【摘 要】
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本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系.根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303 ～ 324、443 ～
【机 构】
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徐州医学院移植免疫实验室,江苏徐州,221002徐州医学院附属医院血液科;徐州医学院移植免疫实验室,江苏徐州221002;
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本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系.根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303 ～ 324、443 ～ 464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体(pSA-1、pSA-2、pSA-3)转染人白血病U937细胞系,G418(500 mg/L)有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系；RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达.结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确.稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降(P＜0.05).结论:成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础.
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