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摘要 利用组织分离法、研磨法、印迹法3种分离方法对双孢蘑菇内生菌进行分离，共分离出内生细菌7株、内生真菌1株;对分离出的菌株进行纯化，并进行抑菌试验。结果表明，内生细菌 AB-21菌株对青霉病原菌表现出强的抑制作用，进而对该菌株进行分类鉴定，形态学观察显示，该菌株为革兰氏阳性菌（G+），杆状，有芽孢;生理生化特性鉴定结果与病原库中芽孢杆菌属相符，同源率为95%;进一步对该菌株进行16S rDNA基因的扩增、测序，结果经美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库比对，与库中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度达100%。初步确定内生细菌AB-21为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
關键词 双孢蘑菇;内生菌;分离鉴定
中图分类号 S-646.1+1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）12-0043-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.013
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Agaricus bisporus
RUAN Jun feng1，2，LI Xiang yun1，JIANG Sheng tao1，2 et al （1.School of Life Sciences，Ningde Normal University，Ningde，Fujian 352100;2.Fujian University Engineering Research Center of Characteristic Biological Resources in Eastern Fujian，Ningde，Fujian 352100）
Abstract The endophytic bacteria of Agaricus bisporus were isolated by tissue separation method，grinding method and western blot method.A total of 7 strains of endophytic bacteria and 1 strain of endophytic fungus were isolated.The isolated strains were purified and tested against bacteria.The results showed that the endophytic bacteria AB 21 showed a strong inhibitory effect on the pathogenic bacteria of Penicillium.Then，the strain was classified and identified.Morphological observation showed that the strain was gram positive （G+），rod shaped，with spore.Physiological and biochemical characteristics were identified，and the results were consistent with the Bacillus genus in the pathogen database，with the homology rate of 95%.The 16S rDNA gene of the strain was amplified and sequenced.The results were compared with the database of National Center for Biotechnology Information （NCBI），and the similarity between the strain and Bacillus amyloliquefaciens in the library was 100%.The endophytic bacterium AB 21 was preliminarily identified as Bacillus amyloliquefaciens.
Key words Agaricus bisporus;Endogenous bacteria;Separation identification
双孢蘑菇（Agaricus bisporus），又称白蘑菇，欧美常称之为普通栽培蘑菇或纽扣蘑菇。双孢蘑菇子实体中等大，菌盖宽5～12 cm，初半球形，后平展，白色、光滑，略干渐变黄色，边缘初期内卷。菌肉白色、厚，伤后略变为淡红色，具蘑菇所特有的气味。菌褶初粉红色，后变褐色至黑褐色，密、窄，离生，不等长。菌柄长4.5～9.0 cm，粗1.5～3.5 cm，白色，光滑，近圆柱形，内部松软或中实。菌环白色单层，膜质，生菌柄中部，容易脱落，生长于公园、森林地、田野、草地、道路旁等处，分布极广泛，我国普遍栽培。
内生菌（Endophytic）是指在其生活史中某段时期生活在活的植物组织内，不引起植物组织产生明显病害症状的真菌和细菌[1-3]。内生菌与宿主间具有重要的生态关系，目前已研究出固氮作用、促进植物生长、能产生与宿主相同或相似的生物活性物质[4]。农业生产应用中，将植物内生菌无土混合制剂进行拌种或制成菌剂而加以实践具有重要意义。如阴沟肠杆菌、蜡状芽孢杆菌对种子发芽、宿主植物生长和防御植物抗病性等方面都表现出不同程度的促进作用[5]。 研究表明，植物与细菌联合能促进根际部位污染物的降解[6]。研究者在土壤中发现可分解重金属的细菌，后来在植物体内分离出相应的内生菌株[7]。笔者利用组织分离法、研磨法、印迹法3种分离方法对双孢蘑内生菌进行分离，对分离出的菌株进行纯化，并进行抑菌试验。
1 材料与方法
1.1 材料 双孢蘑菇（Agaricus bisporus），采购自福建宁德市万达超市。
1.2 试剂
NB培养基、 PDA培养基; 革兰氏染液、孔雀绿染液;75%乙醇、3%次氯酸钠，以上试剂均为国产分析纯。
BCL细菌鉴定试剂卡、Taq 聚合酶、dNTP、DL 2000 DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、琼脂糖。
核酸染料4S Green：50 mL 凝胶液体、5 μL Green。
细菌16S rDNA基因通用引物1492R（5′—3′）：TACGGCTACCTTGTTACGACTT和27F（5′—3′）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。
1.3 仪器
VITEK2 Compact32全自动微生物分析系统，BSA124S离心机，BIO-RAD PCR仪，LEICA-DM750视教系统显微镜等。
1.4 方法
1.4.1 内生菌株分离。
取新鲜洗净的双孢蘑菇，无菌水冲洗2次，75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗3次;3%次氯酸钠浸泡2 min，无菌水冲洗3次。
对新鲜的双孢蘑菇进行消毒后，分别采用组织分离法、研磨法和印迹法3种分离方法对内生菌株进行分离。具体步骤：①组织分离法。用无菌解剖刀去掉双孢蘑菇子实体的表皮，将双孢蘑菇内部的组织切割成0.5 cm 左右的小块，分别接于NB和PDA平板培养基，对照组为最末一次冲洗液，分别培养在37和28 ℃恒温箱[8]。②研磨法。用无菌解剖刀去掉双孢蘑菇子实体的表皮，将双孢蘑菇内部的组织切入研钵内，加少量无菌水和无菌玻璃珠研磨，静置2 min，吸取上清液分别于NB和PDA平板培养基上涂布，对照组为最末一次冲洗液，分别培养在37和28 ℃恒温箱[9-10]。③印迹法。用无菌解剖刀去掉双孢蘑菇子实体的表皮，将双孢蘑菇内部的组织切割成0.5 cm左右的小块，分别接于NB和PDA平板培养基，用镊子轻压一下，再将组织块取出，对照组为最末一次冲洗液，分别培养在37和28 ℃恒温箱。
1.4.2 内生菌的纯化。
采用平板划线法，观察所分离菌株的菌落形态特征，挑取单菌落，若存在不同形态的单菌落，则分别挑取到平板培养基上划线培养，确保分离出纯菌。将分离纯化好的纯菌转接至试管培养，长满后移至4 ℃医用冷藏箱中保藏。
1.4.3 抑菌试验。
平板点种法：菌种活化，用无菌水稀释，按 3%的比例加入冷却至55 ℃的培养基中，混匀，倒入培养皿中，待平板冷凝后，挑取内生菌点在平板中央，将平板放入32 ℃培养箱培養，观察抑菌圈情况并计算其直径[11]。
1.4.4 内生菌株的鉴定。
（1）细菌的形态学观察。
菌落特征：将纯化好的内生细菌接种于NB培养基平板上，37 ℃培养24 h后，观察菌落的生长状况和形态特征，挑取单个菌落镜检。
革兰氏染色：用接种环挑取单菌落，在载玻片上涂成直径约1 cm的均匀薄层，微火固定，滴加1～2滴草酸结晶紫，染色1 min，水洗。用95%乙醇脱色至不显紫色。再滴加1～2滴蕃红染液，复染1 min，水洗。用吸水纸吸干100倍油镜镜检。用标准革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌作为对照。
芽孢染色：挑取培养24 h菌株，涂片，干燥并固定。滴加孔雀绿染色液，用试管夹夹住载玻片，于酒精灯上加热至染料冒蒸汽时计时，染色10 min。待玻片冷却后，用水冲洗至褪下绿色为止。然后在玻片上滴加1～2滴蕃红染液，室温下染色3～5 min，水洗、完全干燥，在油镜下观察，菌体呈红色，芽孢呈绿色。
（2）生理生化特性测定。
采用法国-梅里埃（ BioMerieux） 公司生产的微量多项鉴定系统按说明方法对纯培养18～24 h的新鲜菌株进行生理生化指标测定。操作步骤是挑取培养18 h的新鲜菌，配制细菌浊度为1.8～2.2 McF的菌悬液，将卡片按顺序放到载物卡架上，输样管插入到菌液管中，将载卡架放入仪器的填充仓，填充完毕后转移到装载仓，仪器钟自动孵育仓内所有卡片，并将数据传入工作电脑，电脑分析所有数据并给予结果，检索《API鉴定对照系统》对鉴定结果进行分析。
（3）分子生物学鉴定。
采用细菌16S rDNA基因通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，退火温度55 ℃;1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT，退火温度55 ℃）进行PCR扩增，首先配制25 μL反应体系（
10×Taq PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L each）2 μL，上游引物（F）（10 μmol/L）1 μL，下游引物（R）（10 μmol/L）
1 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 18.2 μL，总体积25 μL），反应体系混匀，离心。再设定PCR反应扩增程序：预变性94 ℃ 10 min;变性94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 90 s，然后再次回到变性温度循环30次; 保温72 ℃ 10 min。然后待反应结束后，取5 μL 的PCR扩增产物和1 μL的6×Loading Buffer混匀上样，以DL 2000 DNA Marker为分子量标准，经过2%的琼脂糖凝胶在150 V恒压下电泳检测，电泳结束后，用紫外凝胶成像系统拍照，判定PCR扩增结果。PCR产物电泳检测后，观察是否有明亮的条带出现。最后将有条带的序号所对应的菌落参照天根公司试剂盒TIANprep mini Plasmid Kit的说明书按步骤进行质粒提取，取5 μL进行琼脂电泳150 V下跑胶，送至福州博尚生物技术有限公司进行测序。 2 结果与分析
2.1 不同分离方法对双孢蘑菇内生菌分离效果的比较
3种分离方法对双孢蘑菇内生菌的数量有明显影响，不同分离方法对双孢蘑菇内生菌的分离效果也不同，结果见表1。
从表1可以看出，通过组织分离法从双孢蘑菇中分离出3株内生细菌，没有分离到内生真菌;通过研磨法从双孢蘑菇中分离出3株内生细菌、1株内生真菌;通过印迹法从双孢蘑菇中分离出1株内生细菌，没有分离到内生真菌。
2.2 抑菌试验结果
对所有分离到的内生菌进行编号：双孢蘑菇细菌AB、双孢蘑菇真菌AF。以大肠杆菌、青霉2种常见的病原菌作为指示菌，经活菌抑菌试验筛选，所分离到的双孢蘑菇内生菌抑菌效果见表2。
双孢蘑菇内生菌株AB-21对青霉表现出很强的抑菌效果，对青霉抑菌圈均达15 mm以上，故内生菌株AB-21具有一定的研究和应用前景。
2.3 内生细菌 AB-21的分类鉴定
2.3.1 内生细菌 AB-21 的微生物形态学观察。
通过革兰氏染色、芽孢染色和形态观察可知，AB-21 菌株的革兰氏染色为阳性，有芽孢。AB-21 菌株菌落颜色呈乳白色，半透明状，光滑湿润，杆状，菌体很小，直或弯，呈八字排列的杆菌。
2.3.2 内生细菌 AB-21 的生理生化特性。
将培养18～24 h的内生细菌AB-21（新鲜菌）进行生理生化鉴定，结果出现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）3个菌，初步推测该菌属芽孢杆菌属。内生细菌AB-21与芽孢杆菌属的同源率为95.0%，需进一步验证该菌的菌种（表3）。
2.3.3 内生细菌AB-21的分子生物鉴定。
采用27F和1492R特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示PCR扩增产物约1 500 bp，片段单一清晰，符合预期大小（图1）。
按照TIANprep mini PlAsmid KiT操作说明书提取菌株质粒，经琼脂糖凝胶电泳，结果显示提取的重组质粒完整，大小与预期相符。将提取的重组质粒送至福州博尚生物技术有限公司测序，结果显示，目的片段大小共1 423 bp，具体序列信息见图2。
采用NCBI数据库网站在线工具BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nig.gov/Blast.cgi），选择Nucleotide Blast比对模块，输入测序序列，比对结果显示与库中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度达100%（图3）。
3 结论与讨论
该研究采用组織分离法、研磨法、印迹法3种分离方法对双孢蘑菇内生菌进行分离，共分离出内生细菌7株、内生真菌1株;对分离出的菌株进行纯化，并进行抑菌试验。结果表明，内生细菌AB-21菌株对青霉病原菌表现出强的抑制作用，进而对该菌株进行分类鉴定、细菌形态学观察，结果表明该菌株为革兰氏阳性菌（G+），杆状，有芽孢;生理生化特性鉴定结果与病原库中芽孢杆菌相符，同源率为95%;进一步对该菌株进行16S rDNA基因的扩增、测序，结果经美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库比对，与库中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度达100%。初步确定内生细菌AB-21为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
在对内生细菌AB-21（新鲜菌）进行生理生化鉴定时，结果出现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）3个菌，初步推测该菌属芽孢杆菌属。内生细菌AB-21与芽孢杆菌属的同源率为95.0%，需进一步验证该菌的菌种。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）3个菌同属于芽孢杆菌属，这3个菌种极其相似，在V2C菌库中被归为同一类。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是枯草芽孢
杆菌属、枯草芽孢杆菌种、解淀粉枯草芽孢杆菌亚种。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）属于subtilis种，是一种多功能的微生物，其在饲料中应用较多，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛。萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）旧称枯草芽孢杆菌黑色变种，是芽孢杆菌属的一个重要种。1989年，Nakamura[12]采用DNA杂交、电泳技术和色素生成方法对一些产色素的枯草芽孢杆菌重新鉴定分类，首次提出将产棕色色素的枯草芽孢杆菌黑色变种更名为萎缩芽孢杆菌。
该研究结合分离菌株的培养特性及形态学特征、生理生化特性及16S rDNA基因的比对分析，初步确定内生细菌AB-21为解淀粉芽孢杆菌，研究结果将为双孢蘑菇内生菌资源和其生物活性物质的开发应用提供科学依据。
参考文献
[1]
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[12] NAKAMURA L K.Taxonomic relationship of black pigmented Bacillus subtilis strains and a proposal for Bacillus atrophaeus sp.nov.[J].International journal of systematic bacteriology，1989，39：295-300.
關键词 双孢蘑菇;内生菌;分离鉴定
中图分类号 S-646.1+1 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）12-0043-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.013
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Agaricus bisporus
RUAN Jun feng1，2，LI Xiang yun1，JIANG Sheng tao1，2 et al （1.School of Life Sciences，Ningde Normal University，Ningde，Fujian 352100;2.Fujian University Engineering Research Center of Characteristic Biological Resources in Eastern Fujian，Ningde，Fujian 352100）
Abstract The endophytic bacteria of Agaricus bisporus were isolated by tissue separation method，grinding method and western blot method.A total of 7 strains of endophytic bacteria and 1 strain of endophytic fungus were isolated.The isolated strains were purified and tested against bacteria.The results showed that the endophytic bacteria AB 21 showed a strong inhibitory effect on the pathogenic bacteria of Penicillium.Then，the strain was classified and identified.Morphological observation showed that the strain was gram positive （G+），rod shaped，with spore.Physiological and biochemical characteristics were identified，and the results were consistent with the Bacillus genus in the pathogen database，with the homology rate of 95%.The 16S rDNA gene of the strain was amplified and sequenced.The results were compared with the database of National Center for Biotechnology Information （NCBI），and the similarity between the strain and Bacillus amyloliquefaciens in the library was 100%.The endophytic bacterium AB 21 was preliminarily identified as Bacillus amyloliquefaciens.
Key words Agaricus bisporus;Endogenous bacteria;Separation identification
双孢蘑菇（Agaricus bisporus），又称白蘑菇，欧美常称之为普通栽培蘑菇或纽扣蘑菇。双孢蘑菇子实体中等大，菌盖宽5～12 cm，初半球形，后平展，白色、光滑，略干渐变黄色，边缘初期内卷。菌肉白色、厚，伤后略变为淡红色，具蘑菇所特有的气味。菌褶初粉红色，后变褐色至黑褐色，密、窄，离生，不等长。菌柄长4.5～9.0 cm，粗1.5～3.5 cm，白色，光滑，近圆柱形，内部松软或中实。菌环白色单层，膜质，生菌柄中部，容易脱落，生长于公园、森林地、田野、草地、道路旁等处，分布极广泛，我国普遍栽培。
内生菌（Endophytic）是指在其生活史中某段时期生活在活的植物组织内，不引起植物组织产生明显病害症状的真菌和细菌[1-3]。内生菌与宿主间具有重要的生态关系，目前已研究出固氮作用、促进植物生长、能产生与宿主相同或相似的生物活性物质[4]。农业生产应用中，将植物内生菌无土混合制剂进行拌种或制成菌剂而加以实践具有重要意义。如阴沟肠杆菌、蜡状芽孢杆菌对种子发芽、宿主植物生长和防御植物抗病性等方面都表现出不同程度的促进作用[5]。 研究表明，植物与细菌联合能促进根际部位污染物的降解[6]。研究者在土壤中发现可分解重金属的细菌，后来在植物体内分离出相应的内生菌株[7]。笔者利用组织分离法、研磨法、印迹法3种分离方法对双孢蘑内生菌进行分离，对分离出的菌株进行纯化，并进行抑菌试验。
1 材料与方法
1.1 材料 双孢蘑菇（Agaricus bisporus），采购自福建宁德市万达超市。
1.2 试剂
NB培养基、 PDA培养基; 革兰氏染液、孔雀绿染液;75%乙醇、3%次氯酸钠，以上试剂均为国产分析纯。
BCL细菌鉴定试剂卡、Taq 聚合酶、dNTP、DL 2000 DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、琼脂糖。
核酸染料4S Green：50 mL 凝胶液体、5 μL Green。
细菌16S rDNA基因通用引物1492R（5′—3′）：TACGGCTACCTTGTTACGACTT和27F（5′—3′）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG。
1.3 仪器
VITEK2 Compact32全自动微生物分析系统，BSA124S离心机，BIO-RAD PCR仪，LEICA-DM750视教系统显微镜等。
1.4 方法
1.4.1 内生菌株分离。
取新鲜洗净的双孢蘑菇，无菌水冲洗2次，75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗3次;3%次氯酸钠浸泡2 min，无菌水冲洗3次。
对新鲜的双孢蘑菇进行消毒后，分别采用组织分离法、研磨法和印迹法3种分离方法对内生菌株进行分离。具体步骤：①组织分离法。用无菌解剖刀去掉双孢蘑菇子实体的表皮，将双孢蘑菇内部的组织切割成0.5 cm 左右的小块，分别接于NB和PDA平板培养基，对照组为最末一次冲洗液，分别培养在37和28 ℃恒温箱[8]。②研磨法。用无菌解剖刀去掉双孢蘑菇子实体的表皮，将双孢蘑菇内部的组织切入研钵内，加少量无菌水和无菌玻璃珠研磨，静置2 min，吸取上清液分别于NB和PDA平板培养基上涂布，对照组为最末一次冲洗液，分别培养在37和28 ℃恒温箱[9-10]。③印迹法。用无菌解剖刀去掉双孢蘑菇子实体的表皮，将双孢蘑菇内部的组织切割成0.5 cm左右的小块，分别接于NB和PDA平板培养基，用镊子轻压一下，再将组织块取出，对照组为最末一次冲洗液，分别培养在37和28 ℃恒温箱。
1.4.2 内生菌的纯化。
采用平板划线法，观察所分离菌株的菌落形态特征，挑取单菌落，若存在不同形态的单菌落，则分别挑取到平板培养基上划线培养，确保分离出纯菌。将分离纯化好的纯菌转接至试管培养，长满后移至4 ℃医用冷藏箱中保藏。
1.4.3 抑菌试验。
平板点种法：菌种活化，用无菌水稀释，按 3%的比例加入冷却至55 ℃的培养基中，混匀，倒入培养皿中，待平板冷凝后，挑取内生菌点在平板中央，将平板放入32 ℃培养箱培養，观察抑菌圈情况并计算其直径[11]。
1.4.4 内生菌株的鉴定。
（1）细菌的形态学观察。
菌落特征：将纯化好的内生细菌接种于NB培养基平板上，37 ℃培养24 h后，观察菌落的生长状况和形态特征，挑取单个菌落镜检。
革兰氏染色：用接种环挑取单菌落，在载玻片上涂成直径约1 cm的均匀薄层，微火固定，滴加1～2滴草酸结晶紫，染色1 min，水洗。用95%乙醇脱色至不显紫色。再滴加1～2滴蕃红染液，复染1 min，水洗。用吸水纸吸干100倍油镜镜检。用标准革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌作为对照。
芽孢染色：挑取培养24 h菌株，涂片，干燥并固定。滴加孔雀绿染色液，用试管夹夹住载玻片，于酒精灯上加热至染料冒蒸汽时计时，染色10 min。待玻片冷却后，用水冲洗至褪下绿色为止。然后在玻片上滴加1～2滴蕃红染液，室温下染色3～5 min，水洗、完全干燥，在油镜下观察，菌体呈红色，芽孢呈绿色。
（2）生理生化特性测定。
采用法国-梅里埃（ BioMerieux） 公司生产的微量多项鉴定系统按说明方法对纯培养18～24 h的新鲜菌株进行生理生化指标测定。操作步骤是挑取培养18 h的新鲜菌，配制细菌浊度为1.8～2.2 McF的菌悬液，将卡片按顺序放到载物卡架上，输样管插入到菌液管中，将载卡架放入仪器的填充仓，填充完毕后转移到装载仓，仪器钟自动孵育仓内所有卡片，并将数据传入工作电脑，电脑分析所有数据并给予结果，检索《API鉴定对照系统》对鉴定结果进行分析。
（3）分子生物学鉴定。
采用细菌16S rDNA基因通用引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，退火温度55 ℃;1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT，退火温度55 ℃）进行PCR扩增，首先配制25 μL反应体系（
10×Taq PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs Mix（2.5 mmol/L each）2 μL，上游引物（F）（10 μmol/L）1 μL，下游引物（R）（10 μmol/L）
1 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 18.2 μL，总体积25 μL），反应体系混匀，离心。再设定PCR反应扩增程序：预变性94 ℃ 10 min;变性94 ℃ 1 min，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 90 s，然后再次回到变性温度循环30次; 保温72 ℃ 10 min。然后待反应结束后，取5 μL 的PCR扩增产物和1 μL的6×Loading Buffer混匀上样，以DL 2000 DNA Marker为分子量标准，经过2%的琼脂糖凝胶在150 V恒压下电泳检测，电泳结束后，用紫外凝胶成像系统拍照，判定PCR扩增结果。PCR产物电泳检测后，观察是否有明亮的条带出现。最后将有条带的序号所对应的菌落参照天根公司试剂盒TIANprep mini Plasmid Kit的说明书按步骤进行质粒提取，取5 μL进行琼脂电泳150 V下跑胶，送至福州博尚生物技术有限公司进行测序。 2 结果与分析
2.1 不同分离方法对双孢蘑菇内生菌分离效果的比较
3种分离方法对双孢蘑菇内生菌的数量有明显影响，不同分离方法对双孢蘑菇内生菌的分离效果也不同，结果见表1。
从表1可以看出，通过组织分离法从双孢蘑菇中分离出3株内生细菌，没有分离到内生真菌;通过研磨法从双孢蘑菇中分离出3株内生细菌、1株内生真菌;通过印迹法从双孢蘑菇中分离出1株内生细菌，没有分离到内生真菌。
2.2 抑菌试验结果
对所有分离到的内生菌进行编号：双孢蘑菇细菌AB、双孢蘑菇真菌AF。以大肠杆菌、青霉2种常见的病原菌作为指示菌，经活菌抑菌试验筛选，所分离到的双孢蘑菇内生菌抑菌效果见表2。
双孢蘑菇内生菌株AB-21对青霉表现出很强的抑菌效果，对青霉抑菌圈均达15 mm以上，故内生菌株AB-21具有一定的研究和应用前景。
2.3 内生细菌 AB-21的分类鉴定
2.3.1 内生细菌 AB-21 的微生物形态学观察。
通过革兰氏染色、芽孢染色和形态观察可知，AB-21 菌株的革兰氏染色为阳性，有芽孢。AB-21 菌株菌落颜色呈乳白色，半透明状，光滑湿润，杆状，菌体很小，直或弯，呈八字排列的杆菌。
2.3.2 内生细菌 AB-21 的生理生化特性。
将培养18～24 h的内生细菌AB-21（新鲜菌）进行生理生化鉴定，结果出现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）3个菌，初步推测该菌属芽孢杆菌属。内生细菌AB-21与芽孢杆菌属的同源率为95.0%，需进一步验证该菌的菌种（表3）。
2.3.3 内生细菌AB-21的分子生物鉴定。
采用27F和1492R特异性引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示PCR扩增产物约1 500 bp，片段单一清晰，符合预期大小（图1）。
按照TIANprep mini PlAsmid KiT操作说明书提取菌株质粒，经琼脂糖凝胶电泳，结果显示提取的重组质粒完整，大小与预期相符。将提取的重组质粒送至福州博尚生物技术有限公司测序，结果显示，目的片段大小共1 423 bp，具体序列信息见图2。
采用NCBI数据库网站在线工具BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nig.gov/Blast.cgi），选择Nucleotide Blast比对模块，输入测序序列，比对结果显示与库中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度达100%（图3）。
3 结论与讨论
该研究采用组織分离法、研磨法、印迹法3种分离方法对双孢蘑菇内生菌进行分离，共分离出内生细菌7株、内生真菌1株;对分离出的菌株进行纯化，并进行抑菌试验。结果表明，内生细菌AB-21菌株对青霉病原菌表现出强的抑制作用，进而对该菌株进行分类鉴定、细菌形态学观察，结果表明该菌株为革兰氏阳性菌（G+），杆状，有芽孢;生理生化特性鉴定结果与病原库中芽孢杆菌相符，同源率为95%;进一步对该菌株进行16S rDNA基因的扩增、测序，结果经美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库比对，与库中解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）相似度达100%。初步确定内生细菌AB-21为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
在对内生细菌AB-21（新鲜菌）进行生理生化鉴定时，结果出现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）3个菌，初步推测该菌属芽孢杆菌属。内生细菌AB-21与芽孢杆菌属的同源率为95.0%，需进一步验证该菌的菌种。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）3个菌同属于芽孢杆菌属，这3个菌种极其相似，在V2C菌库中被归为同一类。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是枯草芽孢
杆菌属、枯草芽孢杆菌种、解淀粉枯草芽孢杆菌亚种。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）属于subtilis种，是一种多功能的微生物，其在饲料中应用较多，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛。萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）旧称枯草芽孢杆菌黑色变种，是芽孢杆菌属的一个重要种。1989年，Nakamura[12]采用DNA杂交、电泳技术和色素生成方法对一些产色素的枯草芽孢杆菌重新鉴定分类，首次提出将产棕色色素的枯草芽孢杆菌黑色变种更名为萎缩芽孢杆菌。
该研究结合分离菌株的培养特性及形态学特征、生理生化特性及16S rDNA基因的比对分析，初步确定内生细菌AB-21为解淀粉芽孢杆菌，研究结果将为双孢蘑菇内生菌资源和其生物活性物质的开发应用提供科学依据。
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