MEF2结合量的影响，发现：
1）1 h跑台运动后，野生鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量显著减低，PGC1和MEF2结合量显著升高，提示了运动可能通过减少骨骼肌细胞核内MEF2和HDAC5结合量，并提高MEF2和PGC1的结合量而调节MEF2/GLUT4 DNA结合活性；
2）1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠及AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量与野生鼠相比均没有显著差异，则提示了AMPKα2参与调解运动诱导的MEF2/GLUT4的结合活性的增加并不是主要通过影响骨骼肌细胞核内HDAC5和MEF2结合量实现的；
3）1 h跑台运动后，虽然AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量与野生鼠相比没有显著差异，但AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量显著高于野生鼠，则提示了“运动-AMPKα2激活-PGC1与MEF2结合量增多-MEF2/GLUT4 DNA活性升高”这一通路的存在。
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关键词：葡萄糖运载体4；肌细胞增强因子2；组蛋白去乙酰化酶5；过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1
中图分类号：G8047文献标识码：A文章编号：1007-3612（2012）10-0063-07
Effects of Exercises on the Association Volume of the Nuclear HDAC5/PGC1 Associated with MEF2 in Skeletal Muscle of AMPKα2-WT/KO/OE Mice
GONG Hao-jie1， XIE Jin2， ZHANG Nan2， ZHANG Ying2
（1. College of Physical Education， Henan Scientific and Technical University， Luoyang 471003， Henan China； 2. Beijing Sport University， Beijing 100084， China）
Abstract：Objective： The effects of exercise on the content of MEF2–bound HDAC5/PGC1 were investigated in skeletal muscle of AMPKα2-WT/KO/OE mice to explore the possible mechanism of improving the association activity of the MEF2-GLUT4 DNA of skeletal muscle. Methods： Wild-type （WT； n=20）， AMPKα2 over-expression （OE； n=20） and knockout （KO； n=20） C57/BL mice were randomly subdivided into two groups： control group and exercise group. Mice were killed 3 h after treadmill running for 60 min at 20 m/min on the experimental day. Results： After one hour running exercise， MEF2–bound HDAC5 decreased， whereas MEF2–bound PGC1 increased in wild type mice. MEF2 bound HDAC5 was normal in α2-OE and α2-KO muscles after 1 hour exercise. MEF2-combined PGC1 in OE mice was higher than that in WT mice. Conclusion： Exercise increases binding of MEF2A binding by decreasing HDAC5-MEF2 complexes and increasing PGC1-MEF2 complexes； Exercise-induced AMPK activation increases the binding of MEF2A to the Glut4 promoter by a mechanism not involving the decreased nuclear HDAC5-MEF2 complexes， but involving the increased nuclear PGC-1 combined with MEF2.
Key words：GLUT4； MEF2； HDAC5；PGC1
肌细胞增强因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）是葡萄糖运载体4（glucose transporter 4，GLUT4）蛋白转录过程的必需因子，MEF2通过和GLUT4启动子区域MEF2结合位点结合而开启GLUT4基因的转录[18，27，36]。大量研究表明运动同样通过提高MEF2/GLUT4结合活性而提高GLUT4的表达[21，33，34]。通过转基因和基因敲除技术，我们[1]前期的研究发现，一小时不同强度跑台运动后腺苷酸活化的蛋白激酶（5’-AMP activated protein kinase，AMPKα2）转基因鼠MEF2/GLUT4结合活性显著高于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠MEF2/GLUT4结合活性显著低于野生鼠，提示了AMPKα2参与调解了运动诱导的MEF2-GLUT4 DNA结合活性的提高，但机制尚不清楚。 有研究发现，组蛋白去乙酰化酶5（Histone deacetylase 5，HDAC5）可与MEF2发生特异性结合[19，24]，并通过改变真核细胞染色质基本结构，抑制MEF2和GLUT4 启动子区域DNA结合位点结合，抑制GLUT4转录。而过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1（ peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator1， PGC1）同样可以与MEF2发生特异性结合[16，28]，并通过招募核呼吸因子1（nuclear respiratory-1，NRF-1）等具有组蛋白乙酰化转移酶（histone acetyhransferases，HATs）活性的共同激活因子，促进MEF2和GLUT4启动子区域DNA结合位点结合，促进GLUT4的转录。利用纯化的AMPK孵育HDAC5蛋白或利用AMPK药物激活剂5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸（5’-aminoimidazole-4carboxamide-riboside，AICAR）刺激骨骼肌细胞[22]，均发现HDAC5 ser259和ser498位点磷酸化水平显著增加。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 亚家族成员P38，作为目前所发现及证实的PGC1上游激酶，对PGC1磷酸化水平有重要调节作用[14，17]，而它的活性同样受到AMPK的调节[23]。由于HDAC5的S295和S498位点的磷酸化，能够引起HDAC5与MEF2的分离[19]，而PGC1的磷酸化，能够引起PGC1和MEF2的结合[28]，推测AMPK可能通过调节HDAC5/PGC1和MEF2的结合量来影响MEF2-GLUT4 DNA结合活性。
本研究在我们以往研究的基础上[1]，进一步研究1 h跑台运动对AMPKα2转基因鼠和AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC1-MEF2结合量，核内HDAC5/PGC1以及总HDAC5蛋白含量的影响，以探讨运动提高骨骼肌细胞核内MEF2/GLUT4结合活性的可能机制。
1材料和方法
1.1实验对象C57BL/6J野生（Wild-type， WT）小鼠、AMPKα2基因高表达（over-expression， OE）和基因敲除鼠（Knockout， KO）各20只，分别随机分为安静对照（control， C）和跑台运动组（Exercise， E），共6组，每组10只[1，2]（表1）。
1.2运动方案和取材运动组小鼠采用跑台运动方式，跑台坡度为 0 角度，跑台速度为 20 m/min，运动时间为1 h[1]，并于运动后3 h取材后，-80℃保存备用[2]。
1.3指标测定
1.3.1HDAC5/PGC1蛋白表达量HDAC5和PGC1蛋白表达量采用免疫印迹（Western Blot）法，结果以实验组目的蛋白表达相对值与安静对照组目的蛋白表达相对值比值表示[1，2]。
1.3.2HDAC5/PGC1-MEF2结合量HDAC5/PGC1-MEF2结合量采用免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation，CoIP）测定，结果以实验组HDAC5/PGC1蛋白表达相对值与安静对照组HDAC5/PGC1蛋白表达相对值比值表示[4，5]。
1.4数据统计实验统计使用SPSS 13.0统计学分析软件完成，实验结果以平均数±标准差（Mean±SD）表示，显著性水平为P<0.05。
2实验结果
2.1总HDAC5蛋白相对表达量由图2看出：无论
图1总HDAC5蛋白表达图谱
图2总HDAC5蛋白相对表达量
是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞总HDAC5蛋白相对表达量与安静对照组相比均没有显著差异。无论是安静对照组还是跑台运动组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞总HDAC5蛋白相对表达量均没有出现显著差异。
2.2核内 HDAC5蛋白相对表达量由图4看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量与安静对照组相比均显著降低。安静对照组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量没有出现显著差异，1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量显著低于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白相对表达量与野生鼠没有显著差异。
图3核内HDAC5蛋白表达图谱
图4核内HDAC5蛋白相对表达量
注：与安静对照组比较，*P<0.05。与野生鼠比较，#P<0.05。
2.3HDAC5-MEF2结合量由图6看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内HDAC5-MEF2结合量与安静对照组相比均显著降低。无论是安静对照组，还是跑台运动组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内HDAC5-MEF2结合量均没有出现显著差异。
图5HDAC5-MEF2蛋白表达图谱
图6HDAC5-MEF2结合量
注：与安静对照组比较，*P<0.05。
2.4核内 PGC1蛋白相对表达量由图8看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内PGC1蛋白相对表达量与安静对照组相比均没有显著差异。无论是安静对照组还是跑台运动组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内PGC1蛋白相对表达量均没有出现显著差异。
图7核内PGC1蛋白表达图谱 图8核内PGC1蛋白相对表达量
2.5PGC1-MEF2结合量由图10看出：无论是野生鼠，AMPKα2高表达鼠，还是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内 PGC1-MEF2结合量与安静对照组相比均显著升高。安静对照组，AMPKα2三种不同基因状态鼠相比，骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2结合量没有出现显著差异，1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2结合量显著高于野生鼠，而AMPK α2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2结合量与野生鼠没有显著差异。
图9PGC1-MEF2蛋白表达图谱
图10PGC1-MEF2结合量
注：与安静对照组比较，*P<0.05。与野生鼠比较，#P<0.05。
3分析讨论
3.1运动对野生鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC-MEF2结合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影响研究显示，基础状态下，HDAC5和MEF2结合在一起，并抑制MEF2对靶基因的转录[17，22]。尽管HDAC5能抑制MEF2与靶基因DNA的结合，但HDAC5并不是直接连接到MEF2靶基因DNA上[23]。HDAC5通过对真核细胞染色质基本结构单位核小体组蛋白赖氨酸侧链的去乙酰化，并与原本带负电荷的核小体DNA主链紧密结合形成致密的核小体结构，这种致密的核小体结构阻碍了MEF2作为转录因子结合在靶基因启动子区域DNA结合位点开启基因转录的通路，从而抑制转录[26]。HDAC5的活性与其磷酸化水平高度正相关，特别是HDAC5的S295和S498位点的磷酸化，能够引起HDAC5与MEF2分离，并通过与14-3-3蛋白伴侣结合后转移出核，解除对转录因子的活性抑制[12，15]。
随着HDAC5的分离，染色质去乙酰化状态必须恢复到乙酰化状态，这一过程需要HATs参与[23，26]。HATs能使真核细胞染色质基本结构单位核小体组蛋白赖氨酸残基侧链重新乙酰化[23]，从而解除组蛋白和DNA骨架的致密结合，暴露转录因子启动子结合区域，使转录因子能够顺利的与之结合，促进转录的进行[26]。研究显示HATs是主要受PGC1通路的影响[32]，基础状态下，由于PGC1和抑制蛋白结合，抑制了对靶基因转录的调节作用[14，17]。PGC1的活性同样与其磷酸化水平高度正相关，当PGC1被其上游激酶磷酸化后，能够引起PGC1和抑制蛋白的分离[14，17]并与转录因子（如MEF2）结合[13]，之后通过招募NRF1等具有HATs活性的共同激活因子完成对转录因子依赖型基因转录的调节[16，28]。
利用GLUT4荧光素酶报告基因（该片段包含MEF2结合位点）转染人体骨骼肌细胞[22]，发现如果共转染MEF2质粒，荧光霉素活性显著增加；如果共转MEF2和HDAC5 质粒，荧光素酶活性增加并不显著，提示了HDAC5抑制转录因子MEF2对GLUT4基因的转录活性；而如果共转染MEF2和PGC1质粒[11]，荧光霉素活性比单纯转染MFE2质粒增加更为显著，提示了PGC1加强了转录因子MEF2对GLUT4基因的转录活性。如前所述，HDAC5和PGC1作为调节MEF2对目标基因转录的重要调节因子，它们必须与MEF2结合发挥作用，运动能够引起MEF2对GLUT4基因转录活性的增加[21，33，34]，那么运动对HDAC5/PGC1和MFE2结合量会产生什么影响呢？
本实验研究发现野生鼠1 h跑台运动后骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量显著减低，而PGC1和MEF2结合量显著升高，提示了适当强度的一次运动可以引起骨骼肌细胞核内MEF2与HDAC5的分离及与PGC1的结合。研究进一步发现运动后骨骼肌细胞核内HDAC5含量显著降低的同时，细胞总HDAC5含量却没有显著变化，与以往离体研究结果[12，15]相一致，推测运动引起的从MEF2-HDAC5复合体上分离出来的HDAC5同样并不是残留在细胞核内而是转运出核。以往离体研究结果显示，基础状态下细胞核内PGC1与抑制蛋白相结合，当PGC1被激活之后，细胞核内PGC1与抑制蛋白分离，并在细胞核内与MEF2结合，促进基因转录[14，17]。本实验虽然没有测定PGC1与抑制蛋白结合量的多少，但实验发现野生鼠1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内PGC1和MEF2结合量显著升高的同时，骨骼肌细胞核内PGC1含量并没有显著变化，同样提示了和HDAC5结合的PGC1来源于细胞核内部，是细胞核内部PGC1蛋白重新分布的结果。
3.2运动对AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC-MEF2结合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影响运动能够引起MEF2与HDAC5的分离及与PGC1的结合，但机制尚不清楚。体外实验显示，利用纯化的AMPK孵育HDAC5蛋白[22]，HDAC5磷酸化水平显著增加，而如果突变HDAC5蛋白Ser-259和Ser-498位点，HDAC5磷酸化水平则显著降低。如前所述，HDAC5的S295和S498位点的磷酸化，能够引起HDAC5与MEF2分离，并通过与14-3-3蛋白伴侣结合后转移出核，解除对转录因子的活性抑制[12，15]，提示了AMPK对骨骼肌细胞核内HDAC5和MEF2的结合量以及核内HDAC5含量有重要调节作用。这一发现在骨骼肌细胞中得到了进一步证实，利用AMPK药物激活剂AICAR刺激骨骼肌细胞[22]，发现HDAC5 ser259和ser498位点磷酸化均显著增加，细胞核内HDAC5蛋白显著降低，且细胞内总HDAC5蛋白含量没有变化。
关于PGC1和MEF2结合是否受AMPK的直接调节目前尚不清楚，但有研究显示AMPK可以激活PGC1的上游激酶P38[5，14]。作为目前所发现及证实的PGC1上游激酶，P38的激活可以引起PGC1磷酸化水平的显著增高[14，17]。如前所述，PGC1被磷酸化后，能够引起PGC1和抑制蛋白的分离并与MEF2结合，之后通过招募NRF1等具有HATs活性的共同激活因子完成对转录因子依赖型基因转录的调节[28]。由于运动同样激活AMPK[10，35]，这些结果提示了AMPK可能同样参与了运动引起的骨骼肌细胞核内PGC1和MEF2结合量的增加。然而值得注意的是，以上结果只是从离体实验中得出，其不一定能真实地反映在体骨骼肌细胞内转录调控蛋白之间的结合的状况，提示了这些结果具有一定的局限性。 1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量与野生鼠相比没有显著差异，则提示了AMPKα2可能对运动诱导的HDAC5和MEF2的分离并不起主要作用。虽然以往有离体实验研究显示AMPK对HDAC5有磷酸化作用，但相对于在体实验而言，AICAR只是单一的运动模拟信号，远没有在体情况下运动对机体的刺激作用复杂[8，38]。另外，即使是离体实验研究，也只研究了AMPK对HDAC5的调节作用，尚未深入到对AMPKα1和α2亚基对HDAC5调节作用的研究[22]，并不能排除AMPKα1亚基对HDAC5的调节效果更显著的可能，总之可以肯定的是AMPKα2并未对运动诱导的HDAC5-MEF2复合物分解以及HDAC5的转移出核发挥决定性作用。而本研究发现1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量显著高于野生鼠，这个结果与我们实验假设相一致，提示AMPKα2参与调解了运动诱导的PGC1和MEF2的结合量的增加。
AMPKα2转基因鼠，1 h跑台运动后，HDAC5总蛋白与野生鼠相比没有显著差异，而骨骼肌细胞核内HDAC5蛋白含量显著低于野生鼠，其原因尚不明确。有研究显示HDAC5作为转录共抑制因子，除作用于转录因子MEF2以外还有其他转录因子[9]，如在真核生物发育过程中起重要作用的碱性螺旋-环-螺旋转录因子（Basic helix-loop-helix，BHLH）。因此我们可以推测运动可能不仅减少了HDAC5与MEF2的结合，也减少了HDAC5与其他转录因子的结合。由于AMPKα2的转基因，引起HDAC5和其他转录因子结合量下降及转移出核量更为显著，导致了其核内HDAC5蛋白含量显著低于野生鼠，具体机制尚待研究发现。另外本研究中1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1量显著与野生鼠相比没有显著差异，则进一步提示了与MEF2结合的PGC1并不是来源于细胞核外部，是细胞核内部PGC1重新分布的结果。
3.3运动对AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5/PGC-MEF2结合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影响本研究中1 h跑台运动后，AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量，核内HDAC5以及总HDAC5蛋白含量，与野生鼠相比均没有显著差异，则进一步提示了运动诱导的HDAC5和MEF2分离并出核并非通过AMPKα2调节。钙/钙调素依赖性蛋白激酶（Calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CAMK）是一类广泛分布的丝/苏氨酸蛋白激酶家族，早期研究显示，CAMKⅠ和Ⅳ亚型对HDAC5的ser-259和ser-498位点有磷酸化作用，并能促使HDAC5与MEF2分离并与其伴侣蛋白14-3-3结合并转移出细胞核[24，25]。但后来的研究显示CAMKⅠ和Ⅳ在骨骼肌细胞中并不表达[20，29]。Johannes Backs等的[6，7]研究发现，主要存在于骨骼肌中的CAMKⅡ，虽然并不能直接磷酸化HDAC5，但CAMKⅡ可与HDAC4结合并对其有磷酸化作用，而HDAC5在细胞内则是通过N末端结构保守的螺旋状区域与HDAC4形成二聚体，当HDAC4被CAMKⅡ磷酸化的同时，HDAC4也将这一信号传递给HDAC5，即HDAC5通过HDAC4被CAMKⅡ间接磷酸化。
值得注意的是CaMKⅡ对HDAC5的间接磷酸化作用是在心肌肥大模型中发现的，对于骨骼肌细胞是否同样有此作用还有待进一步研究。另有研究显示与CAMK 结构催化区具有高度序列同源性的蛋白激酶D（Protein Kinase D，PKD）也参与细胞核内对HDAC5和MEF2结合的调控作用[37]。PKD可被蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）激活，而PKD被激活之后则能直接磷酸化HDAC5与其伴侣蛋白14-3-3的结合位点，促进HDAC5与之结合后转移出核[37]。由于PKD与CAMKⅡ的高度系列同源性，再加上这两条通路对HDAC5的作用位点相同[9，31]，推测这两条通路很可能同时竞争性的参与了HDAC5与转录因子的结合以及其核内外定位。运动同样激活CAMK和PKC-PKD通路[29，30]，提示了CAMK和PKC-PKD通路，同样参与调节了运动诱导的HDAC5和MEF2的分离。总之，运动对骨骼肌HDAC5的调节是个复杂的过程，本实验中小鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与转录因子MEF2的分离以及转移出核，可能是通过AMPKα1、CAMKⅡ、PKD中的一条或几条通路共同作用的结果，而并非通过AMPKα2途径调节，具体机制有待进一步研究。
本研究中1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量显著高于野生鼠，但AMPKα2基因敲除小鼠1 h跑台运动后，骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2的结合量相对野生小鼠没有显著性变化，提示了虽然AMPKα2参与调解了运动诱导的PGC1和MEF2的结合量的增加，但机体还存在有其他的代偿机制。事实上，p38作为PGC1的上游激酶，AMPK的转基因虽然可以引起P38磷酸化水平显著升高，但AMPKα2基因敲除同样没有影响p38的磷酸化水平[3]，因此我们推测，由于AMPKα2的缺失，机体存在的调节P38的其他代偿机制（具体见我们实验室贺强等的研究[3]）可能代偿了AMPKα2对P38的调节作用，导致了AMPKα2基因敲除没有影响运动后骨骼肌细胞核内PGC1-MEF2的结合量的变化，具体机制有待进一步研究发现。
4结论
通过转基因和基因敲除技术，我们以往的研究[1]发现，一小时不同强度跑台运动后，野生鼠MEF2/GLUT4结合活性显著升高，AMPKα2转基因鼠MEF2/GLUT4结合活性显著高于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠MEF2/GLUT4结合活性显著低于野生鼠，提示了AMPKα2参与调解了运动诱导的MEF2-GLUT4 DNA结合活性的提高。 HDAC5和PGC1作为影响MEF2对GLUT4基因转录活性的主要调节因子，本实验通过研究运动对AMPKα2三种不同基因状态鼠骨骼肌细胞核内HDAC5 /PGC1-MEF2结合量的影响，发现：
1）1 h跑台运动后，野生鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量显著减低，PGC1和MEF2结合量显著升高，提示了运动可能通过减少骨骼肌细胞核内MEF2和HDAC5结合量，并提高MEF2和PGC1的结合量而调节MEF2/GLUT4 DNA结合活性；
2）1 h跑台运动后，AMPKα2转基因鼠及AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内HDAC5与MEF2结合量与野生鼠相比均没有显著差异，则提示了AMPKα2参与调解运动诱导的MEF2/GLUT4的结合活性的增加并不是主要通过影响骨骼肌细胞核内HDAC5和MEF2结合量实现的；
3）1 h跑台运动后，虽然AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量与野生鼠相比没有显著差异，但AMPKα2转基因鼠骨骼肌细胞核内PGC1与MEF2结合量显著高于野生鼠，则提示了“运动-AMPKα2激活-PGC1与MEF2结合量增多-MEF2/GLUT4 DNA活性升高”这一通路的存在。
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