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摘要：【目的】篩选金边也门铁花叶性状相关差异表达基因，为深入探索也门铁叶色形成的分子调控机制打下基础。【方法】基于cDNA扩增片段长度多态性分析技术（cDNA-AFLP），利用64对EcoR I和Mse I选择性扩增引物组合分析金边也门铁叶片绿色与黄色部分组织cDNA，经筛选、回收、克隆、测序和BLAST比对分析获得差异表达基因。【结果】利用64对引物组合共扩增出1726条可分辨的条带，并获得58条差异表达的转录衍生片段（TDFs），其中12条TDFs为特异性表达。12条特异性TDFs中，5条TDFs具有同源序列，另外7条TDFs无同源序列，为未知功能基因。在叶片黄化部位特异表达同源性为96%的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、紫茎泽兰明脉病毒基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因等花椰菜花叶病毒科病毒基因具有较高的同源性。【结论】M8E3B-2和M8E3B-3两条TDFs序列或来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因，且有可能参与了金边也门铁花叶叶色性状的形成过程。
关键词： 也门铁;花叶性状;cDNA-AFLP;差异表达基因
中图分类号： S687.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2129-07
cDNA-AFLP analysis on differentially expressed genes related to floral leaf characters of Dracaena fragrans cv. lindenii
LIU He-ping1，2，3， HE Ye-hua2*， LIN Jian-bo1， ZHANG Jun-li1
（1Yangjiang Polytechnic，Yangjiang， Guangdong 529500，China; 2College of Horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China; 3Institute of Fruit Science in Maoming， Maoming， Guangdong 525000， China）
Abstract：【Objective】Differentially expressed genes related to floral leaf characters of Dracaena fragrans cv. lindenii were selected to provide reference for further research into the molecular regulation mechanisms in the formation of leaf color of D. fragrans（L.） Ker-Gaw. 【Method】Based on the cDNA-amplified fragment length polymorphism（cDNA-AFLP）， 64 pairs of EcoR I and Mse I selective amplification primer groups were used to investigate the cDNA of green and yellow parts of D. fragrans cv. lindenii leaves using cDNA-AFLP analysis. Then the differentially expressed genes were obtained via screening， recovery， cloning， sequencing and Blast alignment. 【Result】Sixty-four pairs of primer combinations amplified 1726 distinguishable bands. Of which， 58 differentially expressed transcript-derived fragments（TDFs） were identified. Out of the 58 TDFs， 12 specifically expressed TDFs were obtained. Among the twelve TDFs， five shared homologous sequence， and the other seven had no homologous sequence and were unknown functional genes. Two TDFs sequence（M8E3B-2 and M8E3B-3） whose specific expression homology in yellow part of leaves was 96% shared high homology with cauliflower mosaic virus genes such as Dahlia mosaic virus Holland inclusion body， Eupatorium vein clearing virus gene and Cestrum yellow leaf curling virus. 【Conclusion】These results suggest that M8E3B-2 and M8E3B-3 TDFs sequences may both derive from one kind of cauliflower mosaic virus gene， and may be involved in the formation process of floral leaf color characters in D. fragrans cv. lindenii. Key words： Dracaena fragrans（L.） Ker-Gaw.; floral leaf character; cDNA-AFLP; differentially expressed gene
0 引言
【研究意义】也门铁[Dracaena fragrans（L.） Ker-Gaw.]又称香龙血树，是龙舌兰科（Agavaceae）龙血树属（Dracaena）常绿乔木，原产于几内亚和埃塞俄比亚，我国引种栽培后已发展成为重要的盆栽观叶植物，市场上主要有金心也门铁（D. fragrans cv. massangeana）、金边也门铁（D. fragrans cv. lindenii）和普通也门铁（D. fragrans cv.）3个品种。其中，金心也门铁和金边也门铁是普通也门铁的叶色嵌合体变异种，其叶片上的黄色和绿色条纹相间排列，色彩明亮、观赏周期长，具有较高的观赏价值和特殊园林用途，已成为园林造景的优选物种（何业华等，2008）。然而，也门铁花叶品种在离体繁殖过程中其不定芽变异较严重，致使苗木生产成本居高不下。cDNA扩增片段长度多态性分析技术（cDNA-AFLP）是将扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）和RT-PCR相结合检测基因差异表达的转录组学研究工具，具有多态性高、假阳性低、重复性高、模板需求量少且能准确反映基因时空表达差异等优点（Bachem et al.，1998），已成功应用于鉴定与植物胚胎发育（Bachem et al.，2000）、形态发生（Kwon et al.，2004;Bruggmann et al.，2005;钟文娟等，2017）、信号传导（Bove et al.，2005）和抗逆性状表达（Hmida-Sayari et al.，2005;张亮行等，2016）等相关的功能基因或分子标记。应用cDNA-AFLP筛选金边也门铁花叶性状差异表达基因，有助于开展其叶色嵌合体颜色变异分子调控机理研究。因此，了解也门铁花叶性状相关基因的差异表达，对其叶色嵌合稳定性保持、工厂化组培育苗及新品种培育具有重要意义。【前人研究进展】已有研究表明，植物生长调节物质、基本培养基种类、AgNO3和栽培基质等因素会影响也门铁的离体再生（易清等，2007）。何业华等（2008）研究发现，金心也门铁和金边也门铁在离体培养过程中其嵌合体性状极不稳定。陈丽文等（2013）研究认为，以芽繁芽的方式进行继代增殖能极大降低金心也门铁组培繁殖过程中的变异率。张北壮等（2014）的研究结果显示，温度是影响金心也门铁开花的主要环境因子。吴颜洲等（2015）通过形态学观察、致病力测定和分子生物学研究发现，引起广州地区金心也门铁叶斑病的病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）。刘新亮等（2017）研究表明，叶色突变体已成为分子生物学和发育生物学等的良好试验模型广泛应用于遗传模式、色素合成、光合作用、细胞结构与发育等基础研究。本课题组近年来聚焦也门铁变异规律、细胞学及叶绿素合成等内容，系统研究其花叶颜色变异性状。易清等（2007）通过建立也门铁离体繁殖体系，发现金边也门铁分化率较高、苗生长势差，避免脱分化形成愈伤组织及减少或阻止愈伤组织再分化是减少也门铁嵌合体品种发生变异的关键;何业华等（2008）研究发现，也门铁嵌合体性状变异率主要受芽增殖方式影响，且由腋芽分化方式产生的芽变异率最低;刘和平等（2011）、刘和平和何业华（2012）研究发现，金边也门铁叶片变异部分的黄色细胞没有完整的叶绿体结构，叶绿体破坏严重，基粒降解，片层膜结构降解，叶绿素合成在胆色素原（Porphobili-nogen，PBG）与尿卟啉原III（Uroorphyrinogen III，Urogen III）間受阻，导致颜色发生变化;而金心也门铁叶片变异部分的黄色细胞叶绿体退化程度相对较轻，形状呈圆形，结构相对完整，基粒扭曲，叶绿素总含量较低，叶绿素合成在UrogenⅢ与原卟啉间受阻。【本研究切入点】目前，针对也门铁嵌合体叶色变异性状形成的分子遗传调控机制研究鲜见报道，与该变异过程相关的功能基因亦未明确。【拟解决的关键问题】应用cDNA-AFLP从转录水平探索金边也门铁嵌合体叶片颜色变异性状相关基因的差异表达，基于EcoR I和Mse I双酶切系统，利用64对选择性扩增引物组合，对叶片黄色和绿色部分进行差异表达分析，旨在鉴定出与叶色变异性状相关的功能基因，为进一步探究其调控分子遗传机制打下良好基础，亦为花叶植物的分子遗传学研究提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
金边也门铁采自华南农业大学园艺学院实验场，为叶色嵌合性状稳定的2年生正常植株，剪取与主脉垂直的同一水平线叶片的正常部分和黄色部分，液氮速冻后-80 ℃保存备用。
1. 2 总RNA提取及双链cDNA合成
利用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）提取金边也门铁叶片组织总 RNA。用RNase-Free DNAse I [天根生化科技（北京）有限公司]处理总RNA，去除残留的基因组DNA。双链cDNA合成按照Prime ScriptTM Double Strand cDNA Synthesis Kit（日本TaKaRa公司）说明进行操作。反应产物经抽提、沉淀和洗涤后溶于20 μL TE溶液中，浓度调至20 ng/μL。
1. 3 cDNA-AFLP分析
用EcoR I和Mse I为酶切组合，对双链cDNA进行酶切，以E和M为引物进行预扩增，再以EcoR I选扩引物（E1-E8）和Mse I选扩引物（M1-M8）组合进行选择性扩增。PCR产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染法显示条带。
1. 4 差异表达TDF的回收、测序及分析 差异表达转录衍生片段（Transcript-derived fragments，TDFs）回收采用改进的煮沸法。用手术刀片从聚丙烯酰胺凝胶切取差异条带，经浸泡过夜、加热煮沸、离心收集后取上清液作为二次PCR扩增模板。使用相应的选择性扩增引物经二次扩增、纯化、连接和克隆，挑取经酶切或质粒PCR验证的阳性克隆送至华大基因（深圳）科技公司测序。测序结果先在NCBI数据库的GenBank中进行BLASTx比对分析，对无同源性的TDFs继续进行BLASTn分析;用DNASTAR和Primer 5.0、Chromas 2.0分析所克隆序列与GenBank中相关序列的同源性。
2 结果与分析
2. 1 金边也门铁花叶颜色变异的cDNA-AFLP分析结果
从图1可看出，利用Trizol试剂盒提取的金边也门铁叶片绿色和黄色部分的总RNA完整性良好、无降解，DNA污染少。从图2可看出，反转录合成的cDNA介于100～2000 bp，呈弥散纺锤状分布，反转录效率高。从图3可看出，预扩增产物的条带边缘清晰，在100～2000 bp呈连续弥散状，cDNA酶切充分，连接及预扩增效果较好。可见，构建的cDNA文库质量较好，可用于cDNA-AFLP分析。
从图4可看出，64对引物组合共扩增出1726条可分辨的TDFs条带，其中，有差异的TDFs条带58条，约占总条带数的3.36%。在58条差异TDFs中，有46条存在表达量差异，即在叶片黄色部分和绿色部分均能获得扩增条带，但条带的强弱不同（基因表达上调或下调）;剩余的12条差异TDFs仅在叶片黄色部分或绿色部分获得扩增条带，存在特异性表达差异。说明金边也门铁叶片cDNA-AFLP图谱条带非常丰富，对其进行筛选可有效获得具有价值的差异条带。
2. 2 特异表达TDFs的回收与克隆
对获得的特异性表达TDFs条带进行回收和二次PCR扩增，共得到12条有效序列;特异性表达TDFs片段主要集中在100～500 bp（图5），与cDNA-AFLP扩增获得的相应条带大小一致，且回收条带清晰、单一。对12条特异性表达TDFs进行克隆和筛选，并以菌落PCR检测确认阳性克隆，结果表明，所有阳性克隆均能扩增出目的条带（图6），可用于下一步的测序分析。
2. 3 测序分析与功能注释
挑选12条特异性表达TDFs的阳性克隆进行测序，获得的序列去除引物和质粒序列后，用BLAST进行同源性比对分析。结果发现，在12条TDFs序列中，7条TDFs在GenBank中无同源序列，可能代表未知功能基因;5条TDFs可匹配到同源序列，其中M8E3L-1、M8E3B-2和M8E3B-3的3条TDFs序列与已知基因序列的同源性较高。M8E3B-2和M8E3B-3序列是M8和E3的引物组合在叶片黄色部分扩增的特异表达TDFs，二者的同源性高达96%（表2）。
BLAST比对分析结果表明，M8E3B-2序列与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、紫茎泽兰明脉病毒基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因和紫茉莉花叶病毒基因的同源性介于76%～87%;M8E3B-3序列与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因、大丽花花叶病毒内含体蛋白基因（VI）和紫茎泽兰黄脉病毒基因的同源性介于81%～88%（表2）。说明金边也门铁叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3可能来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因。
3 讨论
基因的差异表达促使生物体表现出各种特征。研究基因差异表达的方法很多，其中基于mRNA水平研究差异表达基因的方法包括消减杂交法（Subtractive hybridization，SH）、cDNA微阵列（cDNA microarray hybridization）、差异显示PCR（Differential display RT-PCR，DDRT-PCR）、基因芯片技术、转录组分析（Transcriptomic analysis）和cDNA-AFLP等（李文雍和陈清轩，2004）。cDNA-AFLP具有假阳性低、灵敏度高、重复性好、无需预知序列信息等诸多优点，可同时研究不同时期或不同环境条件下的基因表达情况，已广泛应用于植物基因差异表达、新基因挖掘和抗逆性分子机理等方面的研究。本研究运用cDNA-AFLP对金边也门铁的叶片颜色变异性状在基因表達水平上进行分析，成功获得12条特异性表达TDFs。
近年来，国内外学者以失绿突变体植物为材料对其遗传性、光合色素组成、叶绿体结构与功能及蛋白质组分等进行了研究（赵云等，2001;范燕萍等，2006），但这些研究材料的全叶均表现为叶绿素缺乏，而非叶色嵌合体花叶。金边也门铁是研究嵌合体花叶植物花叶颜色变异的良好材料，本课题组已从生理水平对其叶色嵌合体形成机理进行了初步研究，发现其叶片绿色部分与也门铁叶片的叶绿素a、b及总叶绿素含量无显著差异，但金边也门铁叶片变异（黄色）部分的叶绿素a、b及叶绿素总含量明显低于叶片绿色部分并导致叶片颜色发生变化，且叶片黄色部分的叶绿素合成在PBG与Urogen III间受阻（刘和平等，2011），但受阻的机理目前尚未清楚。
本研究基于64对引物组合，通过克隆、测序获得了2条在叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3。经BLAST比对分析，发现这2条TDFs序列与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、紫茎泽兰明脉病毒基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因、大丽花花叶病毒内含体蛋白基因（VI）和紫茉莉花叶病毒基因等花椰菜花叶病毒科病毒基因具有较高的同源性。已有研究表明，大丽花花叶病毒和紫茎泽兰明脉病毒等花椰菜花叶病毒科病毒可引起寄主植物叶片产生花叶、明脉和斑驳等症状（Nri-singha and Indu，1999;Stavolone et al.，2003;Pahalawatta et al.，2008;Pappu et al.，2008）。病毒侵染后可破坏叶绿体的结构并影响其功能，造成叶绿素含量减少，胡萝卜素和叶黄素含量增加，产生失绿或黄化变异性状（赫尔 R，2007）。通过切片观察，发现金边也门铁花叶黄色部分变异细胞几乎没有叶绿体结构，叶绿体退化十分严重，基粒降解，片层膜结构降解（刘和平和何业华，2012）。而在叶绿素合成途径中，ProtoIX在叶绿体基质中合成后与膜结合，之后的Mg-ProtoIX及后续反应均在类囊体膜上进行，对叶绿体的瓦解较敏感。因此，推测金边也门铁叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因，且有可能参与了金边也门铁花叶叶色性状的变异过程。至于该病毒基因以何种机制导致金边也门铁叶色嵌合体的颜色发生变异，以及是病毒DNA重组整合插入黄化叶片部分的细胞基因组内发挥作用还是以病毒侵染寄生的形式产生影响，尚需进一步研究阐明。 4 结论
金边也门铁叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3或来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因，且有可能参与了金边也门铁花叶叶色性状的变异过程。
参考文献：
陈丽文，杨利平，荣薏，时群，何贵整. 2013. 金心也门铁工厂化育苗技术研究[J]. 北方园艺，（13）：138-141. [Chen L W，Yang L P，Rong Y，Shi Q，He G Z. 2013. Study on the techniques of industrialized seedling culture of Draceana arborea[J]. Northern Horticulture，（13）：138-141.]
范燕萍，李惠玲，李浩健. 2006. 几种花叶线艺兰叶片色斑色素组成和叶绿体超微结构研究[J]. 华南农业大学学报，27（2）：8-12. [Fan Y P，Li H L，Li H J. 2006. Pigment composition and ultrastructural difference of chloroplast in three kinds of variegation leaf of Cymbidium sinense[J]. Journal of South China Agricultural University，27（2）：8-12.]
赫尔 R. 2007. 马修斯植物病毒学[M]. 第4版. 北京：科学出版社. [Hull R. 2007. Marrhews’ Plant Virology[M]. The 4th Edition. Beijing：Science Press.]
何业华，刘和平，刘颂颂，易清，叶永昌，林顺权，吕长平. 2008. 也门铁嵌合体品种在离体培养中的变异规律及调控[J]. 华南农业大学学报，29（2）：70-73. [He Y H，Liu H P，Liu S S，Yi Q，Ye Y C，Lin S Q，Lü C P. 2008. Varia-tion and regulation on chimera variety of Dracaena Fragrans during in vitro culture[J]. Journal of South China Agricultural University，29（2）：70-73.]
李文雍，陈清轩. 2004. 筛选差异表达基因的方法进展[J]. 阜阳师范学院学报（自然科学版），21（1）：1-6. [Li W Y，Chen Q X. 2004. The progress in the methods for scree-ning differentially expressed genes[J]. Journal of Fuyang Teachers College（Natural Science Edition），21（1）：1-6.]
刘新亮，李先民，何小三，邱凤英，章挺. 2017. 植物叶色黄化突变分子机理的研究进展[J]. 南方农业学报，48（8）：1358-1366. [Liu X L，Li X M，He X S，Qiu F Y，Zhang T. 2017. A review：Molecular mechanism of plant yellow leaf mutation[J]. Journal of Southern Agriculture，48（8）：1358-1366.]
刘和平，何业华. 2012. 也门铁花叶性状及机理的细胞学研究[J]. 北方园艺，（16）：35-38. [Liu H P，He Y H. 2012. Cytology study on leaf-variegation character and mechanism of Dracaena fragrans[J]. Northern Horticulture，（16）：35-38.]
刘和平，何业华，林剑波，林顺权，胡桂兵，杨转英. 2011. 也门铁及其嵌合体叶绿素合成特性研究[J]. 北方园艺，（14）：120-122. [Liu H P，He Y H，Lin J B，Lin S Q，Hu G B，Yang Z Y. 2011. Studies of chlorophyll synthesis in Dracaena fragrans and its chimeras[J]. Northern Horticulture，（14）：120-122.]
吴颜洲，梁芳莹，黄江华. 2015. 金心也门铁叶斑病病原菌鉴定[J]. 广东农业科学，42（20）：68-71. [Wu Y Z，Liang F Y，Huang J H. 2015. Identification of pathogen of leaf spot disease in Dracaena arboreavar[J]. Guangdong Agricultural Sciences，42（20）：68-71.]
易清，何业华，刘颂颂，吕长平，刘和平，林顺权，朱剑云，叶永昌. 2007. 3个也门铁品种高效离体繁殖体系的建立[J]. 湖南農业大学学报（自然科学版），33（3）：48-54. [Yi Q，He Y H，Liu S S，Lü C P，Liu H P，Lin S Q，Zhu J Y，Ye Y C. 2007. Establishment of in vitro propagation system with high-efficiency based on three cultivars of Dracaena fragrans[J]. Journal of Hunan Agricultural University（Natural Sciences），33（3）：48-54.] 張北壮，张玉华，冯锡垣，霍日祥，陈敏辉，陈静虹. 2014. 金心也门铁开花因子研究[J]. 广东农业科学，41（11）：37-41. [Zhang B Z，Zhang Y H，Feng X Y，Huo R X，Chen M H，Chen J H. 2014. Study on flowering factors of Draceana arborea[J]. Guangdong Agricultural Sciences，41（11）：37-41.]
张亮行，张帆涛，温秀芳，周毅，罗向东，谢建坤. 2016. 利用cDNA-AFLP技术分析东乡野生稻干旱胁迫的差异表达基因[J]. 核农学报， 30（8）：1498-1505. [Zhang L X，Zhang F T，Wen X F，Zhou Y，Luo X D，Xie J K. 2016. Investigation based on cDNA-AFLP approach for diffe-rential expressed genes responding to drought resistance in Dongxiang wild rice[J]. Journal of Nuclear Agricultu-ral Sciences，30（8）：1498-1505.]
赵云，杜林方，杨胜洪，李世崇，张义正. 2001. 缺乏叶绿素的油菜突变体的叶绿素组成和结构变化[J]. 植物学报，43（8）：877-880. [Zhao Y，Du L F，Yang S H，Li S C，Zhang Y Z. 2001. Chloroplast composition and structural differences in a chlorophyll-reduced mutant of oilseed rape seedlings[J]. Acta Botanica Sinica，43（8）：877-880.]
钟文娟，张超，戢沛城，龚一耘，牟方生，蒲德强，袁灿，杜雄明. 2017. 棉花矮化突变体AS98差异基因表达cDNA-AFLP分析[J]. 西南农业学报， 30（5）：994-999. [Zhong W J，Zhang C，Ji P C，Gong Y Y，Mu F S，Pu D Q，Yuan C，Du X M. 2017. Differences in gene expression of cotton dwarf mutant AS98 by cDNA-AFLP analysis[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，30（5）：994-999.]
Bachem C W，Kuyt S，Horvath B M，Claassens M M，Vreugdenhil D，Visser R G. 2000. Antisense suppression of a potato alpha-SNAP homologue leads to alterations in cellular development and assimilate distribution[J]. Plant Molecular Biology，43（4）：473-482.
Bachem C W，Oomen R J，Visser R G. 1998. Transcript ima-ging with cDNA-AFLP：A step-by-step protocol[J]. Plant Molecular Biology Reporter，16（2）：157.
Bove J，Lucas P，Godin B，Oge L，Jullien M，Grappin P. 2005. Gene expression analysis by cDNA-AFLP highlights a set of new signaling networks and translational control during seed dormancy breaking in Nicotiana plumbaginifolia[J]. Plant Molecular Biology，57（4）：593-612.
Bruggmann R，Abderhalden O，Reymond P，Dudler R. 2005. Analysis of epidermis-and mesophyll-specific transcript accumulation in powdery mildew-inoculated wheat leaves[J]. Plant Molecular Biology，58（2）：247-267.
Hmida-Sayari A，Costa A，Leone A，Jaoua S，Gargouri-Bouzid R. 2005. Identification of salt stress-induced transcripts in potato leaves by cDNA-AFLP[J]. Molecular Biotechnology，30（1）：31-40.
Kwon S J，Hong S W，Kim N S. 2004. Isolation of callus-specific mRNAs from differentiating embryogenic somatic calli of Pimpinella brachycarpa by cDNA-AFLP[J]. Molecular Cell，17（1）：39-44.
Nrisingha D，Indu B M. 1999. Structure and promoter/leader deletion analysis of mirabilis mosaic virus（MMV） full-length transcript promoter in transgenic plants[J]. Plant Molecular Biology，40：771-782.
Pappu H R，Druffel K L，Miglino R，van Schadewijk A R. 2008. Nucleotide sequence and genome organization of a member of a new and distinct Caulimovirus species from dahlia[J]. Archives Virology，153：2145-2148.
Pahalawatta V，Druffel K L，Wyatt S D，Eastwell K C，Pappu H R. 2008. Genome structure and organization of a member of a novel and distinct species of the genus Caulimovirus associated with dahlia mosai[J]. Archives Virology，153：733-738.
Stavolone L，Ragozzino A，Hohn T. 2003. Characterization of Cestrum yellow leaf curling virus：A new member of the family Caulimoviridae[J]. Journal of General Virology，84：3459-3464.
关键词： 也门铁;花叶性状;cDNA-AFLP;差异表达基因
中图分类号： S687.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）11-2129-07
cDNA-AFLP analysis on differentially expressed genes related to floral leaf characters of Dracaena fragrans cv. lindenii
LIU He-ping1，2，3， HE Ye-hua2*， LIN Jian-bo1， ZHANG Jun-li1
（1Yangjiang Polytechnic，Yangjiang， Guangdong 529500，China; 2College of Horticulture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China; 3Institute of Fruit Science in Maoming， Maoming， Guangdong 525000， China）
Abstract：【Objective】Differentially expressed genes related to floral leaf characters of Dracaena fragrans cv. lindenii were selected to provide reference for further research into the molecular regulation mechanisms in the formation of leaf color of D. fragrans（L.） Ker-Gaw. 【Method】Based on the cDNA-amplified fragment length polymorphism（cDNA-AFLP）， 64 pairs of EcoR I and Mse I selective amplification primer groups were used to investigate the cDNA of green and yellow parts of D. fragrans cv. lindenii leaves using cDNA-AFLP analysis. Then the differentially expressed genes were obtained via screening， recovery， cloning， sequencing and Blast alignment. 【Result】Sixty-four pairs of primer combinations amplified 1726 distinguishable bands. Of which， 58 differentially expressed transcript-derived fragments（TDFs） were identified. Out of the 58 TDFs， 12 specifically expressed TDFs were obtained. Among the twelve TDFs， five shared homologous sequence， and the other seven had no homologous sequence and were unknown functional genes. Two TDFs sequence（M8E3B-2 and M8E3B-3） whose specific expression homology in yellow part of leaves was 96% shared high homology with cauliflower mosaic virus genes such as Dahlia mosaic virus Holland inclusion body， Eupatorium vein clearing virus gene and Cestrum yellow leaf curling virus. 【Conclusion】These results suggest that M8E3B-2 and M8E3B-3 TDFs sequences may both derive from one kind of cauliflower mosaic virus gene， and may be involved in the formation process of floral leaf color characters in D. fragrans cv. lindenii. Key words： Dracaena fragrans（L.） Ker-Gaw.; floral leaf character; cDNA-AFLP; differentially expressed gene
0 引言
【研究意义】也门铁[Dracaena fragrans（L.） Ker-Gaw.]又称香龙血树，是龙舌兰科（Agavaceae）龙血树属（Dracaena）常绿乔木，原产于几内亚和埃塞俄比亚，我国引种栽培后已发展成为重要的盆栽观叶植物，市场上主要有金心也门铁（D. fragrans cv. massangeana）、金边也门铁（D. fragrans cv. lindenii）和普通也门铁（D. fragrans cv.）3个品种。其中，金心也门铁和金边也门铁是普通也门铁的叶色嵌合体变异种，其叶片上的黄色和绿色条纹相间排列，色彩明亮、观赏周期长，具有较高的观赏价值和特殊园林用途，已成为园林造景的优选物种（何业华等，2008）。然而，也门铁花叶品种在离体繁殖过程中其不定芽变异较严重，致使苗木生产成本居高不下。cDNA扩增片段长度多态性分析技术（cDNA-AFLP）是将扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）和RT-PCR相结合检测基因差异表达的转录组学研究工具，具有多态性高、假阳性低、重复性高、模板需求量少且能准确反映基因时空表达差异等优点（Bachem et al.，1998），已成功应用于鉴定与植物胚胎发育（Bachem et al.，2000）、形态发生（Kwon et al.，2004;Bruggmann et al.，2005;钟文娟等，2017）、信号传导（Bove et al.，2005）和抗逆性状表达（Hmida-Sayari et al.，2005;张亮行等，2016）等相关的功能基因或分子标记。应用cDNA-AFLP筛选金边也门铁花叶性状差异表达基因，有助于开展其叶色嵌合体颜色变异分子调控机理研究。因此，了解也门铁花叶性状相关基因的差异表达，对其叶色嵌合稳定性保持、工厂化组培育苗及新品种培育具有重要意义。【前人研究进展】已有研究表明，植物生长调节物质、基本培养基种类、AgNO3和栽培基质等因素会影响也门铁的离体再生（易清等，2007）。何业华等（2008）研究发现，金心也门铁和金边也门铁在离体培养过程中其嵌合体性状极不稳定。陈丽文等（2013）研究认为，以芽繁芽的方式进行继代增殖能极大降低金心也门铁组培繁殖过程中的变异率。张北壮等（2014）的研究结果显示，温度是影响金心也门铁开花的主要环境因子。吴颜洲等（2015）通过形态学观察、致病力测定和分子生物学研究发现，引起广州地区金心也门铁叶斑病的病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）。刘新亮等（2017）研究表明，叶色突变体已成为分子生物学和发育生物学等的良好试验模型广泛应用于遗传模式、色素合成、光合作用、细胞结构与发育等基础研究。本课题组近年来聚焦也门铁变异规律、细胞学及叶绿素合成等内容，系统研究其花叶颜色变异性状。易清等（2007）通过建立也门铁离体繁殖体系，发现金边也门铁分化率较高、苗生长势差，避免脱分化形成愈伤组织及减少或阻止愈伤组织再分化是减少也门铁嵌合体品种发生变异的关键;何业华等（2008）研究发现，也门铁嵌合体性状变异率主要受芽增殖方式影响，且由腋芽分化方式产生的芽变异率最低;刘和平等（2011）、刘和平和何业华（2012）研究发现，金边也门铁叶片变异部分的黄色细胞没有完整的叶绿体结构，叶绿体破坏严重，基粒降解，片层膜结构降解，叶绿素合成在胆色素原（Porphobili-nogen，PBG）与尿卟啉原III（Uroorphyrinogen III，Urogen III）間受阻，导致颜色发生变化;而金心也门铁叶片变异部分的黄色细胞叶绿体退化程度相对较轻，形状呈圆形，结构相对完整，基粒扭曲，叶绿素总含量较低，叶绿素合成在UrogenⅢ与原卟啉间受阻。【本研究切入点】目前，针对也门铁嵌合体叶色变异性状形成的分子遗传调控机制研究鲜见报道，与该变异过程相关的功能基因亦未明确。【拟解决的关键问题】应用cDNA-AFLP从转录水平探索金边也门铁嵌合体叶片颜色变异性状相关基因的差异表达，基于EcoR I和Mse I双酶切系统，利用64对选择性扩增引物组合，对叶片黄色和绿色部分进行差异表达分析，旨在鉴定出与叶色变异性状相关的功能基因，为进一步探究其调控分子遗传机制打下良好基础，亦为花叶植物的分子遗传学研究提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
金边也门铁采自华南农业大学园艺学院实验场，为叶色嵌合性状稳定的2年生正常植株，剪取与主脉垂直的同一水平线叶片的正常部分和黄色部分，液氮速冻后-80 ℃保存备用。
1. 2 总RNA提取及双链cDNA合成
利用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）提取金边也门铁叶片组织总 RNA。用RNase-Free DNAse I [天根生化科技（北京）有限公司]处理总RNA，去除残留的基因组DNA。双链cDNA合成按照Prime ScriptTM Double Strand cDNA Synthesis Kit（日本TaKaRa公司）说明进行操作。反应产物经抽提、沉淀和洗涤后溶于20 μL TE溶液中，浓度调至20 ng/μL。
1. 3 cDNA-AFLP分析
用EcoR I和Mse I为酶切组合，对双链cDNA进行酶切，以E和M为引物进行预扩增，再以EcoR I选扩引物（E1-E8）和Mse I选扩引物（M1-M8）组合进行选择性扩增。PCR产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染法显示条带。
1. 4 差异表达TDF的回收、测序及分析 差异表达转录衍生片段（Transcript-derived fragments，TDFs）回收采用改进的煮沸法。用手术刀片从聚丙烯酰胺凝胶切取差异条带，经浸泡过夜、加热煮沸、离心收集后取上清液作为二次PCR扩增模板。使用相应的选择性扩增引物经二次扩增、纯化、连接和克隆，挑取经酶切或质粒PCR验证的阳性克隆送至华大基因（深圳）科技公司测序。测序结果先在NCBI数据库的GenBank中进行BLASTx比对分析，对无同源性的TDFs继续进行BLASTn分析;用DNASTAR和Primer 5.0、Chromas 2.0分析所克隆序列与GenBank中相关序列的同源性。
2 结果与分析
2. 1 金边也门铁花叶颜色变异的cDNA-AFLP分析结果
从图1可看出，利用Trizol试剂盒提取的金边也门铁叶片绿色和黄色部分的总RNA完整性良好、无降解，DNA污染少。从图2可看出，反转录合成的cDNA介于100～2000 bp，呈弥散纺锤状分布，反转录效率高。从图3可看出，预扩增产物的条带边缘清晰，在100～2000 bp呈连续弥散状，cDNA酶切充分，连接及预扩增效果较好。可见，构建的cDNA文库质量较好，可用于cDNA-AFLP分析。
从图4可看出，64对引物组合共扩增出1726条可分辨的TDFs条带，其中，有差异的TDFs条带58条，约占总条带数的3.36%。在58条差异TDFs中，有46条存在表达量差异，即在叶片黄色部分和绿色部分均能获得扩增条带，但条带的强弱不同（基因表达上调或下调）;剩余的12条差异TDFs仅在叶片黄色部分或绿色部分获得扩增条带，存在特异性表达差异。说明金边也门铁叶片cDNA-AFLP图谱条带非常丰富，对其进行筛选可有效获得具有价值的差异条带。
2. 2 特异表达TDFs的回收与克隆
对获得的特异性表达TDFs条带进行回收和二次PCR扩增，共得到12条有效序列;特异性表达TDFs片段主要集中在100～500 bp（图5），与cDNA-AFLP扩增获得的相应条带大小一致，且回收条带清晰、单一。对12条特异性表达TDFs进行克隆和筛选，并以菌落PCR检测确认阳性克隆，结果表明，所有阳性克隆均能扩增出目的条带（图6），可用于下一步的测序分析。
2. 3 测序分析与功能注释
挑选12条特异性表达TDFs的阳性克隆进行测序，获得的序列去除引物和质粒序列后，用BLAST进行同源性比对分析。结果发现，在12条TDFs序列中，7条TDFs在GenBank中无同源序列，可能代表未知功能基因;5条TDFs可匹配到同源序列，其中M8E3L-1、M8E3B-2和M8E3B-3的3条TDFs序列与已知基因序列的同源性较高。M8E3B-2和M8E3B-3序列是M8和E3的引物组合在叶片黄色部分扩增的特异表达TDFs，二者的同源性高达96%（表2）。
BLAST比对分析结果表明，M8E3B-2序列与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、紫茎泽兰明脉病毒基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因和紫茉莉花叶病毒基因的同源性介于76%～87%;M8E3B-3序列与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因、大丽花花叶病毒内含体蛋白基因（VI）和紫茎泽兰黄脉病毒基因的同源性介于81%～88%（表2）。说明金边也门铁叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3可能来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因。
3 讨论
基因的差异表达促使生物体表现出各种特征。研究基因差异表达的方法很多，其中基于mRNA水平研究差异表达基因的方法包括消减杂交法（Subtractive hybridization，SH）、cDNA微阵列（cDNA microarray hybridization）、差异显示PCR（Differential display RT-PCR，DDRT-PCR）、基因芯片技术、转录组分析（Transcriptomic analysis）和cDNA-AFLP等（李文雍和陈清轩，2004）。cDNA-AFLP具有假阳性低、灵敏度高、重复性好、无需预知序列信息等诸多优点，可同时研究不同时期或不同环境条件下的基因表达情况，已广泛应用于植物基因差异表达、新基因挖掘和抗逆性分子机理等方面的研究。本研究运用cDNA-AFLP对金边也门铁的叶片颜色变异性状在基因表達水平上进行分析，成功获得12条特异性表达TDFs。
近年来，国内外学者以失绿突变体植物为材料对其遗传性、光合色素组成、叶绿体结构与功能及蛋白质组分等进行了研究（赵云等，2001;范燕萍等，2006），但这些研究材料的全叶均表现为叶绿素缺乏，而非叶色嵌合体花叶。金边也门铁是研究嵌合体花叶植物花叶颜色变异的良好材料，本课题组已从生理水平对其叶色嵌合体形成机理进行了初步研究，发现其叶片绿色部分与也门铁叶片的叶绿素a、b及总叶绿素含量无显著差异，但金边也门铁叶片变异（黄色）部分的叶绿素a、b及叶绿素总含量明显低于叶片绿色部分并导致叶片颜色发生变化，且叶片黄色部分的叶绿素合成在PBG与Urogen III间受阻（刘和平等，2011），但受阻的机理目前尚未清楚。
本研究基于64对引物组合，通过克隆、测序获得了2条在叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3。经BLAST比对分析，发现这2条TDFs序列与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、紫茎泽兰明脉病毒基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因、大丽花花叶病毒内含体蛋白基因（VI）和紫茉莉花叶病毒基因等花椰菜花叶病毒科病毒基因具有较高的同源性。已有研究表明，大丽花花叶病毒和紫茎泽兰明脉病毒等花椰菜花叶病毒科病毒可引起寄主植物叶片产生花叶、明脉和斑驳等症状（Nri-singha and Indu，1999;Stavolone et al.，2003;Pahalawatta et al.，2008;Pappu et al.，2008）。病毒侵染后可破坏叶绿体的结构并影响其功能，造成叶绿素含量减少，胡萝卜素和叶黄素含量增加，产生失绿或黄化变异性状（赫尔 R，2007）。通过切片观察，发现金边也门铁花叶黄色部分变异细胞几乎没有叶绿体结构，叶绿体退化十分严重，基粒降解，片层膜结构降解（刘和平和何业华，2012）。而在叶绿素合成途径中，ProtoIX在叶绿体基质中合成后与膜结合，之后的Mg-ProtoIX及后续反应均在类囊体膜上进行，对叶绿体的瓦解较敏感。因此，推测金边也门铁叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因，且有可能参与了金边也门铁花叶叶色性状的变异过程。至于该病毒基因以何种机制导致金边也门铁叶色嵌合体的颜色发生变异，以及是病毒DNA重组整合插入黄化叶片部分的细胞基因组内发挥作用还是以病毒侵染寄生的形式产生影响，尚需进一步研究阐明。 4 结论
金边也门铁叶片黄色部分特异表达的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3或来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因，且有可能参与了金边也门铁花叶叶色性状的变异过程。
参考文献：
陈丽文，杨利平，荣薏，时群，何贵整. 2013. 金心也门铁工厂化育苗技术研究[J]. 北方园艺，（13）：138-141. [Chen L W，Yang L P，Rong Y，Shi Q，He G Z. 2013. Study on the techniques of industrialized seedling culture of Draceana arborea[J]. Northern Horticulture，（13）：138-141.]
范燕萍，李惠玲，李浩健. 2006. 几种花叶线艺兰叶片色斑色素组成和叶绿体超微结构研究[J]. 华南农业大学学报，27（2）：8-12. [Fan Y P，Li H L，Li H J. 2006. Pigment composition and ultrastructural difference of chloroplast in three kinds of variegation leaf of Cymbidium sinense[J]. Journal of South China Agricultural University，27（2）：8-12.]
赫尔 R. 2007. 马修斯植物病毒学[M]. 第4版. 北京：科学出版社. [Hull R. 2007. Marrhews’ Plant Virology[M]. The 4th Edition. Beijing：Science Press.]
何业华，刘和平，刘颂颂，易清，叶永昌，林顺权，吕长平. 2008. 也门铁嵌合体品种在离体培养中的变异规律及调控[J]. 华南农业大学学报，29（2）：70-73. [He Y H，Liu H P，Liu S S，Yi Q，Ye Y C，Lin S Q，Lü C P. 2008. Varia-tion and regulation on chimera variety of Dracaena Fragrans during in vitro culture[J]. Journal of South China Agricultural University，29（2）：70-73.]
李文雍，陈清轩. 2004. 筛选差异表达基因的方法进展[J]. 阜阳师范学院学报（自然科学版），21（1）：1-6. [Li W Y，Chen Q X. 2004. The progress in the methods for scree-ning differentially expressed genes[J]. Journal of Fuyang Teachers College（Natural Science Edition），21（1）：1-6.]
刘新亮，李先民，何小三，邱凤英，章挺. 2017. 植物叶色黄化突变分子机理的研究进展[J]. 南方农业学报，48（8）：1358-1366. [Liu X L，Li X M，He X S，Qiu F Y，Zhang T. 2017. A review：Molecular mechanism of plant yellow leaf mutation[J]. Journal of Southern Agriculture，48（8）：1358-1366.]
刘和平，何业华. 2012. 也门铁花叶性状及机理的细胞学研究[J]. 北方园艺，（16）：35-38. [Liu H P，He Y H. 2012. Cytology study on leaf-variegation character and mechanism of Dracaena fragrans[J]. Northern Horticulture，（16）：35-38.]
刘和平，何业华，林剑波，林顺权，胡桂兵，杨转英. 2011. 也门铁及其嵌合体叶绿素合成特性研究[J]. 北方园艺，（14）：120-122. [Liu H P，He Y H，Lin J B，Lin S Q，Hu G B，Yang Z Y. 2011. Studies of chlorophyll synthesis in Dracaena fragrans and its chimeras[J]. Northern Horticulture，（14）：120-122.]
吴颜洲，梁芳莹，黄江华. 2015. 金心也门铁叶斑病病原菌鉴定[J]. 广东农业科学，42（20）：68-71. [Wu Y Z，Liang F Y，Huang J H. 2015. Identification of pathogen of leaf spot disease in Dracaena arboreavar[J]. Guangdong Agricultural Sciences，42（20）：68-71.]
易清，何业华，刘颂颂，吕长平，刘和平，林顺权，朱剑云，叶永昌. 2007. 3个也门铁品种高效离体繁殖体系的建立[J]. 湖南農业大学学报（自然科学版），33（3）：48-54. [Yi Q，He Y H，Liu S S，Lü C P，Liu H P，Lin S Q，Zhu J Y，Ye Y C. 2007. Establishment of in vitro propagation system with high-efficiency based on three cultivars of Dracaena fragrans[J]. Journal of Hunan Agricultural University（Natural Sciences），33（3）：48-54.] 張北壮，张玉华，冯锡垣，霍日祥，陈敏辉，陈静虹. 2014. 金心也门铁开花因子研究[J]. 广东农业科学，41（11）：37-41. [Zhang B Z，Zhang Y H，Feng X Y，Huo R X，Chen M H，Chen J H. 2014. Study on flowering factors of Draceana arborea[J]. Guangdong Agricultural Sciences，41（11）：37-41.]
张亮行，张帆涛，温秀芳，周毅，罗向东，谢建坤. 2016. 利用cDNA-AFLP技术分析东乡野生稻干旱胁迫的差异表达基因[J]. 核农学报， 30（8）：1498-1505. [Zhang L X，Zhang F T，Wen X F，Zhou Y，Luo X D，Xie J K. 2016. Investigation based on cDNA-AFLP approach for diffe-rential expressed genes responding to drought resistance in Dongxiang wild rice[J]. Journal of Nuclear Agricultu-ral Sciences，30（8）：1498-1505.]
赵云，杜林方，杨胜洪，李世崇，张义正. 2001. 缺乏叶绿素的油菜突变体的叶绿素组成和结构变化[J]. 植物学报，43（8）：877-880. [Zhao Y，Du L F，Yang S H，Li S C，Zhang Y Z. 2001. Chloroplast composition and structural differences in a chlorophyll-reduced mutant of oilseed rape seedlings[J]. Acta Botanica Sinica，43（8）：877-880.]
钟文娟，张超，戢沛城，龚一耘，牟方生，蒲德强，袁灿，杜雄明. 2017. 棉花矮化突变体AS98差异基因表达cDNA-AFLP分析[J]. 西南农业学报， 30（5）：994-999. [Zhong W J，Zhang C，Ji P C，Gong Y Y，Mu F S，Pu D Q，Yuan C，Du X M. 2017. Differences in gene expression of cotton dwarf mutant AS98 by cDNA-AFLP analysis[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，30（5）：994-999.]
Bachem C W，Kuyt S，Horvath B M，Claassens M M，Vreugdenhil D，Visser R G. 2000. Antisense suppression of a potato alpha-SNAP homologue leads to alterations in cellular development and assimilate distribution[J]. Plant Molecular Biology，43（4）：473-482.
Bachem C W，Oomen R J，Visser R G. 1998. Transcript ima-ging with cDNA-AFLP：A step-by-step protocol[J]. Plant Molecular Biology Reporter，16（2）：157.
Bove J，Lucas P，Godin B，Oge L，Jullien M，Grappin P. 2005. Gene expression analysis by cDNA-AFLP highlights a set of new signaling networks and translational control during seed dormancy breaking in Nicotiana plumbaginifolia[J]. Plant Molecular Biology，57（4）：593-612.
Bruggmann R，Abderhalden O，Reymond P，Dudler R. 2005. Analysis of epidermis-and mesophyll-specific transcript accumulation in powdery mildew-inoculated wheat leaves[J]. Plant Molecular Biology，58（2）：247-267.
Hmida-Sayari A，Costa A，Leone A，Jaoua S，Gargouri-Bouzid R. 2005. Identification of salt stress-induced transcripts in potato leaves by cDNA-AFLP[J]. Molecular Biotechnology，30（1）：31-40.
Kwon S J，Hong S W，Kim N S. 2004. Isolation of callus-specific mRNAs from differentiating embryogenic somatic calli of Pimpinella brachycarpa by cDNA-AFLP[J]. Molecular Cell，17（1）：39-44.
Nrisingha D，Indu B M. 1999. Structure and promoter/leader deletion analysis of mirabilis mosaic virus（MMV） full-length transcript promoter in transgenic plants[J]. Plant Molecular Biology，40：771-782.
Pappu H R，Druffel K L，Miglino R，van Schadewijk A R. 2008. Nucleotide sequence and genome organization of a member of a new and distinct Caulimovirus species from dahlia[J]. Archives Virology，153：2145-2148.
Pahalawatta V，Druffel K L，Wyatt S D，Eastwell K C，Pappu H R. 2008. Genome structure and organization of a member of a novel and distinct species of the genus Caulimovirus associated with dahlia mosai[J]. Archives Virology，153：733-738.
Stavolone L，Ragozzino A，Hohn T. 2003. Characterization of Cestrum yellow leaf curling virus：A new member of the family Caulimoviridae[J]. Journal of General Virology，84：3459-3464.