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摘要 建立云南卡蒂姆咖啡中L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸含量的测定方法。采用HPLC同时测定云南卡蒂姆咖啡中7种有机酸的含量，以C18为色谱柱，流动相为甲醇-0.1%磷酸水，梯度洗脱，流速0.8 mL/min.柱温：35℃，检测波长：210 nm。7种有机酸成分分离度良好;各成分质量浓度与峰面积在测定范围内均呈良好的线性关系（r>0.9995），平均加标回收率在86.31%～95.23%，0.7种有机酸的精密度及重复性的RSD值均<3.0%。该方法简便、准确、重复性好，可用于云南小粒咖啡中L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸含量的测定。
关键词 HPLC;云南卡蒂姆咖啡;有机酸
卡蒂姆咖啡是卡杜拉（Caturra）与蒂姆（HDT）杂交的品种。具有抗锈病性强、高产、植株紧凑、适应性好、耐热等特点[1]。目前，云南卡蒂姆咖啡种植面积约占全省咖啡总面积的95%以上，支撑起云南咖啡产业排行全国第一的地位。生长在高海拔的卡蒂姆咖啡豆，在2012年的杯评结果中，曾被评价为香气强，有特殊香味，酸味好，果酸强，苦味好，口感醇厚丰富，回甘强，整体口感较好[2]。这些风味的形成与有机酸有着密切的关联，咖啡豆中苦、涩、酸、甜等味道主要由非挥发性酚酸类有机酸决定：柠檬酸、酒石酸会产生酸味[3]，苹果酸会导致酸涩味[4]，其他有机酸则主要产生苦味[5]，苹果酸、柠檬酸这些有机酸引起的酸味，能让人产生愉快的感觉。这些咖啡多酚能改善微血管壁的通透性，增强血管的抵抗能力及在受损后的自我修复能力，增强毛细血管的弹性。咖啡多酚能与多种细菌的蛋白质结合，使蛋白质凝固而导致细菌死亡[6]。L-苹果酸还具有抗疲劳[7-8]、保护心脏[g]、降低抗癌药物毒副作用的功能[10]。酒石酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸在咖啡豆中含量并不高，其总量约占2.5%[11]，有关云南咖啡品质的研究，多集中于功能性成分方面的研究，如咖啡因[12-13]、绿原酸[14-15]、胡芦巴碱[18]及挥发性香气成分[17]，而对咖啡中有机酸含量研究较少，其测定方法的研究也有待探究。本文通过超声提取、小柱净化，高效液相色谱仪检测的方式，能有效富集有机酸含量，增加检验的灵敏度，为云南小粒咖啡的品质研究、质量体系建立提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 咖啡生豆样品
云南省咖啡的种植主要集中在保山市、普洱市、临沧市、德宏州，2016年此4个州市的种植面积约占全省的92% [18]，故分别采自保山市、普洱市、临沧市、德宏州4个州市的咖啡种植基地的卡蒂姆咖啡豆作为样品进行检测。
1.1.2 仪器及试剂
戴安U3000高效液相色谱仪（配置DAD检测器）;MS205DU电子分析天平（瑞士METTLERROLEDD公司）;EXceed-AC-24超纯水机（成都康宁实验专用纯水设备）;WF-1200MH超声波清洗仪（宁波海曙五方超声设备有限公司）;TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）MTN-2800W氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
强阴离子固相萃取柱（SAX）：1000 mg/6mL（购自迪马科技）。甲醇（色谱级，天津市光复精细化工研究所）;磷酸（购自美圈TEDIA）。标准品：L-苹果酸（批号：20160820;纯度：99.0%）、DL酒石酸（批号：20161227;纯度：99.9%）、柠檬酸（批号：T1703130;纯度：99.8%）、乳酸（批号：T160096;纯度：88.2%）、单宁酸（批号：20161228;纯度：98.2%）、富马酸（批号：T160077;纯度：99.9%）均购自北京坛墨质检科技有限公司，琥珀酸（批号：16985000;纯度：99.5%）购自Dr.EhrenstorferGmbH。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
Aglient ZORBAX SB-Aq C18柱（粒径5μm，柱长250 mm×4.5 mm）;流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱;流速：0.8 mL/min;检测波长：210 nm;柱温：35℃;进样量：10μL。洗脱条件见表1，液相色谱图见图1。
1.2.2 标准品的制备
取L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加0.1%的磷酸水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照溶液（L-苹果酸1.6940 mg/mL，DL-酒石酸0.8180 mg/mL，柠檬酸5.0660mg/mL，乳酸0.8960mg/mL，单宁酸0.1032 mg/mL，富马酸0.0126mg/mL，琥珀酸0.4048mg/mL）。
1.2.3 供试品溶液的制备
咖啡豆研磨成粉末（过0.45 mm筛），称取咖啡豆粉末0.7～0.8g（精确至0.0001g），置于50 mL容量瓶中，加入40℃蒸馏水约40 mL， 40℃下超声提取30 min，冷却至室温，定容，混匀。4000r/min离心10 min，上清液过滤，取25 mL滤液全部转移至经过预活化的SAX固相萃取柱中（使用前依次用5 mL甲醇、5mL水活化），控制流速在1mL/min，弃去流出液。用5mL水淋洗净化柱，弃去流出液，再用10 mL磷酸-甲醇（2%磷酸甲醇溶液）洗脱，控制流速在1mL/min，收集洗脱液，氮吹仪吹干洗脱液，用2.0mL 0.1%磷酸水溶液溶解残渣后，涡旋混匀，过0.45μm滤膜后，待测。
1.2.4 方法学考察
1.2.4.1 线性关系
以标准品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归分析，得L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单寧酸、富马酸、琥珀酸的线性回归方程，见表2。结果显示，L-苹果酸在0.0847-1.6940mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999;DL-酒石酸在0.0409～0.8180mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999;柠檬酸在0.2533-5.0660mg/mL线性关系良好，相关系数r为1.0000;乳酸在0.0448～0.8960 mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999;单宁酸在0.0052～0.1032mg/mL线性关系良好，相关系数r为0. 999 7：富马酸在0.0006-0.0126mg/mL线性关系良好，相关系数r为1.0000;琥珀酸在0.0202～0.4048mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999。 1.2.4.2 精密度
精密吸取混合標准品溶液10μL，按1.2.1色谱条件，连续进样6针，以L-苹果酸、DL-酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸的峰面积作为考察指标，计算RSD值。
1.2.4.3 重复性
称取同一咖啡豆供试品6份，按1.2.3的方法制成供试品溶液，并进样，分别计算6份供试品中L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸含量的RSD值。
1.2.4.4 稳定性
分别称取同一咖啡豆供试品溶液1份，按1.2.1色谱条件，分别于配置0、2、4、8、12、16和24 h进样，以L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸的峰面积作为考察指标，计算RSD值。
1.2.4.5 加样回收率
分别精密称取7种有机酸对照品适量，加入蒸馏水分别制成含L-苹果酸1.02mg/mL、DL-酒石酸0.05mg/mL、柠檬酸3.50mg/mL、乳酸0.25mg/mL、单宁酸0.03mg/mL、富马酸0.007mg/mL、琥珀酸0.2mg/mL的混合对照品溶液。精密称取已知7种有机酸含量的咖啡豆粉末0.300g，共9份。分别加入混合对照品溶液1.5、2和2.5 mL，各3份，混匀。按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按色谱条件测定，计算回收率及RSD值。L-苹果酸的平均回收率为91.22%， RSD为1.75%; DL-酒石酸的平均回收率为86.31%， RSD为2.65%;柠檬酸的平均回收率为95.23%，RSD为0.98%;乳酸的平均回收率为88.43%， RSD为1.84%;单宁酸的平均回收率为87.27%， RSD为2.38%;富马酸的平均回收率为94.52%，RSD为1.03%;琥珀酸的平均回收率为86.77%， RSD为2.54%。符合定量测定要求，表明本法准确可靠。
2 结果与分析
2.1 7种有机酸含量
精密称取不同产地的咖啡豆粉末0.75g，各3份，按供试品项制成供试品溶液，测定7种有机酸的含量，求平均值，结果见表3。
保山市、临沧市、普洱市、德宏州的咖啡豆（品种均为卡蒂姆）进行有机酸的含量测定结果显示：7中有机酸中含量最高的为柠檬酸，含量在9.718～11.584 mg/g;其次为L-苹果酸，含量在2.256～3.654 mg/g; DL-酒石酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸含量较低，均<1.0 mg/g。不同产地的咖啡豆中各组分在含量上存在一定差异，但在总量上无显著差异。
2.2 精密度、重复性、稳定性
实验结果（表4）显示：L-苹果酸、DL-酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸的RSD值均<1.0%.表明仪器精密度良好。
各成分的RSD值在0.79%-1.51%，表明该供试品制备方法重复性较好。
实验结果显示，供试品溶液在24h内各组分峰面积的RSD值在0.95%～1.83%，表明供试品溶液在24h内稳定。
3 讨论与结论
3.1 讨论
在试验中，对多个色谱条件进行了考察。包括对供试品提取溶剂的选择：对甲醇水的不同配比，0.1%的磷酸溶液及40℃蒸馏水的提取效果进行了比较，结果0.1%的磷酸溶液及40℃蒸馏水的提取效果较好，提取率相等，最终选择40℃蒸馏水为提取溶剂;对《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》[19]中供试品溶液的制备进行了优化：增加了超声提取，使得有机酸的溶出更加充分;将添加乙醇浓缩的过程省去，改为离心，过滤，取过滤液直接上柱的方式，不仅节约了时间，还减少了样品的损失，提高了回收率;洗脱液采取氮吹浓缩的方式，较旋转蒸发仪的浓缩方式，显著减少了测定成分的损失;对色谱条件进行了细化，使得色谱分离条件更加适合咖啡样品。
3.2 结论
有机酸是咖啡豆的重要组成部分，作为咖啡的风味物质，对咖啡的口感、质量起着关键性作用。故对咖啡质量评价时，应增加有机酸的含量指标，能更加全面、科学地评价咖啡的品质。本实验建立的HPLC方法，样品中各被组分的色谱峰基本达到基线分离，并且通过对方法学的考察，显示该分析方法准确、稳定、重复性好，适用于咖啡中有机酸的分离、鉴定及含量测定。
参考文献
[1] Dr CJ Rodrigues Junior. Rerort of the visit tothe people's Republic of China[R]. 1993.
[2]张洪波，郭铁英，匡钰，等.影响云南卡蒂姆咖啡杯品质量的因素及对策[J].热带农业科技，2018， 41（1）：36-42.
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[19] GB 5009.157-2016《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》[S].
关键词 HPLC;云南卡蒂姆咖啡;有机酸
卡蒂姆咖啡是卡杜拉（Caturra）与蒂姆（HDT）杂交的品种。具有抗锈病性强、高产、植株紧凑、适应性好、耐热等特点[1]。目前，云南卡蒂姆咖啡种植面积约占全省咖啡总面积的95%以上，支撑起云南咖啡产业排行全国第一的地位。生长在高海拔的卡蒂姆咖啡豆，在2012年的杯评结果中，曾被评价为香气强，有特殊香味，酸味好，果酸强，苦味好，口感醇厚丰富，回甘强，整体口感较好[2]。这些风味的形成与有机酸有着密切的关联，咖啡豆中苦、涩、酸、甜等味道主要由非挥发性酚酸类有机酸决定：柠檬酸、酒石酸会产生酸味[3]，苹果酸会导致酸涩味[4]，其他有机酸则主要产生苦味[5]，苹果酸、柠檬酸这些有机酸引起的酸味，能让人产生愉快的感觉。这些咖啡多酚能改善微血管壁的通透性，增强血管的抵抗能力及在受损后的自我修复能力，增强毛细血管的弹性。咖啡多酚能与多种细菌的蛋白质结合，使蛋白质凝固而导致细菌死亡[6]。L-苹果酸还具有抗疲劳[7-8]、保护心脏[g]、降低抗癌药物毒副作用的功能[10]。酒石酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸在咖啡豆中含量并不高，其总量约占2.5%[11]，有关云南咖啡品质的研究，多集中于功能性成分方面的研究，如咖啡因[12-13]、绿原酸[14-15]、胡芦巴碱[18]及挥发性香气成分[17]，而对咖啡中有机酸含量研究较少，其测定方法的研究也有待探究。本文通过超声提取、小柱净化，高效液相色谱仪检测的方式，能有效富集有机酸含量，增加检验的灵敏度，为云南小粒咖啡的品质研究、质量体系建立提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 咖啡生豆样品
云南省咖啡的种植主要集中在保山市、普洱市、临沧市、德宏州，2016年此4个州市的种植面积约占全省的92% [18]，故分别采自保山市、普洱市、临沧市、德宏州4个州市的咖啡种植基地的卡蒂姆咖啡豆作为样品进行检测。
1.1.2 仪器及试剂
戴安U3000高效液相色谱仪（配置DAD检测器）;MS205DU电子分析天平（瑞士METTLERROLEDD公司）;EXceed-AC-24超纯水机（成都康宁实验专用纯水设备）;WF-1200MH超声波清洗仪（宁波海曙五方超声设备有限公司）;TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）MTN-2800W氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
强阴离子固相萃取柱（SAX）：1000 mg/6mL（购自迪马科技）。甲醇（色谱级，天津市光复精细化工研究所）;磷酸（购自美圈TEDIA）。标准品：L-苹果酸（批号：20160820;纯度：99.0%）、DL酒石酸（批号：20161227;纯度：99.9%）、柠檬酸（批号：T1703130;纯度：99.8%）、乳酸（批号：T160096;纯度：88.2%）、单宁酸（批号：20161228;纯度：98.2%）、富马酸（批号：T160077;纯度：99.9%）均购自北京坛墨质检科技有限公司，琥珀酸（批号：16985000;纯度：99.5%）购自Dr.EhrenstorferGmbH。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
Aglient ZORBAX SB-Aq C18柱（粒径5μm，柱长250 mm×4.5 mm）;流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱;流速：0.8 mL/min;检测波长：210 nm;柱温：35℃;进样量：10μL。洗脱条件见表1，液相色谱图见图1。
1.2.2 标准品的制备
取L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸适量，精密称定，置25 mL容量瓶中，加0.1%的磷酸水溶液溶解并定容至刻度，摇匀，即得混合对照溶液（L-苹果酸1.6940 mg/mL，DL-酒石酸0.8180 mg/mL，柠檬酸5.0660mg/mL，乳酸0.8960mg/mL，单宁酸0.1032 mg/mL，富马酸0.0126mg/mL，琥珀酸0.4048mg/mL）。
1.2.3 供试品溶液的制备
咖啡豆研磨成粉末（过0.45 mm筛），称取咖啡豆粉末0.7～0.8g（精确至0.0001g），置于50 mL容量瓶中，加入40℃蒸馏水约40 mL， 40℃下超声提取30 min，冷却至室温，定容，混匀。4000r/min离心10 min，上清液过滤，取25 mL滤液全部转移至经过预活化的SAX固相萃取柱中（使用前依次用5 mL甲醇、5mL水活化），控制流速在1mL/min，弃去流出液。用5mL水淋洗净化柱，弃去流出液，再用10 mL磷酸-甲醇（2%磷酸甲醇溶液）洗脱，控制流速在1mL/min，收集洗脱液，氮吹仪吹干洗脱液，用2.0mL 0.1%磷酸水溶液溶解残渣后，涡旋混匀，过0.45μm滤膜后，待测。
1.2.4 方法学考察
1.2.4.1 线性关系
以标准品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行回归分析，得L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单寧酸、富马酸、琥珀酸的线性回归方程，见表2。结果显示，L-苹果酸在0.0847-1.6940mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999;DL-酒石酸在0.0409～0.8180mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999;柠檬酸在0.2533-5.0660mg/mL线性关系良好，相关系数r为1.0000;乳酸在0.0448～0.8960 mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999;单宁酸在0.0052～0.1032mg/mL线性关系良好，相关系数r为0. 999 7：富马酸在0.0006-0.0126mg/mL线性关系良好，相关系数r为1.0000;琥珀酸在0.0202～0.4048mg/mL线性关系良好，相关系数r为0.9999。 1.2.4.2 精密度
精密吸取混合標准品溶液10μL，按1.2.1色谱条件，连续进样6针，以L-苹果酸、DL-酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸的峰面积作为考察指标，计算RSD值。
1.2.4.3 重复性
称取同一咖啡豆供试品6份，按1.2.3的方法制成供试品溶液，并进样，分别计算6份供试品中L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸含量的RSD值。
1.2.4.4 稳定性
分别称取同一咖啡豆供试品溶液1份，按1.2.1色谱条件，分别于配置0、2、4、8、12、16和24 h进样，以L-苹果酸、DL酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸的峰面积作为考察指标，计算RSD值。
1.2.4.5 加样回收率
分别精密称取7种有机酸对照品适量，加入蒸馏水分别制成含L-苹果酸1.02mg/mL、DL-酒石酸0.05mg/mL、柠檬酸3.50mg/mL、乳酸0.25mg/mL、单宁酸0.03mg/mL、富马酸0.007mg/mL、琥珀酸0.2mg/mL的混合对照品溶液。精密称取已知7种有机酸含量的咖啡豆粉末0.300g，共9份。分别加入混合对照品溶液1.5、2和2.5 mL，各3份，混匀。按照供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按色谱条件测定，计算回收率及RSD值。L-苹果酸的平均回收率为91.22%， RSD为1.75%; DL-酒石酸的平均回收率为86.31%， RSD为2.65%;柠檬酸的平均回收率为95.23%，RSD为0.98%;乳酸的平均回收率为88.43%， RSD为1.84%;单宁酸的平均回收率为87.27%， RSD为2.38%;富马酸的平均回收率为94.52%，RSD为1.03%;琥珀酸的平均回收率为86.77%， RSD为2.54%。符合定量测定要求，表明本法准确可靠。
2 结果与分析
2.1 7种有机酸含量
精密称取不同产地的咖啡豆粉末0.75g，各3份，按供试品项制成供试品溶液，测定7种有机酸的含量，求平均值，结果见表3。
保山市、临沧市、普洱市、德宏州的咖啡豆（品种均为卡蒂姆）进行有机酸的含量测定结果显示：7中有机酸中含量最高的为柠檬酸，含量在9.718～11.584 mg/g;其次为L-苹果酸，含量在2.256～3.654 mg/g; DL-酒石酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸含量较低，均<1.0 mg/g。不同产地的咖啡豆中各组分在含量上存在一定差异，但在总量上无显著差异。
2.2 精密度、重复性、稳定性
实验结果（表4）显示：L-苹果酸、DL-酒石酸、柠檬酸、乳酸、单宁酸、富马酸、琥珀酸的RSD值均<1.0%.表明仪器精密度良好。
各成分的RSD值在0.79%-1.51%，表明该供试品制备方法重复性较好。
实验结果显示，供试品溶液在24h内各组分峰面积的RSD值在0.95%～1.83%，表明供试品溶液在24h内稳定。
3 讨论与结论
3.1 讨论
在试验中，对多个色谱条件进行了考察。包括对供试品提取溶剂的选择：对甲醇水的不同配比，0.1%的磷酸溶液及40℃蒸馏水的提取效果进行了比较，结果0.1%的磷酸溶液及40℃蒸馏水的提取效果较好，提取率相等，最终选择40℃蒸馏水为提取溶剂;对《食品安全国家标准食品中有机酸的测定》[19]中供试品溶液的制备进行了优化：增加了超声提取，使得有机酸的溶出更加充分;将添加乙醇浓缩的过程省去，改为离心，过滤，取过滤液直接上柱的方式，不仅节约了时间，还减少了样品的损失，提高了回收率;洗脱液采取氮吹浓缩的方式，较旋转蒸发仪的浓缩方式，显著减少了测定成分的损失;对色谱条件进行了细化，使得色谱分离条件更加适合咖啡样品。
3.2 结论
有机酸是咖啡豆的重要组成部分，作为咖啡的风味物质，对咖啡的口感、质量起着关键性作用。故对咖啡质量评价时，应增加有机酸的含量指标，能更加全面、科学地评价咖啡的品质。本实验建立的HPLC方法，样品中各被组分的色谱峰基本达到基线分离，并且通过对方法学的考察，显示该分析方法准确、稳定、重复性好，适用于咖啡中有机酸的分离、鉴定及含量测定。
参考文献
[1] Dr CJ Rodrigues Junior. Rerort of the visit tothe people's Republic of China[R]. 1993.
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