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摘要[目的]探明桂林市猫儿山风景区Bt的多样性和分布概况。[方法]在该景区海拔1 800 ～2 000 m的常绿针阔叶林和海拔2 000 m以上的灌丛矮林采集土壤样品共1 168份，分离Bt菌株，并对Bt分离株进行伴孢晶体蛋白分子量的测定和发酵上清液抑菌性分析。[结果]从该景区针阔叶林和灌丛矮林的146个样点共筛选出44个Bt菌株，出菌率达30.14%；其中14株Bt菌株均表达120 kD的蛋白，12株表达66 kD的蛋白。将14株Bt分离株的发酵液上清进行抑菌检测，仅有4株对草生欧文氏杆菌有抑制效果，其中9号的Bt分离株抑制率最高。9号Bt分离株发酵液上清的抑菌物质热稳定性研究结果表明抑菌物质在65 ℃下2 h内不失活，其至少含有2种抑菌物质。[结论]为丰富我国西部地区Bt资源的开发利用奠定了基础。
关键词 苏云金芽孢杆菌；SDSPAGE；伴孢晶体；抑菌
中图分类号S481文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10561-03
基金项目广西矿冶与环境科学实验中心资助项目（KH2013YB013）；广西自然科学基金项目（2014GXNSFBA118134）；广西壮药产业化工程院科研项目（2014GXZYCYH03）。
作者简介李霞（1981- ），女，黑龙江肇东人，讲师，博士，从事天然化学产物活性研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事天然化学产物活性的研究。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis， 简称Bt），化能异养型革兰氏阳性细菌，其利用的碳源主要为单糖和淀粉[1]。Bt主要特点是能产生特异性毒杀作用的伴孢晶体（Insecticidal Crystal Proteins， ICPs），迄今Bt的杀虫活性谱已经扩大到无脊椎动物4个门及节肢动物中9个目的动物[2]。Bt在发酵过程产生可溶性的抗生素（Zwittermicin A， 简称ZwA）[3]，能抑制多种微生物的生长，与Bt伴孢晶体混用时具有很高的增效作用[4-5]。目前Bt制剂已成为全球用途最广、产量最大的微生物类杀虫剂，具估计目前全世界分离保存的Bt菌株已达4万多株[6]。伴随着Bt制剂广泛应用于农业生产中，害虫也随之逐渐产生抗性。因此，对我国境内Bt菌株进行分离和研究，发掘新型Bt基因，寻找具有广谱杀虫性质的Bt，具有广阔的商业前景和科研价值。
Bt菌株广泛分布于自然界，不同地域中表现出来的特性也有所区别。猫儿山风景区位于广西东北部，海拔高度2 141.5 m，森林覆盖率达96.5%，常绿针阔叶林，土壤肥沃，植被丰富，水源丰沛，适合于土壤微生物的生存；灌丛矮林，昼夜温差悬殊，日照充足，适于抗性强的微生物生存。为了探明该地区Bt的多样性和分布概况，在该地区海拔1 800～2 000 m的常绿针阔叶林和海拔2 000 m以上的灌丛矮林[7]采集土壤样品共1 168份，分离Bt菌株，并对Bt分离株进行了伴孢晶体蛋白分子量的测定和分离株的发酵上清液抑菌性分析，旨在为丰富我国西部地区Bt资源的开发利用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株。Bt库斯塔克亚种菌株HD1（简称HD1）和草生欧文氏杆菌（Erwinia herbicola LS005）均由中国农业科学院植物保护研究所提供。
1.1.2试剂。石炭酸复红染液：2 g碱性品红溶于20 ml含5%苯酚的酒精，使用时稀释15倍。
1.1.3培养基。1/2LB固体培养基：蛋白胨0.50%，酵母粉0.25%，氯化钠0.50%，琼脂粉1.50%。发酵培养基：葡萄糖2.000 0%，蛋白胨2.000 0%，无水氯化钙0.080 0%，磷酸氢二钾0.130 0%，硫酸镁0.020 0%，硫酸锰0.000 8%，调节pH至7.0～7.2。
1.2方法
1.2.1土样采集。使用经纬仪，以经纬度为坐标圆点，在半径为5 m的范围内随机采集8份土壤样品，选取植被丰富、潮湿、避免阳光直射的腐殖层，采集腐殖层下5～15 cm的土壤，装入无菌的自封袋中，记录坐标圆点的经纬度和海拔。
1.2.2Bt菌株分离。坐标点的8份土壤中，每份取2 g混于15 ml离心管中，加入无菌玻璃珠和无菌水至离心管刻度15 ml处，使用旋窝混合器振荡混匀，置于80 ℃水浴20 min。取上清液稀释成10-2和10-4 2个梯度，吸取100 μl于1/2LB固体培养基中均匀涂布，30 ℃恒温箱中倒置培养40～50 h。
1.2.3Bt菌株鉴定。观察菌落在1/2 LB固体培养基上的生长情况，挑选菌落颜色为乳白色、形态呈圆形、边缘呈锯齿形的菌株进行制片。使用石炭酸复红染液对涂菌部位染色5 min，随后自来水冲洗至洗液为无色，晾干，100倍油镜观察伴孢晶体的有无及伴孢晶体的形态，计算出菌率。
出菌率=Bt分离株数量/采样坐标点数目
1.2.4Bt分离株伴孢晶体SDSPAGE分析。将Bt分离株接种于1/2 LB固体培养基中划线，30 ℃恒温箱中倒置培养至Bt伴孢晶体释放。刮取2 mg左右菌株制备SDSPAGE待测液，待测液制备和SDSPAGE分析参见文献[8-9]。将凝胶图片使用软件“UVITec”处理，直接得到蛋白分子量数据。
1.2.5Bt分离株发酵液上清抑菌效果检测。将Bt分离株于1/2 LB液体培养基中30 ℃恒温摇床活化18 h，以2%的接种量接种于发酵培养基，30 ℃恒温摇床培养48 h，取发酵培养液，4 500 r/min离心15 min，上清液作为待测液。使用草生欧文氏杆菌作为指示菌，对Bt分离株进行伴孢晶体的SDSPAGE电泳分析，采用牛津杯法[10]观察Bt分离株发酵液上清对其抑制的效果。以HD1为阳性对照，发酵液为阴性对照，将Bt分离株发酵液上清于95 ℃水浴2 h，以室温下Bt分离株发酵液上清作为对比进行抑菌试验。测量每个孔径抑菌圈的大小，计算各待测液与Bt菌株HD1抑菌圈直径和直径比值。 抑菌圈直径=抑菌圈外径-抑菌圈内径
直径比值=待测液抑菌圈直径/HD1抑菌圈直径
1.2.6Bt分离菌发酵液上清中抑菌物质热稳定性研究。使用比HD1抑制草生欧文氏杆菌效果好的Bt分离株，将分离株发酵液上清以65、80、95 ℃分别水浴加热15、30、45、60、75、90、105、120 min。使用草生欧文氏杆菌作为指示菌，采用牛津杯法[10]，观察其抑制效果。以水浴时间为横坐标（x），抑菌直径为纵坐标（y），绘制回归曲线。
2结果与分析
2.1菌株分离猫儿山景区共设146个坐标点，采集1 168份土壤，分离鉴定出Bt菌株44株，出菌率为30.14%；针阔叶林设定127个坐标点，采集1 016份土壤，共分离鉴定出Bt菌株41株；灌丛矮林19个坐标点，采集152份土壤，共分离鉴定出Bt菌株3株（表1）。针阔叶林的出菌率（3228%）远高于灌丛矮林（15.79%），其原因可能灌丛矮林带与针阔叶林带相比海拔较高，日照较强，土壤湿度较低，腐殖层较薄。
2.2菌株形态和伴孢晶体形态观察于光学显微镜100倍油镜下进行观察，发现41株Bt分离株的伴孢晶体均为菱形（图1），未发现其他形态的伴孢晶体。其原因可能为猫儿山地区土壤中的Bt的伴孢晶体均为菱形。注：a.伴孢晶体； b.芽孢； c.营养体。
2.3晶体蛋白的SDSPAGE分析分离出Bt的14个采样坐标点，每坐标随机取1株Bt分离株进行伴孢晶体的SDSPAGE电泳分析，共取14株Bt分离菌株（表2）。14株Bt的伴孢晶体均表达了120 kD的蛋白，12株Bt的伴孢晶体表达了66 kD的蛋白，预测猫儿山的Bt菌株伴孢晶体均含120 kD的蛋白，绝大部分含有66 kD的蛋白。14株Bt分离株中，5株表达了3种分子量，3株表达5种分子量，3株表达4种分子量，2株表达7种分子量，1株表达9种分子量。其中2号Bt分离株表达了9种分子量，该菌株可能为含有新型Bt基因的野生菌株，需要进一步研究。
2.4Bt分离株发酵液上清抑菌效果将14株Bt分离株的发酵液上清，以草生欧文氏杆菌为指示菌进行抑菌效果检
2.5Bt分离菌发酵液上清中抑菌物质热稳定性使用9号Bt分离株发酵液上清进行抑菌物质热稳定性研究，绘制热稳定性的回归曲线（图2）。65 ℃水浴15～120 min的抑菌率区域稳定，说明抑菌活性物质在65 ℃下2 h以内不失活；80 ℃水浴15～120 min的抑菌率波动性较大，推测抑菌活性物质在该温度2 h内既有增强也有减弱；95 ℃水浴60 min后区域稳定，推测至少含有2种抑菌物质。
3结论
从桂林市猫儿山景区针阔叶林和灌丛矮林的146个坐标点的土壤中共筛选出44株Bt，进一步丰富了我国西部地区的Bt资源库；14株Bt分离株所表达的蛋白呈现的多元化显示了猫儿山景区Bt的多样性，9号Bt对草生欧文氏杆菌的高抑制率以及其抑菌活性物质的稳定性和多元性，值得进表3Bt分离株发酵液上清抑菌效果
参考文献
[1] 王利平， 代林远， 李鹏.苏云金芽孢杆菌研究进展[J].中国畜牧兽医， 2011， 38（9）： 224-227.
[2] 喻子牛， 孙明， 刘子铎.苏云金芽孢杆菌的分类及生物活性蛋白基因[J].中国生物防治， 1996（12）： 89-89.
[3] SILOSUH L A，LETHBRIDGE B J，RAFFEL L A，et al.Biological activities of two fungistatic antibiotic produced by Bacillus cereus UW85[J].Applied and Environmental Microbiology， 1994，60：2023-2030.
[4] MANKER D C，LIDSTER W D，STAMES R L，et al.Synergy between Zwittermicin A and Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki against gypsy moth （Lepidopteria： Lyman triidae）[J].Biological Control， 2000， 29（1）： 101-107.
关键词 苏云金芽孢杆菌；SDSPAGE；伴孢晶体；抑菌
中图分类号S481文献标识码A文章编号0517-6611（2014）30-10561-03
基金项目广西矿冶与环境科学实验中心资助项目（KH2013YB013）；广西自然科学基金项目（2014GXNSFBA118134）；广西壮药产业化工程院科研项目（2014GXZYCYH03）。
作者简介李霞（1981- ），女，黑龙江肇东人，讲师，博士，从事天然化学产物活性研究。*通讯作者，教授，博士生导师，从事天然化学产物活性的研究。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis， 简称Bt），化能异养型革兰氏阳性细菌，其利用的碳源主要为单糖和淀粉[1]。Bt主要特点是能产生特异性毒杀作用的伴孢晶体（Insecticidal Crystal Proteins， ICPs），迄今Bt的杀虫活性谱已经扩大到无脊椎动物4个门及节肢动物中9个目的动物[2]。Bt在发酵过程产生可溶性的抗生素（Zwittermicin A， 简称ZwA）[3]，能抑制多种微生物的生长，与Bt伴孢晶体混用时具有很高的增效作用[4-5]。目前Bt制剂已成为全球用途最广、产量最大的微生物类杀虫剂，具估计目前全世界分离保存的Bt菌株已达4万多株[6]。伴随着Bt制剂广泛应用于农业生产中，害虫也随之逐渐产生抗性。因此，对我国境内Bt菌株进行分离和研究，发掘新型Bt基因，寻找具有广谱杀虫性质的Bt，具有广阔的商业前景和科研价值。
Bt菌株广泛分布于自然界，不同地域中表现出来的特性也有所区别。猫儿山风景区位于广西东北部，海拔高度2 141.5 m，森林覆盖率达96.5%，常绿针阔叶林，土壤肥沃，植被丰富，水源丰沛，适合于土壤微生物的生存；灌丛矮林，昼夜温差悬殊，日照充足，适于抗性强的微生物生存。为了探明该地区Bt的多样性和分布概况，在该地区海拔1 800～2 000 m的常绿针阔叶林和海拔2 000 m以上的灌丛矮林[7]采集土壤样品共1 168份，分离Bt菌株，并对Bt分离株进行了伴孢晶体蛋白分子量的测定和分离株的发酵上清液抑菌性分析，旨在为丰富我国西部地区Bt资源的开发利用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株。Bt库斯塔克亚种菌株HD1（简称HD1）和草生欧文氏杆菌（Erwinia herbicola LS005）均由中国农业科学院植物保护研究所提供。
1.1.2试剂。石炭酸复红染液：2 g碱性品红溶于20 ml含5%苯酚的酒精，使用时稀释15倍。
1.1.3培养基。1/2LB固体培养基：蛋白胨0.50%，酵母粉0.25%，氯化钠0.50%，琼脂粉1.50%。发酵培养基：葡萄糖2.000 0%，蛋白胨2.000 0%，无水氯化钙0.080 0%，磷酸氢二钾0.130 0%，硫酸镁0.020 0%，硫酸锰0.000 8%，调节pH至7.0～7.2。
1.2方法
1.2.1土样采集。使用经纬仪，以经纬度为坐标圆点，在半径为5 m的范围内随机采集8份土壤样品，选取植被丰富、潮湿、避免阳光直射的腐殖层，采集腐殖层下5～15 cm的土壤，装入无菌的自封袋中，记录坐标圆点的经纬度和海拔。
1.2.2Bt菌株分离。坐标点的8份土壤中，每份取2 g混于15 ml离心管中，加入无菌玻璃珠和无菌水至离心管刻度15 ml处，使用旋窝混合器振荡混匀，置于80 ℃水浴20 min。取上清液稀释成10-2和10-4 2个梯度，吸取100 μl于1/2LB固体培养基中均匀涂布，30 ℃恒温箱中倒置培养40～50 h。
1.2.3Bt菌株鉴定。观察菌落在1/2 LB固体培养基上的生长情况，挑选菌落颜色为乳白色、形态呈圆形、边缘呈锯齿形的菌株进行制片。使用石炭酸复红染液对涂菌部位染色5 min，随后自来水冲洗至洗液为无色，晾干，100倍油镜观察伴孢晶体的有无及伴孢晶体的形态，计算出菌率。
出菌率=Bt分离株数量/采样坐标点数目
1.2.4Bt分离株伴孢晶体SDSPAGE分析。将Bt分离株接种于1/2 LB固体培养基中划线，30 ℃恒温箱中倒置培养至Bt伴孢晶体释放。刮取2 mg左右菌株制备SDSPAGE待测液，待测液制备和SDSPAGE分析参见文献[8-9]。将凝胶图片使用软件“UVITec”处理，直接得到蛋白分子量数据。
1.2.5Bt分离株发酵液上清抑菌效果检测。将Bt分离株于1/2 LB液体培养基中30 ℃恒温摇床活化18 h，以2%的接种量接种于发酵培养基，30 ℃恒温摇床培养48 h，取发酵培养液，4 500 r/min离心15 min，上清液作为待测液。使用草生欧文氏杆菌作为指示菌，对Bt分离株进行伴孢晶体的SDSPAGE电泳分析，采用牛津杯法[10]观察Bt分离株发酵液上清对其抑制的效果。以HD1为阳性对照，发酵液为阴性对照，将Bt分离株发酵液上清于95 ℃水浴2 h，以室温下Bt分离株发酵液上清作为对比进行抑菌试验。测量每个孔径抑菌圈的大小，计算各待测液与Bt菌株HD1抑菌圈直径和直径比值。 抑菌圈直径=抑菌圈外径-抑菌圈内径
直径比值=待测液抑菌圈直径/HD1抑菌圈直径
1.2.6Bt分离菌发酵液上清中抑菌物质热稳定性研究。使用比HD1抑制草生欧文氏杆菌效果好的Bt分离株，将分离株发酵液上清以65、80、95 ℃分别水浴加热15、30、45、60、75、90、105、120 min。使用草生欧文氏杆菌作为指示菌，采用牛津杯法[10]，观察其抑制效果。以水浴时间为横坐标（x），抑菌直径为纵坐标（y），绘制回归曲线。
2结果与分析
2.1菌株分离猫儿山景区共设146个坐标点，采集1 168份土壤，分离鉴定出Bt菌株44株，出菌率为30.14%；针阔叶林设定127个坐标点，采集1 016份土壤，共分离鉴定出Bt菌株41株；灌丛矮林19个坐标点，采集152份土壤，共分离鉴定出Bt菌株3株（表1）。针阔叶林的出菌率（3228%）远高于灌丛矮林（15.79%），其原因可能灌丛矮林带与针阔叶林带相比海拔较高，日照较强，土壤湿度较低，腐殖层较薄。
2.2菌株形态和伴孢晶体形态观察于光学显微镜100倍油镜下进行观察，发现41株Bt分离株的伴孢晶体均为菱形（图1），未发现其他形态的伴孢晶体。其原因可能为猫儿山地区土壤中的Bt的伴孢晶体均为菱形。注：a.伴孢晶体； b.芽孢； c.营养体。
2.3晶体蛋白的SDSPAGE分析分离出Bt的14个采样坐标点，每坐标随机取1株Bt分离株进行伴孢晶体的SDSPAGE电泳分析，共取14株Bt分离菌株（表2）。14株Bt的伴孢晶体均表达了120 kD的蛋白，12株Bt的伴孢晶体表达了66 kD的蛋白，预测猫儿山的Bt菌株伴孢晶体均含120 kD的蛋白，绝大部分含有66 kD的蛋白。14株Bt分离株中，5株表达了3种分子量，3株表达5种分子量，3株表达4种分子量，2株表达7种分子量，1株表达9种分子量。其中2号Bt分离株表达了9种分子量，该菌株可能为含有新型Bt基因的野生菌株，需要进一步研究。
2.4Bt分离株发酵液上清抑菌效果将14株Bt分离株的发酵液上清，以草生欧文氏杆菌为指示菌进行抑菌效果检
2.5Bt分离菌发酵液上清中抑菌物质热稳定性使用9号Bt分离株发酵液上清进行抑菌物质热稳定性研究，绘制热稳定性的回归曲线（图2）。65 ℃水浴15～120 min的抑菌率区域稳定，说明抑菌活性物质在65 ℃下2 h以内不失活；80 ℃水浴15～120 min的抑菌率波动性较大，推测抑菌活性物质在该温度2 h内既有增强也有减弱；95 ℃水浴60 min后区域稳定，推测至少含有2种抑菌物质。
3结论
从桂林市猫儿山景区针阔叶林和灌丛矮林的146个坐标点的土壤中共筛选出44株Bt，进一步丰富了我国西部地区的Bt资源库；14株Bt分离株所表达的蛋白呈现的多元化显示了猫儿山景区Bt的多样性，9号Bt对草生欧文氏杆菌的高抑制率以及其抑菌活性物质的稳定性和多元性，值得进表3Bt分离株发酵液上清抑菌效果
参考文献
[1] 王利平， 代林远， 李鹏.苏云金芽孢杆菌研究进展[J].中国畜牧兽医， 2011， 38（9）： 224-227.
[2] 喻子牛， 孙明， 刘子铎.苏云金芽孢杆菌的分类及生物活性蛋白基因[J].中国生物防治， 1996（12）： 89-89.
[3] SILOSUH L A，LETHBRIDGE B J，RAFFEL L A，et al.Biological activities of two fungistatic antibiotic produced by Bacillus cereus UW85[J].Applied and Environmental Microbiology， 1994，60：2023-2030.
[4] MANKER D C，LIDSTER W D，STAMES R L，et al.Synergy between Zwittermicin A and Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki against gypsy moth （Lepidopteria： Lyman triidae）[J].Biological Control， 2000， 29（1）： 101-107.