论文部分内容阅读
【目的】分析致病疫霉（Phytophthora infestans）NLP（Necrosis-and ethylene-inducing like proteins）家族基因PITG10839的致坏死功能及所编码蛋白的活性位点对其功能的影响。【方法】以PITG10839作为研究对象,选inf1作为正对照,以致病疫霉菌株HK09-19的总RNA为模板,通过RT-PCR获得基因的cDNA全长序列。将所得cDNA与表达载体pBI121连接,构建所选基因的重组表达载体,并采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的瞬时表达体系在本生烟（Nicotiana benthamiana）中对PITG10839的表达和功能进行分析。利用over-lap PCR方法定点突变基因PITG10839的活性位点,同时构建活性位点突变后的重组表达质粒,并通过农杆菌注射接种本生烟来研究各活性位点在基因坏死功能中所起的作用。通过荧光定量PCR分析致病疫霉游动孢子侵染马铃薯叶片后不同时期PITG10839的表达模式。【结果】获得了PITG10839和inf1的全长cDNA,分别为405及357 nt。同时,成功构建了PITG10839和inf1的真核表达载体pBI121-10839和pBI121-inf1,并成功转入农杆菌。将含有重组质粒pBI121-10839的农杆菌注射接种本生烟,5 d后接种叶片开始逐渐黄化,7 d后叶片出现典型的皱缩坏死症状。然而含有对照重组质粒pBI121-inf1的农杆菌在注射接种3 d后,本生烟叶片便开始出现萎蔫,5 d时则出现坏死症状,7 d时坏死症状严重。进一步对PITG10839编码蛋白的活性位点进行突变,发现D9A、E22A和D20A 3个氨基酸位点的突变使基因PITG10839所编码蛋白的致坏死功能丧失,叶片仅出现轻微的黄化现象,然而H17A位点氨基酸的突变对该基因的致坏死功能没有影响,注射接种7 d后,仍然可以使本生烟叶片出现皱缩坏死的症状。同时,荧光定量PCR表明,致病疫霉游动孢子接种后不同侵染阶段PITG10839的表达呈现出了不同水平的增加。接种后12 h至36 h,表达量变化水平稳定,增加了20倍左右;48 h时其表达量急剧上升至350倍左右;随后表达量开始下降,但仍高于接种36 h时的表达水平。【结论】致病疫霉NLP家族基因PITG10839具有致使烟草叶片坏死的功能,并确定了影响该基因所编码蛋白致坏死功能的氨基酸活性位点。