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摘要：目的：检测肝癌患者血液及组织中血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，分析比较二者在肝癌中的表达及意义。方法：选取在我院住院行手术切除的肝癌患者40例作为实验组，非肝癌患者40例作为对照组。采用酶联免疫吸附法和免疫组织化学法检测入组患者血液及组织中VEGF、MMP-9的表达。结果：采用酶联免疫吸附法对两组患者VEGF、MMP-9的水平进行检测，结果发现，实验组患者血液中VEGF、MMP-9明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；采用免疫组织化学法对实验组肝癌组织、对照组进行VEGF、MMP-9的检测，实验组肝癌组织VEGF、MMP-9的表达阳性率较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：VEGF、MMP-9在肝癌中表达升高，与肝癌的生长、侵袭和转移有密切的关系。
关键词：血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶；肝癌
Abstract： objective： to detect liver cancer patient's blood and tissue in the expression of VEGF and MMP-9， analysis of the relationship of them and the significance. Methods： selected hospitalized in our hospital surgical excision of 40 patients with liver cancer as the experimental group， 40 patients without liver cancer patients as control group. Using enzyme-linked immunosorbent method and test into the group of patient's blood and immune histochemical method in the organization the expression of VEGF and MMP-9. Results： using the method of enzyme-linked immunosorbent VEGF on two groups of patients， the level of MMP-9 for testing， the results found that the experimental group patients in the blood， VEGF and MMP - 9 is significantly higher than the control group， the difference was statistically significant（P<0.05）；Using immune histochemical method on experimental liver cancer tissue， the control group of VEGF， MMP - 9 test， experimental liver cancer tissue expression of VEGF， MMP - 9 higher positive rate than the control group obviously， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion： higher expression of VEGF and MMP - 9 in liver cancer， have a close relationship with metastasis of liver cancer.
Keywords： VEGF； MMP-9； Liver cancer
肝细胞癌（HCC） 的发病率逐年升高，其死亡率居全球第三位，极易发生复发转移[1]。本实验拟通过应用酶联免疫吸附法及免疫组织化学法检测在HCC血液及组织中VEGF、MMP-9的表达变化情况，探讨VEGF、MMP-9的表达与HCC侵袭转移的关系。
1.资料和方法
1.1 研究对象：
选取2012年1月至2015年1月在我院住院治疗的HCC患者40例作为实验组，经病理确诊为HCC，且未经放、化疗等抗肿瘤治疗，男性20例，女性20例，年龄31-81 岁，平均（51.23±2.63）岁，取新鲜HCC中最典型的癌灶部分。对照组患者40例，包括局灶性增生性结节16例，肝血管瘤13例，肝外伤11例，男性20 例，女性20 例，年龄34-70岁，平均（50.78±3.87）岁。入组患者的性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2 实验方法
1.2.1 酶联免疫吸附法检测两组患者血液中VEGF、MMP-9的表达
取入组患者的静脉血，离心后冻存。计算出需要的板孔数；试剂盒常温放置30min；标准品稀释；每个浓度均设5个复孔，加样；配液；洗涤；显色；终止；酶标仪以450nm的波长处测量吸光值；绘制线性回归方程，计算样品浓度。
1.2.2免疫组织化学法检测两组患者组织中VEGF、MMP-9的表达
标本切除后立即取100 mg 标本，在- 80℃超低温冰箱冻存备用。福尔马林固定；脱水、透明；浸蜡、包埋；切片、贴片、烤片；脱蜡、脱水；高压热修复；阻断：3%过氧化氢孵育10min；封闭：山羊血清封闭液室温孵育10min；加一抗50ul室温静置1h；加辣根过氧化物酶标记的二抗50ul静置10min；加链霉亲和素-过氧化物酶50ul静置10min；显色；终止；苏木素复染，盐酸酒精分化；常规脱水、透明；封片；显微镜下观察。 1.3 判断标准
以已知的该指标的免疫组化染色阳性片作阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，HE切片作对照观察。
VEGF、MMP-9 阳性结果判定以细胞核不染色，细胞膜或胞质内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，阴性（-）：染色细胞数≤10%；弱阳性（+）：染色细胞数11%～25%；阳性（++）：染色细胞数26%～50%；强阳性（+++）：染色细胞数>50%。以上均以（-）为阴性；（+）～（+++）为阳性。图像分析：计算机图像系统拍照，每张切片随机选取5个视野，并记录。
2.结果
2.1酶联免疫吸附法检测两组患者血液中VEGF、MMP-9的表达
采用酶联免疫吸附法对两组患者VEGF、MMP-9的水平进行检测，结果发现，实验组患者血液中VEGF、MMP-9明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），具体结果见表1.
表1 两组患者血液中MMP-2、MMP-9的表达比较
注：*实验组与对照组比较，差异有统计学意义，P<0.05
2.2免疫组织化学法检测两组患者组织中VEGF、MMP-9的表达
采用免疫组织化学法对实验组肝癌组织、对照组进行VEGF、MMP-9的检测，结果发现，肝癌组织中VEGF强阳性（+++）表达30例，MMP-9强阳性（+++）表达31例，阳性率为87.5%、85%；对照组阴性（-）表达分别为37例、36例，阳性率分别为7.5%、10%。实验组肝癌组织VEGF、MMP-9的表达阳性率较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），具体结果见表2。
表2 实验组及对照组VEGF、MMP-9的表达情况
注：*实验组与对照组比较，差异有统计学意义，P<0.05
3.讨论
恶性肿瘤发生侵袭、转移是由多个步骤组成的过程，细胞外基质及基底膜的降解是肿瘤发生侵袭转移的第一步，癌细胞突破细胞外基质及基底膜，向临近组织浸润，并逐渐向远处转移[2]。
血管内皮生长因子（VEGF）对血管内皮细胞的作用具有其效应的特异性。VEGF有许多生物学特性，包括促进血管内皮细胞分裂增殖，促进新生血管形成，增加血管的通透性【12】等[3]。新生的肿瘤血管，在其生成过程中，VEGF还能够刺激内皮细胞产生多种MMPs，引发激活基质降解的作用，呈现“瀑布式反应”效应，引发肿瘤细胞更加容易穿透基质组织，影响肿瘤细胞的浸润、转移[4]。
基质金属蛋白酶（MMPs）属于蛋白水解酶，重点参与细胞外基质和基底膜的降解，与肿瘤的侵袭、转移关系密切[5]。研究表明，在不同类型的肿瘤中，MMPs的表达水平与肿瘤的恶性程度相关，不仅利于细胞外基质的降解，而且能维持肿瘤微环境的稳定，促进肿瘤生长[6]。其中，Ⅳ型胶原酶（MMP-9）与肿瘤侵袭转移最为密切。
在本实验中，取入组实验组及对照组患者的静脉血，采用酶联免疫吸附法检测静脉血中VEGF、MMP-9的表达发现，实验组患者血液中VEGF、MMP-9水平明显高于对照组。将实验组患者手术切除的肝癌组织、癌旁组织以及对照组肝脏组织中，采用免疫组织化学法检测其中VEGF、MMP-9的表达发现，肝癌组织中VEGF强阳性（+++）表达30例，MMP-9强阳性（+++）表达31例，阳性率为87.5%、85%，明显高于对照组。这表明，肝癌患者VEGF、MMP-9均高表达[7]。MMPs在正常机体同样存在，肝癌组织VEGF、MMP-9的表达高于癌旁组织，具有导致肿瘤侵袭转移的能力[8]。对肝内胆管癌组织的研究发现，MMP- 9过表达是淋巴转移的前兆，肝癌可能会发生侵袭转移 [9-10]。这均与本实验结果一致。
综上所述，MMPs 是参与细胞外基质和基底膜降解的蛋白水解酶，VEGF、MMP-9在肝癌中表达升高，其表达水平与肝癌的侵袭和转移密切相关，经过进一步研究探索，会成为判断肝癌生物学行为、预测肝癌预后的新指标。
参考文献：
[1] Dominissini D， Moshkovitz S M， Amariglio N， Rechavi G. Adenosine-to-inosine RNA editing meets cancer[J]. Carcinogenesis， 2011， 32（11）：1569-1577.
[2] Edge SB， Byrd DR，Compton CC，et al. AJCC cancer staging manual[M]. 7th ed. New York： Springer， 2010， 5（3）： 130.
[3] Zhang CY， Wang ZM.Hypoxia-inducible factor HIF-1αΑα and VEGF and its receptors in gynecologic malignancies [J].International Journal of Obstetrics and Gynecology， 2011， 38（4）：320-323.
[4] Horrée N， Groot AJ， van Hattem WA，et al. HIF-1α gene mutationsassociated with higher microvessel density in endometrial carcinomas [J]. Histopathology， 2008， 52（5）： 637-639.
[5] Setton J， Wolden S， Caria N， Lee N.Definitive treatment of metastatic nasopharyngeal carcinoma： Report of 5 cases with review of literature [J] .Head Neck， 2012，34 （5）： 753-757. [6] Chellaiah MA， Ma T. Membrane localization of membrane type 1 matrix metalloproteinase by CD44 regulates the activation of promatrix metalloproteinase 9 in osteoclasts[ J]. Biomed Res Int， 2013， 2013： 302392.
[7] Cayabyab FS， Gowribai K ， Walz W. Involvement of matrix metalloproteinases-2 and -9 in the formation of a lacuna-like cerebral cavity[J]. J Neurosci Res， 2013， 91（7）： 920-933.
[8] Sun C， Wang Q， Zhou H， et al. Antisense MMP-9 RNA inhibits malignant glioma cell growth in vitro and in vivo[ J]. Neurosci Bull， 2013， 29（1）： 83-93.
[9] Kesanakurti D， Chetty C， Rajasekhar Maddirela D， et al. Functional cooperativity by direct interaction between PAK4 and MMP-2 in the regulation of anoikis resistance， migration and invasion in glioma[J]. Cell Death Dis， 2012， 3： e445.
[10] Zhuang T， Chelluboina B， Ponnala S， et al. Involvement of nitric oxide synthase in matrix metalloproteinase-9- and/or urokinase plasminogen activator receptor-mediated glioma cell migration[J]. BMC Cancer， 2013， 13： 590.
关键词：血管内皮生长因子；基质金属蛋白酶；肝癌
Abstract： objective： to detect liver cancer patient's blood and tissue in the expression of VEGF and MMP-9， analysis of the relationship of them and the significance. Methods： selected hospitalized in our hospital surgical excision of 40 patients with liver cancer as the experimental group， 40 patients without liver cancer patients as control group. Using enzyme-linked immunosorbent method and test into the group of patient's blood and immune histochemical method in the organization the expression of VEGF and MMP-9. Results： using the method of enzyme-linked immunosorbent VEGF on two groups of patients， the level of MMP-9 for testing， the results found that the experimental group patients in the blood， VEGF and MMP - 9 is significantly higher than the control group， the difference was statistically significant（P<0.05）；Using immune histochemical method on experimental liver cancer tissue， the control group of VEGF， MMP - 9 test， experimental liver cancer tissue expression of VEGF， MMP - 9 higher positive rate than the control group obviously， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion： higher expression of VEGF and MMP - 9 in liver cancer， have a close relationship with metastasis of liver cancer.
Keywords： VEGF； MMP-9； Liver cancer
肝细胞癌（HCC） 的发病率逐年升高，其死亡率居全球第三位，极易发生复发转移[1]。本实验拟通过应用酶联免疫吸附法及免疫组织化学法检测在HCC血液及组织中VEGF、MMP-9的表达变化情况，探讨VEGF、MMP-9的表达与HCC侵袭转移的关系。
1.资料和方法
1.1 研究对象：
选取2012年1月至2015年1月在我院住院治疗的HCC患者40例作为实验组，经病理确诊为HCC，且未经放、化疗等抗肿瘤治疗，男性20例，女性20例，年龄31-81 岁，平均（51.23±2.63）岁，取新鲜HCC中最典型的癌灶部分。对照组患者40例，包括局灶性增生性结节16例，肝血管瘤13例，肝外伤11例，男性20 例，女性20 例，年龄34-70岁，平均（50.78±3.87）岁。入组患者的性别、年龄等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
1.2 实验方法
1.2.1 酶联免疫吸附法检测两组患者血液中VEGF、MMP-9的表达
取入组患者的静脉血，离心后冻存。计算出需要的板孔数；试剂盒常温放置30min；标准品稀释；每个浓度均设5个复孔，加样；配液；洗涤；显色；终止；酶标仪以450nm的波长处测量吸光值；绘制线性回归方程，计算样品浓度。
1.2.2免疫组织化学法检测两组患者组织中VEGF、MMP-9的表达
标本切除后立即取100 mg 标本，在- 80℃超低温冰箱冻存备用。福尔马林固定；脱水、透明；浸蜡、包埋；切片、贴片、烤片；脱蜡、脱水；高压热修复；阻断：3%过氧化氢孵育10min；封闭：山羊血清封闭液室温孵育10min；加一抗50ul室温静置1h；加辣根过氧化物酶标记的二抗50ul静置10min；加链霉亲和素-过氧化物酶50ul静置10min；显色；终止；苏木素复染，盐酸酒精分化；常规脱水、透明；封片；显微镜下观察。 1.3 判断标准
以已知的该指标的免疫组化染色阳性片作阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，HE切片作对照观察。
VEGF、MMP-9 阳性结果判定以细胞核不染色，细胞膜或胞质内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，阴性（-）：染色细胞数≤10%；弱阳性（+）：染色细胞数11%～25%；阳性（++）：染色细胞数26%～50%；强阳性（+++）：染色细胞数>50%。以上均以（-）为阴性；（+）～（+++）为阳性。图像分析：计算机图像系统拍照，每张切片随机选取5个视野，并记录。
2.结果
2.1酶联免疫吸附法检测两组患者血液中VEGF、MMP-9的表达
采用酶联免疫吸附法对两组患者VEGF、MMP-9的水平进行检测，结果发现，实验组患者血液中VEGF、MMP-9明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），具体结果见表1.
表1 两组患者血液中MMP-2、MMP-9的表达比较
注：*实验组与对照组比较，差异有统计学意义，P<0.05
2.2免疫组织化学法检测两组患者组织中VEGF、MMP-9的表达
采用免疫组织化学法对实验组肝癌组织、对照组进行VEGF、MMP-9的检测，结果发现，肝癌组织中VEGF强阳性（+++）表达30例，MMP-9强阳性（+++）表达31例，阳性率为87.5%、85%；对照组阴性（-）表达分别为37例、36例，阳性率分别为7.5%、10%。实验组肝癌组织VEGF、MMP-9的表达阳性率较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），具体结果见表2。
表2 实验组及对照组VEGF、MMP-9的表达情况
注：*实验组与对照组比较，差异有统计学意义，P<0.05
3.讨论
恶性肿瘤发生侵袭、转移是由多个步骤组成的过程，细胞外基质及基底膜的降解是肿瘤发生侵袭转移的第一步，癌细胞突破细胞外基质及基底膜，向临近组织浸润，并逐渐向远处转移[2]。
血管内皮生长因子（VEGF）对血管内皮细胞的作用具有其效应的特异性。VEGF有许多生物学特性，包括促进血管内皮细胞分裂增殖，促进新生血管形成，增加血管的通透性【12】等[3]。新生的肿瘤血管，在其生成过程中，VEGF还能够刺激内皮细胞产生多种MMPs，引发激活基质降解的作用，呈现“瀑布式反应”效应，引发肿瘤细胞更加容易穿透基质组织，影响肿瘤细胞的浸润、转移[4]。
基质金属蛋白酶（MMPs）属于蛋白水解酶，重点参与细胞外基质和基底膜的降解，与肿瘤的侵袭、转移关系密切[5]。研究表明，在不同类型的肿瘤中，MMPs的表达水平与肿瘤的恶性程度相关，不仅利于细胞外基质的降解，而且能维持肿瘤微环境的稳定，促进肿瘤生长[6]。其中，Ⅳ型胶原酶（MMP-9）与肿瘤侵袭转移最为密切。
在本实验中，取入组实验组及对照组患者的静脉血，采用酶联免疫吸附法检测静脉血中VEGF、MMP-9的表达发现，实验组患者血液中VEGF、MMP-9水平明显高于对照组。将实验组患者手术切除的肝癌组织、癌旁组织以及对照组肝脏组织中，采用免疫组织化学法检测其中VEGF、MMP-9的表达发现，肝癌组织中VEGF强阳性（+++）表达30例，MMP-9强阳性（+++）表达31例，阳性率为87.5%、85%，明显高于对照组。这表明，肝癌患者VEGF、MMP-9均高表达[7]。MMPs在正常机体同样存在，肝癌组织VEGF、MMP-9的表达高于癌旁组织，具有导致肿瘤侵袭转移的能力[8]。对肝内胆管癌组织的研究发现，MMP- 9过表达是淋巴转移的前兆，肝癌可能会发生侵袭转移 [9-10]。这均与本实验结果一致。
综上所述，MMPs 是参与细胞外基质和基底膜降解的蛋白水解酶，VEGF、MMP-9在肝癌中表达升高，其表达水平与肝癌的侵袭和转移密切相关，经过进一步研究探索，会成为判断肝癌生物学行为、预测肝癌预后的新指标。
参考文献：
[1] Dominissini D， Moshkovitz S M， Amariglio N， Rechavi G. Adenosine-to-inosine RNA editing meets cancer[J]. Carcinogenesis， 2011， 32（11）：1569-1577.
[2] Edge SB， Byrd DR，Compton CC，et al. AJCC cancer staging manual[M]. 7th ed. New York： Springer， 2010， 5（3）： 130.
[3] Zhang CY， Wang ZM.Hypoxia-inducible factor HIF-1αΑα and VEGF and its receptors in gynecologic malignancies [J].International Journal of Obstetrics and Gynecology， 2011， 38（4）：320-323.
[4] Horrée N， Groot AJ， van Hattem WA，et al. HIF-1α gene mutationsassociated with higher microvessel density in endometrial carcinomas [J]. Histopathology， 2008， 52（5）： 637-639.
[5] Setton J， Wolden S， Caria N， Lee N.Definitive treatment of metastatic nasopharyngeal carcinoma： Report of 5 cases with review of literature [J] .Head Neck， 2012，34 （5）： 753-757. [6] Chellaiah MA， Ma T. Membrane localization of membrane type 1 matrix metalloproteinase by CD44 regulates the activation of promatrix metalloproteinase 9 in osteoclasts[ J]. Biomed Res Int， 2013， 2013： 302392.
[7] Cayabyab FS， Gowribai K ， Walz W. Involvement of matrix metalloproteinases-2 and -9 in the formation of a lacuna-like cerebral cavity[J]. J Neurosci Res， 2013， 91（7）： 920-933.
[8] Sun C， Wang Q， Zhou H， et al. Antisense MMP-9 RNA inhibits malignant glioma cell growth in vitro and in vivo[ J]. Neurosci Bull， 2013， 29（1）： 83-93.
[9] Kesanakurti D， Chetty C， Rajasekhar Maddirela D， et al. Functional cooperativity by direct interaction between PAK4 and MMP-2 in the regulation of anoikis resistance， migration and invasion in glioma[J]. Cell Death Dis， 2012， 3： e445.
[10] Zhuang T， Chelluboina B， Ponnala S， et al. Involvement of nitric oxide synthase in matrix metalloproteinase-9- and/or urokinase plasminogen activator receptor-mediated glioma cell migration[J]. BMC Cancer， 2013， 13： 590.