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摘要目的：篩选医疗机构制剂活血益气方抗瘤丸（简称KLW）的制备工艺。方法：将足够量的大鼠神经胶质瘤C6细胞注射至裸鼠右侧腋窝，建立裸鼠荷瘤模型，按瘤块体积随机分组，分别灌胃给予等量的不同工艺KLW1～4，以替莫唑胺为阳性对照，以溶媒（去离子水）为模型对照，测量裸鼠体重、瘤体积，并观察给药前后小鼠症状；连续给药15 d后，处死，称量裸鼠瘤重量。结果：KLW1中、高剂量组裸鼠瘤块重量，KLW1高剂量组瘤体积，均低于模型对照组，差异有统计学意义（P<005），阳性对照组瘤块重量及瘤体积均低于模型对照组，差异有统计学意义（P<001）。其他处方组裸鼠瘤块重量、体积与模型对照组比较，差异无统计学意义（P>005）。各待测组（KLW1～4高、中、低剂量组）裸鼠体重与模型对照组比较，差异均无统计学意义（均P>005），阳性对照组给药后裸鼠体重明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<001）。各组有少量裸鼠死亡。结论：抗瘤丸在荷瘤裸鼠模型中具有一定抑瘤效果，与待测工艺比较，原制剂工艺抑瘤效果较好，成本低廉，适用于大规模现代化生产。
关键词抗瘤丸；神经胶质瘤；裸鼠；抑瘤；工艺
Technology Screening of Qi Supplement and Blood Activation Prescription Kangliu Pills Prepared by Medical Institutes Based on Nude Mice TumorBearing Model
Chen Fei，Feng Yingnan，Zhang Peng，Zhuang Wei，Lin Xiaolan
（Department of Pharmacy，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China）
AbstractObjective：To screen the preparation technology of qi reinforcement and blood circulation promotion prescriptionKang Liu Wan （KLW） for medical institutes.Methods：A sufficient amount of C6 mice neuroglioma cell were injected into nude mice right armpit to establish a Nude Mice TumorBearing model.Experimental mice were randomly divided into groups based on model tumor size and intragastrically administered with equal amounts of KLW14.Temozolomide was set as a positive control and vehicle （deionized water） as a model control.The nude mice weight and tumor size were measured，and the symptoms of mice was observed during the whole experiment.After 15 day′s experiment，the tumor was weighed.Results：The tumor weight of KLW1 middle and high dose group were lower than those in the model control group，and the difference was statistically significant （P<005）.The tumor weight and tumor size in the positive group were lower than those in the model control group，and the difference was statistically significant （P<001）.Compared with control group，all other prescription groups had no significant difference in the weight and size of tumor，and the difference was not statistically significant （P>005）.And all preparation technology test groups had no statistically significant difference in weight （P>005） when compared with control group.The positive control group was significantly decreased when compared with control group after treatment，and the difference was statistically significant （P<001）.A small number of nude mice died in each group.Conclusion：KLW has a specific antitumor effect in Nude Mice TumorBearing model.Compared with preparation test technology，traditional prescription process technology has advantage in antitumor effect，prescription cost and massproduction technologies adaptability Key WordsKang Liu Wan； Neuroglioma； Nude mice； Antitumor； Preparation technology
中图分类号：R33；R2895文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.10.057
活血益气方抗瘤丸（简称KLW）是治疗神经胶质瘤的医疗机构制剂，临床应用近40年，年销售额近300万元，临床观察结果证实了该药的有效性与安全性[1]，具有较强的市场竞争力与较深远的社会效益和经济效益，曾获北京市科技进步一等奖。但是KLW作为医疗机构制剂，仅限本医疗机构使用，为服务广大患者，急需向新药转化。鉴于KLW工艺简单并缺乏相关数据支持，故在新药研发过程中，其合理性亟待进一步探索。我们采用荷瘤裸鼠模型，以抑瘤效果为观察指标，对制剂工艺进行筛选，旨在确定KLW最优工艺，为新药研发奠定基础。
1材料与方法
11材料
111细胞与动物人神经胶质瘤细胞U87（由首都医科大学宣武医院提供）。裸小鼠BALB/c Nude，雄性，18～22 g，126只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物质量合格证号：11401300024482；11401300023307，屏障环境饲养。
112药物活血益气方KLW原工艺，简称KLW1，由首都医科大学宣武医院提供；活血益气方KLW待选工艺，简称KLW2、KLW3、KLW4，由一诺信远医药科技有限公司制备；替莫唑胺（TMZ，泰道，美国仙灵葆雅公司授权生产，批号：4DZAA04001）。
113试剂与仪器胎牛血清（FBS，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：20150517），DMEM培养基（Invitrogen corporation，批号：1177237），胰蛋白酶（Amresco Company，批号：0458）。CO2培养箱（NAPCO 6500型），生物安全柜（CLASS TYPE B2型），台式离心机（eppendorf centrifuge 5430R），电子数显卡尺（SF2000型），倒置显微镜（Leica DM3000），电子天平（PB602N，TE2101L）。
12方法
121分组与模型建立
1）分组：按照工艺不同分别设置KLW1、KLW2、KLW3、KLW4的高中低剂量组。KLW1：按照医疗机构制剂KLW（首都医科大学宣武医院，京药制字Z20063103）再注册批件（批件号：再20140137B）制法生产。KLW2：加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清浓缩，干燥。KLW3：川贝、沉香加水、乙醇分别提取2次，提取液合并，取上清液备用；三七等70%乙醇回流提取2次，提取液合并，取上清液回收乙醇；余药加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清液浓缩，与醇提液和川贝、沉香提取液合并，浓缩，干燥。KLW4：川贝、沉香加入水及乙醇分别提取2次，提取液合并，取上清液备用；三七等加70%乙醇回流提取2次，提取液合并，取上清液回收乙醇；余药加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清液浓缩，加乙醇至含醇量70%，搅匀，静置，取上清液，回收乙醇，取醇提取液和川贝、沉香提取液合并，浓缩，干燥。
2）模型建立：U87细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，置37 ℃、5%CO2的培养箱中，常规培养。取对数生长期的U87细胞，025%胰酶消化后，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗2遍，离心，用无血清的DMEM培养基重悬细胞。将细胞悬液注射至裸鼠右侧腋窝，02 mL/只，保证5×106个细胞一次性注射至裸鼠右侧腋窝。
122给药方法待动物体内瘤块长到300～1000 mm3时将裸鼠按瘤块大小分组，使每组动物的瘤块大小平均值接近，同时须考虑动物的体重，尽量使各组动物体重平均值接近。分组后立刻灌胃给予不同浓度受试药物：待测组分别给予高、中、低剂量KLW1～4，阳性对照组给予替莫唑胺胶囊（TMZ），模型对照组给予同体积的去离子水（灭菌）。给药剂量见表1。1次/d，连续给药15 d后处死裸鼠。
123检测指标分别在给药第0、3、6、9、12、15天测量动物体重、肿瘤的最大直径L（cm）和最小直径D（cm），计算各组肿瘤体积V（cm3），V=1/2×L2×D。并于给药15 d后处死，剥离瘤块称重。
13统计学方法采用SPSS 115统计软件进行数据分析。瘤块体积和重量计算为单变量因素计量资料，先进行单因素方差分析，然后根据方差分析结果，进行Dunnettt检验。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验。以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21各组小鼠行为学观察结果实验期间，KLW1高剂量组于给药后第9天死亡1只，KLW1低剂量组第9天死亡2只，KLW2低剂量组第6天死亡1只，KLW3高剂量组第9天死亡1只，KLW3中剂量组第9天死亡1只，KLW3低剂量组分别于3、6天死亡1只，KLW4中剂量组第9天死亡1只，KLW4低剂量组第12死亡1只，阳性对照组第9天死亡1只，模型对照组第3天死亡1只。各处方组和模型对照组存活裸鼠临床症状、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便等均未见明显异常。
22KLW对裸鼠体重的影响整个给药期间，KLW1～4高中低各剂量组裸鼠体重均增长，差异无统计学意义（P>005）。阳性对照组裸鼠体重逐渐降低，与模型对照组比较，阳性对照组裸鼠体重在给药后明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<001）。见图1。
23KLW对裸鼠瘤块体积的影响KLW1高剂量组在给药后第3、6、9、12、16天，KLW1中剂量组第9、12天，KLW1低剂量组第3、6、9天，LW2高剂量组第3天，KLW2中剂量组第3、6、9天，KLW2低剂量组第3天，KLW3高剂量组第3、6、9天，KLW3中剂量组第3天，KLW3低剂量组第3、6天，KLW4高剂量组第3天，KLW4中剂量组第3天，KLW4低剂量组第3、9、12天，裸鼠瘤块体积明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<005）。阳性对照组第12、16天，裸鼠瘤塊体积明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<005）。见表2。 24KLW对裸鼠瘤块重量的影响KLW1高、中剂量组裸鼠瘤块重量明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<005），其他待测组裸鼠瘤块重量与模型对照组比较，差异无统计学意义（P>005）。阳性对照组裸鼠瘤块重量明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<001）。见图2。
3讨论
KLW具有利湿解毒、扶正培本、活血化瘀的功效，用于湿热蕴毒证，适用于脑胶质瘤，脑垂体瘤的辅助治疗。临床研究[2]显示，早期前瞻性研究其总有效率为647%；回顾性研究[3]表明，该药可以延长恶性神经胶质瘤的生存时间，具有肯定疗效。基础研究表明，KLW具有抑制胶质瘤细胞增殖的作用[45]，且该作用与促进胶质瘤细胞凋亡相关；经处方筛选，得到优化的KLW处方。然而，作为医疗机构制剂，制剂工艺确定缺乏依据，无相关筛选数据，影响该药的新药研发。因此，本实验在处方优化基础上进行制备工艺筛选。
KLW由18味中药组成，由于药味较多，难以用使用正交试验的方法进行优化，故通过专家论证会的方式得出待选方KLW2、3、4，分别将待选工艺与原工艺KLW1进行抑瘤效果比较。因为原工艺为部分水提取，余下药味原粉入药的浓缩蜜丸。因此，在工艺筛选过程中，待选方保证水提部分工艺和剂型不变，为提高药物利用率，降低服药量，针对原粉入药部分进行提取工艺筛选。KLW2，模拟传统中药水煎剂，即水煎两次合并使用，浓缩加蜜制丸。KLW3，参考KLW组成药味中的有效成分，设计提取工艺。经文献检索及2015版《中国药典》要求，对抗KLW原粉入药的十三味药味逐一研究。参考君药三七、土茯苓及具有明确抗癌作用的白英、半枝莲等有效成分性质[714]，如三七有效成分为七皂苷、人参皂苷[15]、土茯苓落新妇苷及总黄酮[1617]、白英抗癌成分甾体生物碱类和皂苷类化合物[1820]、半枝莲醇提物[21]，并结合现代化工业生产的具体情况，将提取工艺设计为70%乙醇回流提取。为使方中川贝、沉香有效成分最大限度保留，采用水、乙醇分别提取。余药采取传统水煎煮方法。以上提取液合并、浓缩、制丸。KLW4，为减少给药剂量，提高制药稳定性，在KLW3基础上，对水提部分进行醇沉除杂，余下工艺同KLW3。
本实验结果表明，KLW各测试组均能在不同程度上降低裸鼠肿瘤体积及重量，其中KLW1中、高剂量组有统计学意义。各测试组的裸鼠体重与阴性对照组比较无明显区别。KLW抑瘤效果不如阳性对照药替莫唑胺，但与阳性对照组比较对裸鼠体重改变较少，体现了中药与化疗药物相比安全性高。除KLW3组死亡较多外，其余各组死亡只数近似。经专家组论证，一致认为KLW原工艺成本低廉、抑瘤效果较好，且前期临床基础扎实，适用于进一步研发推广。
参考文献
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（2017-01-03收稿責任编辑：张雄杰）
关键词抗瘤丸；神经胶质瘤；裸鼠；抑瘤；工艺
Technology Screening of Qi Supplement and Blood Activation Prescription Kangliu Pills Prepared by Medical Institutes Based on Nude Mice TumorBearing Model
Chen Fei，Feng Yingnan，Zhang Peng，Zhuang Wei，Lin Xiaolan
（Department of Pharmacy，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China）
AbstractObjective：To screen the preparation technology of qi reinforcement and blood circulation promotion prescriptionKang Liu Wan （KLW） for medical institutes.Methods：A sufficient amount of C6 mice neuroglioma cell were injected into nude mice right armpit to establish a Nude Mice TumorBearing model.Experimental mice were randomly divided into groups based on model tumor size and intragastrically administered with equal amounts of KLW14.Temozolomide was set as a positive control and vehicle （deionized water） as a model control.The nude mice weight and tumor size were measured，and the symptoms of mice was observed during the whole experiment.After 15 day′s experiment，the tumor was weighed.Results：The tumor weight of KLW1 middle and high dose group were lower than those in the model control group，and the difference was statistically significant （P<005）.The tumor weight and tumor size in the positive group were lower than those in the model control group，and the difference was statistically significant （P<001）.Compared with control group，all other prescription groups had no significant difference in the weight and size of tumor，and the difference was not statistically significant （P>005）.And all preparation technology test groups had no statistically significant difference in weight （P>005） when compared with control group.The positive control group was significantly decreased when compared with control group after treatment，and the difference was statistically significant （P<001）.A small number of nude mice died in each group.Conclusion：KLW has a specific antitumor effect in Nude Mice TumorBearing model.Compared with preparation test technology，traditional prescription process technology has advantage in antitumor effect，prescription cost and massproduction technologies adaptability Key WordsKang Liu Wan； Neuroglioma； Nude mice； Antitumor； Preparation technology
中图分类号：R33；R2895文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.10.057
活血益气方抗瘤丸（简称KLW）是治疗神经胶质瘤的医疗机构制剂，临床应用近40年，年销售额近300万元，临床观察结果证实了该药的有效性与安全性[1]，具有较强的市场竞争力与较深远的社会效益和经济效益，曾获北京市科技进步一等奖。但是KLW作为医疗机构制剂，仅限本医疗机构使用，为服务广大患者，急需向新药转化。鉴于KLW工艺简单并缺乏相关数据支持，故在新药研发过程中，其合理性亟待进一步探索。我们采用荷瘤裸鼠模型，以抑瘤效果为观察指标，对制剂工艺进行筛选，旨在确定KLW最优工艺，为新药研发奠定基础。
1材料与方法
11材料
111细胞与动物人神经胶质瘤细胞U87（由首都医科大学宣武医院提供）。裸小鼠BALB/c Nude，雄性，18～22 g，126只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物质量合格证号：11401300024482；11401300023307，屏障环境饲养。
112药物活血益气方KLW原工艺，简称KLW1，由首都医科大学宣武医院提供；活血益气方KLW待选工艺，简称KLW2、KLW3、KLW4，由一诺信远医药科技有限公司制备；替莫唑胺（TMZ，泰道，美国仙灵葆雅公司授权生产，批号：4DZAA04001）。
113试剂与仪器胎牛血清（FBS，天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号：20150517），DMEM培养基（Invitrogen corporation，批号：1177237），胰蛋白酶（Amresco Company，批号：0458）。CO2培养箱（NAPCO 6500型），生物安全柜（CLASS TYPE B2型），台式离心机（eppendorf centrifuge 5430R），电子数显卡尺（SF2000型），倒置显微镜（Leica DM3000），电子天平（PB602N，TE2101L）。
12方法
121分组与模型建立
1）分组：按照工艺不同分别设置KLW1、KLW2、KLW3、KLW4的高中低剂量组。KLW1：按照医疗机构制剂KLW（首都医科大学宣武医院，京药制字Z20063103）再注册批件（批件号：再20140137B）制法生产。KLW2：加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清浓缩，干燥。KLW3：川贝、沉香加水、乙醇分别提取2次，提取液合并，取上清液备用；三七等70%乙醇回流提取2次，提取液合并，取上清液回收乙醇；余药加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清液浓缩，与醇提液和川贝、沉香提取液合并，浓缩，干燥。KLW4：川贝、沉香加入水及乙醇分别提取2次，提取液合并，取上清液备用；三七等加70%乙醇回流提取2次，提取液合并，取上清液回收乙醇；余药加水煎煮2次，合并2次煎液，取上清液浓缩，加乙醇至含醇量70%，搅匀，静置，取上清液，回收乙醇，取醇提取液和川贝、沉香提取液合并，浓缩，干燥。
2）模型建立：U87细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，置37 ℃、5%CO2的培养箱中，常规培养。取对数生长期的U87细胞，025%胰酶消化后，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗2遍，离心，用无血清的DMEM培养基重悬细胞。将细胞悬液注射至裸鼠右侧腋窝，02 mL/只，保证5×106个细胞一次性注射至裸鼠右侧腋窝。
122给药方法待动物体内瘤块长到300～1000 mm3时将裸鼠按瘤块大小分组，使每组动物的瘤块大小平均值接近，同时须考虑动物的体重，尽量使各组动物体重平均值接近。分组后立刻灌胃给予不同浓度受试药物：待测组分别给予高、中、低剂量KLW1～4，阳性对照组给予替莫唑胺胶囊（TMZ），模型对照组给予同体积的去离子水（灭菌）。给药剂量见表1。1次/d，连续给药15 d后处死裸鼠。
123检测指标分别在给药第0、3、6、9、12、15天测量动物体重、肿瘤的最大直径L（cm）和最小直径D（cm），计算各组肿瘤体积V（cm3），V=1/2×L2×D。并于给药15 d后处死，剥离瘤块称重。
13统计学方法采用SPSS 115统计软件进行数据分析。瘤块体积和重量计算为单变量因素计量资料，先进行单因素方差分析，然后根据方差分析结果，进行Dunnettt检验。计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验。以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21各组小鼠行为学观察结果实验期间，KLW1高剂量组于给药后第9天死亡1只，KLW1低剂量组第9天死亡2只，KLW2低剂量组第6天死亡1只，KLW3高剂量组第9天死亡1只，KLW3中剂量组第9天死亡1只，KLW3低剂量组分别于3、6天死亡1只，KLW4中剂量组第9天死亡1只，KLW4低剂量组第12死亡1只，阳性对照组第9天死亡1只，模型对照组第3天死亡1只。各处方组和模型对照组存活裸鼠临床症状、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便等均未见明显异常。
22KLW对裸鼠体重的影响整个给药期间，KLW1～4高中低各剂量组裸鼠体重均增长，差异无统计学意义（P>005）。阳性对照组裸鼠体重逐渐降低，与模型对照组比较，阳性对照组裸鼠体重在给药后明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<001）。见图1。
23KLW对裸鼠瘤块体积的影响KLW1高剂量组在给药后第3、6、9、12、16天，KLW1中剂量组第9、12天，KLW1低剂量组第3、6、9天，LW2高剂量组第3天，KLW2中剂量组第3、6、9天，KLW2低剂量组第3天，KLW3高剂量组第3、6、9天，KLW3中剂量组第3天，KLW3低剂量组第3、6天，KLW4高剂量组第3天，KLW4中剂量组第3天，KLW4低剂量组第3、9、12天，裸鼠瘤块体积明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<005）。阳性对照组第12、16天，裸鼠瘤塊体积明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<005）。见表2。 24KLW对裸鼠瘤块重量的影响KLW1高、中剂量组裸鼠瘤块重量明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<005），其他待测组裸鼠瘤块重量与模型对照组比较，差异无统计学意义（P>005）。阳性对照组裸鼠瘤块重量明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P<001）。见图2。
3讨论
KLW具有利湿解毒、扶正培本、活血化瘀的功效，用于湿热蕴毒证，适用于脑胶质瘤，脑垂体瘤的辅助治疗。临床研究[2]显示，早期前瞻性研究其总有效率为647%；回顾性研究[3]表明，该药可以延长恶性神经胶质瘤的生存时间，具有肯定疗效。基础研究表明，KLW具有抑制胶质瘤细胞增殖的作用[45]，且该作用与促进胶质瘤细胞凋亡相关；经处方筛选，得到优化的KLW处方。然而，作为医疗机构制剂，制剂工艺确定缺乏依据，无相关筛选数据，影响该药的新药研发。因此，本实验在处方优化基础上进行制备工艺筛选。
KLW由18味中药组成，由于药味较多，难以用使用正交试验的方法进行优化，故通过专家论证会的方式得出待选方KLW2、3、4，分别将待选工艺与原工艺KLW1进行抑瘤效果比较。因为原工艺为部分水提取，余下药味原粉入药的浓缩蜜丸。因此，在工艺筛选过程中，待选方保证水提部分工艺和剂型不变，为提高药物利用率，降低服药量，针对原粉入药部分进行提取工艺筛选。KLW2，模拟传统中药水煎剂，即水煎两次合并使用，浓缩加蜜制丸。KLW3，参考KLW组成药味中的有效成分，设计提取工艺。经文献检索及2015版《中国药典》要求，对抗KLW原粉入药的十三味药味逐一研究。参考君药三七、土茯苓及具有明确抗癌作用的白英、半枝莲等有效成分性质[714]，如三七有效成分为七皂苷、人参皂苷[15]、土茯苓落新妇苷及总黄酮[1617]、白英抗癌成分甾体生物碱类和皂苷类化合物[1820]、半枝莲醇提物[21]，并结合现代化工业生产的具体情况，将提取工艺设计为70%乙醇回流提取。为使方中川贝、沉香有效成分最大限度保留，采用水、乙醇分别提取。余药采取传统水煎煮方法。以上提取液合并、浓缩、制丸。KLW4，为减少给药剂量，提高制药稳定性，在KLW3基础上，对水提部分进行醇沉除杂，余下工艺同KLW3。
本实验结果表明，KLW各测试组均能在不同程度上降低裸鼠肿瘤体积及重量，其中KLW1中、高剂量组有统计学意义。各测试组的裸鼠体重与阴性对照组比较无明显区别。KLW抑瘤效果不如阳性对照药替莫唑胺，但与阳性对照组比较对裸鼠体重改变较少，体现了中药与化疗药物相比安全性高。除KLW3组死亡较多外，其余各组死亡只数近似。经专家组论证，一致认为KLW原工艺成本低廉、抑瘤效果较好，且前期临床基础扎实，适用于进一步研发推广。
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（2017-01-03收稿責任编辑：张雄杰）