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作者单位：537100 广西贵港市妇幼保健院
通讯作者：钟伟明
【摘要】 目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法检测婴儿尿液人巨细胞病毒（CMV）DNA在儿科CMV感染诊断中的价值。方法 对565例临床疑诊CMV感染患儿分别应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）、酶联免疫法（ELISA）检测尿液CMV-DNA及血清CMV-IgM抗体。结果 FQ-PCR检测尿CMV-DNA的阳性率为42.83%，ELISA检测婴儿血清CMV-IgM抗体阳性率为20.18%。两种方法对CMV感染诊断符合率为76.46%，前者诊断阳性率显著高于后者（χ233.59，P<0.01）。结论 FQ-PCR检测尿液CMV-DNA是早期诊断婴儿CMV感染的敏感有效的方法。
【关键词】 荧光定量聚合酶链反应； 酶联免疫法； 巨细胞病毒
巨细胞病毒感染是由人巨细胞病毒（CMV）引起的病毒感染性疾病，可累及多脏器、多系统，临床症状多样且轻重不一。婴儿感染可导致黄疸、肝脾肿大、皮肤出血点及淤斑等，重症病死率高，并可导致运动、听力、视力及智力等多种严重的后遗症［1，2］，因而受到儿科医生的极大关注。由于CMV感染临床表现的非特异性，所以敏感和可依赖的实验诊断指标显得非常重要。目前常用的实验室诊断方法有病毒分离、ELISA检测CMV特异性抗体、抗原血症pp65的检测及DNA的定量检测。不同的方法各有优缺点。本研究采用荧光定量PCR方法检测婴儿尿液CMV DNA，并与血清抗体检测进行比较，旨在探讨尿液CMV DNA定量检测的诊断意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2009年7月～2010年10月在本院儿科住院的临床疑似CMV感染［3］的患儿565例。年龄14天～2岁。
1.2 标本收集 采集所有被检验者静脉血2 ml，3000 r/min，离心5 min分离血清，置4 ℃冰箱保存，24 h内进行CMV-IgM检测。同时，留取所有被检验者尿液5～10 ml，-20 ℃冰箱保存，24 h内进行CMV DNA检测。
1.3 试剂及实验设备 荧光定量PCR（FQ-PCR）检测：采用中山医科大学达安基因诊断公司CMV DNA荧光定量试剂盒。包括DNA提取液，单人单管反应液，CMV标准阳性模板，阴性对照。实时荧光定量PCR扩增仪（DA7600）：中山大学达安基因股份公司生产。CMV IgM抗体检测：采用美国Hope公司ELISA试剂盒进行常规血清CMV IgM抗体检测。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，计数资料比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 疑诊CMV感染565患儿尿液中CMV DNA定量检测阳性242例，阳性率为42.83%。565例患儿血清中CMV IgM抗体检测阳性114例，阳性率为20.18%。两种检测均阳性108例，均阴性317例，二者对CMV感染诊断的一致率为76.46%。FQ-PCR方法检测尿液CMV DNA阳性率显著高于ELISA方法检测血清CMV IgM阳性率，两者比较，差异有统计学意义（χ233.59，P<0.01）。
2.2 感染年龄分布 疑诊CMV感染565患儿中尿液CMV DNA定量或血清中CMV IgM抗体检测阳性共248例，其中14～30天8例，1～3个月182例，4～12个月49例，1～2岁9例。
3 讨论
儿童巨细胞病毒感染多发生于婴幼儿期，巨细胞病毒感染是我国儿科婴儿期最为常见的一种肝脏疾病。表现为黄疸型、非黄疸型肝炎，轻中度肝脾肿大，常有不同程度淤胆［4］；严重的宫内感染可影响中枢神经系统导致发育畸形及生长落后。CMV感染引起的疾病缺乏特异临床表现，诊断困难。实验室检查是诊断巨细胞病毒感染的重要手段。病毒分离作为“金标准”显然是不实用，无法广泛推广的。目前我国主要是以间接酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清CMV IgM抗体作为实验室诊断指标。IgM阳性提示近期有CMV活动性感染或潜伏的病毒可能被激活。但是CMV抗体产生有一段“窗口期”，由于IgM抗体产生本身有滞后性，当患者被病原体感染后约2周后IgM抗体才能达到被检测到的水平。另一方面，有些患者，尤其是部分婴幼儿，免疫系统发育不完善，不能产生被测量的特异性IgM抗体或滞后产生IgM抗体，易造成假阴性结果。CMV IgM抗体检测阳性114例中，其中108例尿液CMV DNA检测阳性，说明FQ-PCR检测对于CMV活动性感染诊断有很好的敏感性。本文248例病例中有190例为30 d内感染，占76.61%，与文献报道婴幼儿期高发相符［5］。
FQ-PCR是目前准确和快速的微生物定量方法［6］，能早期、灵敏检测到病毒感染，甚至比出现临床症状的时间提前3～10 d［7］。且可以进行抗病毒治疗效果监测［8］。由于尿液标本取材方便、无创，易为家长和小儿接受。本研究中，FQ-PCR方法检测尿液CMV DNA阳性率显著高于ELISA方法检测血清CMV IgM阳性率，两种方法比较有显著性差异（χ233.59，P<0.01），说明了尿CMV DNA定量检测方法的敏感性高于血清CMV IgM抗体检测法。尿FQ-PCR检测CMV DNA可以提高小儿CMV感染的检出率。与定性PCR方法相比，实时荧光定量PCR采用完全闭管检测，无PCR后处理，避免了交叉污染，通过探针杂交进一步提高了特异性；检测信号实时检测产物，定量结果准确，重复性好，可用于体内CMV的动态监测。实时荧光定量PCR法测定尿CMV DNA 含量可用于临床早期快速诊断小儿CMV感染，对于指导临床治疗、评价观察抗病毒治疗的效果具有重要意义。
参 考 文 献
［1］ Leung AK,Sauve RS,Davies HD.Congenital CytomeGal-ovirus infection.J Natl Med Assoc,2003,95（3）：213-218.
［2］ 王勇，陈珊，胡君，等.婴儿期特发性血小板减少性紫癜与人巨细胞病毒感染的关系.实用儿科临床杂志,2006,21（15）:1006-1007.
［3］ 中华医学会儿科分会感染消化学组.巨细胞病毒感染诊断方案.中华儿科杂志,1999,37（3）:441.
［4］ 王晓红,郭红梅,朱启锭，等.婴儿巨细胞病毒感染与胆道闭锁的关系.实用儿科临床杂志,2005,20（3）:274-275.
［5］ 胡艳,陈黎,舒静,等.婴儿巨细胞病毒肝炎88例.实用儿科临床杂志,2009,24（19）：1496-1498.
［6］ Kuypers J,Wright N,Ferrenberg J,et al.Comparison of real-time PCR assays with fluorescent- antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children.J Clin M icrobiol,2006,44（7）:2382-2388.
［7］ R isatti GR,Callahan JD,Nelson WM,et al.Rapid detection of classical swine fever virus by a portable Real-Time reverse Transcriptase PCR assay.J Clin Microbiol,2003,41（1）:500-505.
［8］ 徐锦,陈剑平,丁韵珍,等.尿巨细胞病毒定量检测在巨细胞病毒感染诊断中的意义.实用儿科临床杂志,2006,21（10）:596-597.
（收稿日期：2011-03-18）
（本文编辑：梅宏伟）
通讯作者：钟伟明
【摘要】 目的 探讨荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法检测婴儿尿液人巨细胞病毒（CMV）DNA在儿科CMV感染诊断中的价值。方法 对565例临床疑诊CMV感染患儿分别应用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）、酶联免疫法（ELISA）检测尿液CMV-DNA及血清CMV-IgM抗体。结果 FQ-PCR检测尿CMV-DNA的阳性率为42.83%，ELISA检测婴儿血清CMV-IgM抗体阳性率为20.18%。两种方法对CMV感染诊断符合率为76.46%，前者诊断阳性率显著高于后者（χ233.59，P<0.01）。结论 FQ-PCR检测尿液CMV-DNA是早期诊断婴儿CMV感染的敏感有效的方法。
【关键词】 荧光定量聚合酶链反应； 酶联免疫法； 巨细胞病毒
巨细胞病毒感染是由人巨细胞病毒（CMV）引起的病毒感染性疾病，可累及多脏器、多系统，临床症状多样且轻重不一。婴儿感染可导致黄疸、肝脾肿大、皮肤出血点及淤斑等，重症病死率高，并可导致运动、听力、视力及智力等多种严重的后遗症［1，2］，因而受到儿科医生的极大关注。由于CMV感染临床表现的非特异性，所以敏感和可依赖的实验诊断指标显得非常重要。目前常用的实验室诊断方法有病毒分离、ELISA检测CMV特异性抗体、抗原血症pp65的检测及DNA的定量检测。不同的方法各有优缺点。本研究采用荧光定量PCR方法检测婴儿尿液CMV DNA，并与血清抗体检测进行比较，旨在探讨尿液CMV DNA定量检测的诊断意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 2009年7月～2010年10月在本院儿科住院的临床疑似CMV感染［3］的患儿565例。年龄14天～2岁。
1.2 标本收集 采集所有被检验者静脉血2 ml，3000 r/min，离心5 min分离血清，置4 ℃冰箱保存，24 h内进行CMV-IgM检测。同时，留取所有被检验者尿液5～10 ml，-20 ℃冰箱保存，24 h内进行CMV DNA检测。
1.3 试剂及实验设备 荧光定量PCR（FQ-PCR）检测：采用中山医科大学达安基因诊断公司CMV DNA荧光定量试剂盒。包括DNA提取液，单人单管反应液，CMV标准阳性模板，阴性对照。实时荧光定量PCR扩增仪（DA7600）：中山大学达安基因股份公司生产。CMV IgM抗体检测：采用美国Hope公司ELISA试剂盒进行常规血清CMV IgM抗体检测。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理，计数资料比较采用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 疑诊CMV感染565患儿尿液中CMV DNA定量检测阳性242例，阳性率为42.83%。565例患儿血清中CMV IgM抗体检测阳性114例，阳性率为20.18%。两种检测均阳性108例，均阴性317例，二者对CMV感染诊断的一致率为76.46%。FQ-PCR方法检测尿液CMV DNA阳性率显著高于ELISA方法检测血清CMV IgM阳性率，两者比较，差异有统计学意义（χ233.59，P<0.01）。
2.2 感染年龄分布 疑诊CMV感染565患儿中尿液CMV DNA定量或血清中CMV IgM抗体检测阳性共248例，其中14～30天8例，1～3个月182例，4～12个月49例，1～2岁9例。
3 讨论
儿童巨细胞病毒感染多发生于婴幼儿期，巨细胞病毒感染是我国儿科婴儿期最为常见的一种肝脏疾病。表现为黄疸型、非黄疸型肝炎，轻中度肝脾肿大，常有不同程度淤胆［4］；严重的宫内感染可影响中枢神经系统导致发育畸形及生长落后。CMV感染引起的疾病缺乏特异临床表现，诊断困难。实验室检查是诊断巨细胞病毒感染的重要手段。病毒分离作为“金标准”显然是不实用，无法广泛推广的。目前我国主要是以间接酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清CMV IgM抗体作为实验室诊断指标。IgM阳性提示近期有CMV活动性感染或潜伏的病毒可能被激活。但是CMV抗体产生有一段“窗口期”，由于IgM抗体产生本身有滞后性，当患者被病原体感染后约2周后IgM抗体才能达到被检测到的水平。另一方面，有些患者，尤其是部分婴幼儿，免疫系统发育不完善，不能产生被测量的特异性IgM抗体或滞后产生IgM抗体，易造成假阴性结果。CMV IgM抗体检测阳性114例中，其中108例尿液CMV DNA检测阳性，说明FQ-PCR检测对于CMV活动性感染诊断有很好的敏感性。本文248例病例中有190例为30 d内感染，占76.61%，与文献报道婴幼儿期高发相符［5］。
FQ-PCR是目前准确和快速的微生物定量方法［6］，能早期、灵敏检测到病毒感染，甚至比出现临床症状的时间提前3～10 d［7］。且可以进行抗病毒治疗效果监测［8］。由于尿液标本取材方便、无创，易为家长和小儿接受。本研究中，FQ-PCR方法检测尿液CMV DNA阳性率显著高于ELISA方法检测血清CMV IgM阳性率，两种方法比较有显著性差异（χ233.59，P<0.01），说明了尿CMV DNA定量检测方法的敏感性高于血清CMV IgM抗体检测法。尿FQ-PCR检测CMV DNA可以提高小儿CMV感染的检出率。与定性PCR方法相比，实时荧光定量PCR采用完全闭管检测，无PCR后处理，避免了交叉污染，通过探针杂交进一步提高了特异性；检测信号实时检测产物，定量结果准确，重复性好，可用于体内CMV的动态监测。实时荧光定量PCR法测定尿CMV DNA 含量可用于临床早期快速诊断小儿CMV感染，对于指导临床治疗、评价观察抗病毒治疗的效果具有重要意义。
参 考 文 献
［1］ Leung AK,Sauve RS,Davies HD.Congenital CytomeGal-ovirus infection.J Natl Med Assoc,2003,95（3）：213-218.
［2］ 王勇，陈珊，胡君，等.婴儿期特发性血小板减少性紫癜与人巨细胞病毒感染的关系.实用儿科临床杂志,2006,21（15）:1006-1007.
［3］ 中华医学会儿科分会感染消化学组.巨细胞病毒感染诊断方案.中华儿科杂志,1999,37（3）:441.
［4］ 王晓红,郭红梅,朱启锭，等.婴儿巨细胞病毒感染与胆道闭锁的关系.实用儿科临床杂志,2005,20（3）:274-275.
［5］ 胡艳,陈黎,舒静,等.婴儿巨细胞病毒肝炎88例.实用儿科临床杂志,2009,24（19）：1496-1498.
［6］ Kuypers J,Wright N,Ferrenberg J,et al.Comparison of real-time PCR assays with fluorescent- antibody assays for diagnosis of respiratory virus infections in children.J Clin M icrobiol,2006,44（7）:2382-2388.
［7］ R isatti GR,Callahan JD,Nelson WM,et al.Rapid detection of classical swine fever virus by a portable Real-Time reverse Transcriptase PCR assay.J Clin Microbiol,2003,41（1）:500-505.
［8］ 徐锦,陈剑平,丁韵珍,等.尿巨细胞病毒定量检测在巨细胞病毒感染诊断中的意义.实用儿科临床杂志,2006,21（10）:596-597.
（收稿日期：2011-03-18）
（本文编辑：梅宏伟）