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[摘要] 本研究应用兔抗V.parahaemolyticus IgG-2包被硝酸纤维素膜检测线，羊抗兔IgG包被对照线，胶体金标记兔抗V.parahaemolyticus IgG-1，建立了检测副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的免疫金层析试纸条法（IGCA）。结果表明，阳性者试纸条检测线和对照线均出现红色线，实验过程仅需5～15min即可判断结果，该法对V.parahaemolyticus的最低检测量为3.60×104cfu/mL，与溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、麦氏弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门菌等常见肠道菌不发生交叉反应。将试纸条4℃存放6个月、常温存放3个月，37℃存放1个月，检测结果无差异。说明建立的试纸条检测方法操作简便快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好，结果容易观察和判断，非常适于基层养殖部门应用。
[关键词] 副溶血弧菌 胶体金 免疫层析
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称V.parahaemo- lyticus )最早是由Fujino等[1]于1953年从日本一个食物中毒患者身上初次分离得到的，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常呈多态性，有鞭毛，无荚膜和芽孢。在含3%～5%的食盐培养基中，pH7.5-8.5及37℃条件下，生长最为良好并且对酸敏感。该菌分布于世界各地，通常广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，在食物中的数量超过10 6即可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和头疼等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症甚至死亡，也曾有发烧和发冷的报道，但较少。我国沿海地区每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的报道。1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发食物中毒的规模呈明显的上升趋势，已超过沙门菌食物中毒，跃居首位[2]。为有效控制副溶血弧菌病原的发生扩散，准确即时的检测手段正是预防控制、传播的关键所在。
目前，V.parahaemolyticus的检测技术主要有传统的细菌分离培养、酶联免疫吸附 (ELISA )法[3]和免疫荧光抗体技术[4]，也有现代的分子生物学检测技术，如环介导等温扩增技术[5]、PCR技术[6-10]、荧光定量PCR技术[11-12]、UPPCR-SSCP技术[13]、变性高效液相色谱（DHPLC）技术[14]和Transcription- reverse transcription concerted(TRC)方法[15]、DNA指纹图谱技术[16]等。但综合来看，以上介绍的各种方法各有其优缺点，在快速检测、定性和精确定量方面难以兼顾。传统方法费时费力，对于需要检测大量样本的出入境检疫、食品、卫生以及兽医部门的实验室是一种沉重的负担，不仅影响检验机构的工作效率，而且使生产部门的产品运输和仓储时间延长，生产成本加大。因此，快速检测方法方面的研究越来越受到关注。
目前快速检测研究主要集中在胶体金试纸条、斑点金渗滤法、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、PCR和荧光PCR等方法上，其中免疫荧光技术和酶联免疫吸附试验需要一定的操作经验和仪器设备，而分子生物学检测技术，如PCR和荧光PCR，则更需要专业技术和检测经验以及较昂贵的检测设备，难以在口岸一线部门和基层养殖部门推广使用。免疫胶体金技术是20世纪90年代以来继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的一项新型体外固相标记免疫诊断技术，具有操作简单、快速、灵敏、可现场操作等优点[17-18]，适应于口岸快速检测的需要。本研究旨在以V.parahaemolyticus为试验材料，制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体，利用先进的胶体金生产工艺来研制检测V.parahaemol- yticus的金标检测试纸条。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
仪器主要有高速冷冻离心机(Backman)、硝酸纤维素膜（美国Millipore公司）、玻璃纤维膜（上海金标生物科技公司）、吸水纸、透析袋等；试剂均为分析纯，氯金酸（上海市试剂总厂化学试剂一厂产品）、柠檬酸三钠、酪蛋白、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、碳酸钾等，胶体金稀释液（含1％BSA，0.05％PEG20000，5％蔗糖，0.05%Tween-20的0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液）。
1.2 菌株
副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门菌、枸橼酸杆菌各1株，均由厦门出入境检验检疫局技术中心动检实验室提供。
1.3 兔抗副溶血弧菌多克隆抗体的制备与纯化
参照文献[19]中的方法稍作改进，将纯化好的副溶血弧菌接种3.5%碱性蛋白胨水，37℃培养18～24h后，用终浓度为0.3%的甲醛灭活24 h后取少量灭活菌液接种3.5%碱性蛋白胨水37℃培养24h后，检测灭活是否彻底。将灭活后的菌体用灭菌生理盐水洗涤三遍，然后再用含双抗的灭菌生理盐水稀释到原体积的1/10，将此灭活的菌液混匀后用于免疫家兔，采用背部皮下多点注射和静脉直接注射两种免疫方式，其中皮下多点注射为将菌液用弗氏完全佐剂等体积混匀后背部皮下多点注射4mL，2周后菌液用弗氏不完全佐剂等体积混匀后再次背部皮下多点注射4mL，2周后采血前5～7天静脉注射4mL，当凝集效价达到1:1280或1:2560时采血，所得抗体为兔抗V.parahaemolyticus IgG-1（简称兔抗-1）；静脉直接注射法，每10 d注射一次，首次注射1mL，第二、三、四次剂量依次为1.5、2、3mL，当凝集效价达到1:1280或1:2560时采血，所得抗体为兔抗V.parahaemolyticus IgG-2（简称兔抗-2）。将采集的血液放4℃过夜，次日3000 r/min离心10 min，分离血清，采用饱和硫酸铵沉淀法纯化[20]，然后用溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门菌、枸橼酸杆菌等菌体常温振荡吸附2～3 h，SDS-PAGE鉴定纯度[21]，直接血凝试验测定效价[22]。 1.4 胶体金的制备和金标多抗的制备
参照文献[23]的柠檬酸钠还原法并稍作改进，准确量取99 mL经0.22 ?m微孔滤膜过滤的去离子双蒸水加入到处理干净的三角锥形瓶中，再取1mL 1%氯金酸加入锥形瓶中，所得氯金酸溶液浓度为0.01%，置于磁力搅拌锅中加热至沸腾，在磁力搅拌器搅拌下快速加入2 mL的1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热煮沸，待溶液变为葡萄酒红色后再继续加热煮沸5～8 min。经紫外分光光度计测其吸收峰在520nm处，得到的胶体金颗粒直径约为20nm左右，冷却后置于4℃冰箱中避光保存。
将制备好的胶体金用0.1mol/L K2CO3调节pH至8.5[24]，取制备量的胶体金溶液，在磁力搅拌下逐滴加入纯化的兔抗-1（按每毫升胶体金溶液加入16.7?g纯化的兔抗-1），继续磁力搅拌30 min后加入经0.22 ?m滤膜过滤的5%PEG（MW6000）至终浓度为0.1%，继续磁力搅拌15min，最后放置4℃冰箱，静置过夜。次日将标记好的胶体金于4000 r/min离心10 min，取上清于15000 r/min离心30 min，小心吸弃上清，沉淀用胶体金稀释液恢复到原体积的1/20，置4℃冰箱备用。
1.5 金标快速检测试纸条的组装
把金标兔抗-1处理过的样品垫（玻璃纤维膜）、吸水纸、检测线（T线）（包被兔抗-2）和对照线（C线）（包被羊抗兔IgG）已包被好的硝酸纤维素膜（NC膜）按顺序贴到不干胶底板上，切割成条，分装到装有干燥剂的铝箔袋中密封。
1.6 胶体金免疫层析试纸条法（IGCA）最佳条件的确定[17-18]
1.6.1 最佳封闭液的选择
将T、C线已包被好相应成分的NC膜用不同配方的封闭液封闭，烘干后组装成试纸条进行IGCA实验，并将试验结果进行对比，选择条带颜色清晰且背景较浅的一组封闭液配方作为最适封闭液。
1.6.2 各成分最佳浓度和灵敏度的测定
分别把金标兔抗-1、兔抗-2和羊抗兔IgG按一定的比例进行稀释，组合成方阵，包被在玻璃纤维膜、检测线（T线）和对照线（C线）上，制成不同浓度的试纸条组合，然后用10倍梯度稀释的副溶血弧菌悬液进行检测，以得出最佳组合。
1.6.3 特异性试验
用上述条件优化后制备组装的试纸条，检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门氏菌，观察结果。
1.6.4 稳定性试验
将在同一时间按优化后的条件制备的试纸条平均分成三批，分装到装有干燥剂的铝箔袋中密封，然后分别置4℃冰箱、室温和37℃培养箱中保存，冰箱的每隔1个月取出2条，室温和培养箱的每隔1周取出2条，进行副溶血弧菌阳性检测，测试时间9个月，观察T、C线。
1.6.5 临床试验
进口冷冻带鱼、鱿鱼和墨鱼，活甲鱼、甲鱼蛋、螃蟹和虾等100份样品，用试纸条法检测，同时与传统检测方法进行比较。
2 结果与分析
2.1 最佳封闭液的选择
T、C线包被好的NC膜分别用以下8种封闭液进行封闭：(1)1%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(2)0.5%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(3)1%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(4)0.5%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(7)1%casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。(8)0.5% casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(9)1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(10)0.5% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。结果显示，用含1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS封闭效果最好，斑点显色清楚，背景较浅。如图1所示。
1-4，7-10分别为（1）-（4），（7）-（10）号封闭液
图1 最佳封闭液的选择
2.2 试纸条的最佳条件和灵敏度的确定
通过T线包被兔抗-2的抗体浓度为0、24.32、48.64、72.96、97.28、121.6、145.92、170.24mg/mL的8个浓度梯度，金标兔抗-1的体积为标记前胶体金体积的1/5、1/10、1/15、和1/20时，组合组装成方阵试纸条，然后用10倍系列稀释的副溶血弧菌菌悬液进行检测。结果当T线兔抗-2浓度为121.6mg/mL以上，金标兔抗-1的体积为标记前胶体金体积的1/15时，菌液浓度最低为3.592×106 cfu/mL时检测线显色较清楚，并且灵敏度可达到3.592×104 cfu/mL(见图2)。
对照线包被羊抗兔IgG，浓度为0、2、4、6、8、10 mg/mL的6个浓度梯度，再用前面确定的兔抗-2和金标兔抗-1的最佳浓度进行反应，最后得出C线包被羊抗兔IgG的最低浓度为6mg/mL（见图3）。
因此最终确定试纸条T线兔抗-2的浓度为121.6mg/mL，C线包被羊抗兔IgG的浓度为6mg/mL，金标兔抗-1稀释为标记前体积的1/15时显示最佳检测效果，并且灵敏度可达到3.592×104 cfu/mL。
1-6：V.parahaemolyticus的菌液浓度依次为3.592×108，3.592×107，3.592×106，3.592×105，3.592×104，3.592×103 cfu/mL
图2 灵敏度的测定
0、2、4、6、8、10依次为C线划线浓度0、2、4、6、8、10 mg/mL 图3 C线最佳划线浓度的测定
2.3 试纸条的特异性
检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、麦氏弧菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门菌7株菌株，只有V. para.的C、T线，均出现紫红色线，显示阳性结果；而其余6株菌株只有C线出现紫红色线，T线没有出现紫红色线，显示阴性结果，如图4所示。
1-7依次为沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、麦氏弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌
图4 特异性的测定
2.4 试纸条的稳定性
测试期间，4℃密封放置6个月、室温密封放置3个月、37℃温箱密封放置1个月检测结果没有异常变化，监测试纸条放置4℃保存比较稳定。
2.5 临床试验
用试纸条法检测进口冷冻带鱼、鱿鱼和墨鱼，活甲鱼、甲鱼蛋、螃蟹和虾等100份样品，结果从进口甲鱼中检出2份副溶血弧菌阳性和3份溶藻弧菌阳性，从进口螃蟹中检出1份副溶血弧菌阳性和2份溶藻弧菌阳性，检测结果与常规细菌分离鉴定结果完全吻合，但检测时间从常规检测时间至少4d缩短为2d内，大大加快了检测进程。
3 讨论
副溶血弧菌是一种广泛分布于海洋与盐湖的嗜盐性细菌，能引起虾、蟹及海产贝类患病。该菌也是引起人类食源性疾病的主要病原之一，是我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病，严重威胁人们的身体健康并造成经济财产的巨大损失[3]。1998年以来的数据显示，副溶血弧菌性食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已超过沙门氏菌食物，跃居细菌性中毒的首位。
为有效控制病原的发生扩散，有一个准确即时的检测手段正是预防控制VP传播的关键所在。近十几年，对副溶血弧菌的检测方法已从常规的培养检测发展到以免疫学或DNA为基础的快速检测。前者分离培养病原菌需要时间较长，而许多传染病在2～3d内就能造成很大的损失；免疫PCR技术和PCR-ELISA 技术虽然具有灵敏度高、特异性强、重复性好，以及不受病原发育时期的限制和不受环境影响的优点，但因使用的仪器精密、药品昂贵，同时检测程序复杂，要得到普及和广泛使用尚有一定难度；酶联免疫吸附检测技术(ELISA)，具有快速、准确、灵敏度高和可重复性强等特点，并且易制成检测特定种类病原菌的商品性试剂盒，更适合于野外操作及大量样品的检测，在病原性弧菌检测中有着突出的优点，但该方法检测所用的聚苯乙烯酶标板是一种良好的固相载体，对蛋白质有较强的物理吸附能力，但对颗粒性抗原如细菌等的吸附较差，直接将其包被在酶标板上较为困难[3]。
胶体金技术是目前比较常见的标记技术，自1971年Faulk和Taylon[25]用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合制成金标抗体检测沙门氏菌表面抗原的分布，40多年来胶体金标记技术得到不断的发展和成熟，这期间该技术发展到透射电镜、扫描电镜等各领域。它是继三大免疫标记技术之后又一较为成熟地得到广泛应用的免疫标记技术。
目前副溶血弧菌的检测方法很多，但是大多操作较复杂、检测时间较长、需要特异的引物、昂贵的试验仪器和专业的实验人员等因素导致这些方法不能适应现场的快速检测要求。本研究利用胶体金为示踪物，采用副溶血弧菌的兔多克隆抗体运用双抗夹心法成功研制了副溶血弧菌免疫层析试纸条。本试纸条法检测副溶血弧菌的灵敏度可达3.592×104 cfu/mL，与已知亚型副溶血弧菌呈强阳性反应，而与其它细菌无交叉反应。试纸条在4℃和室温存放数月，检测结果没有显著变化，说明其具有较好的稳定性。对临床采集样品阳性检出率高。由此可见，本研究研制的试纸条具有特异性强、敏感度高、稳定性好、操作简单、可现场操作、无需任何仪器和专业人员、可凭肉眼在30min内判定结果等优点，如果将此方法进行改良制备成商品试剂盒，不仅较其它方法快速准确，而且可大幅度降低检验成本，减少劳动强度，省时省料，更适合于野外操作及大批量、大范围的样品检测，有望实现对副溶血弧菌病的快速、准确诊断，特别适合于在基层单位推广使用，具有良好的应用前景。
综上所述，本研究建立的副溶血弧菌免疫金试纸条检测方法，与传统的细菌培养方法和生化鉴定相比，具有特异性强、灵敏度高，方便快捷、成本低等特点，为副溶血弧菌的检测提供了新的发展方向，有望成为简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构，对于海产品中副溶血弧菌的监控检测和养殖业健康持续发展，提高食品卫生水平，保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。
参考文献:
[1] Fujino T，Okuno Y，Nakada D，et al．On the bacteriological examination of shirasu food poisoning [J]．Med J Osaka Univ，1953（4）：299- 304.
[2] 刘秀梅. 食源性疾病监控技术的研究[J]．中国食品卫生杂志，2004，16（1）：3-9.
[3] 李国，闫茂仓，常维山，等. 文蛤副溶血弧菌间接ELISA 检测技术的研究[J]．海洋通报，2008，27（5）：85-90.
[4] 樊景凤，李光，王斌，等. 间接免疫荧光抗体技术检测凡纳滨对虾红体病病原-副溶血弧菌[J]. 海洋环境科学2007，26（6）：501-503.
[5] 徐芊，孙晓红，赵勇，等. 副溶血弧菌LAMP检测方法的建立[J]. 中国生物工程杂志，2007，27（12）：66- 72.
[6] 吕淑霞，祝儒刚，刘月萍，等. 扩增内标在副溶血弧菌多重PCR检测方法中的应用[J]. 沈阳农业大学学报，2010-12，41（6）：701- 705.
[7] 李青，钟青萍，王丽. EMA结合PCR技术有效鉴别副溶血弧茵死活细胞[J]. 华南农业大学学报，2011，32（1）：108-111.
[8] Rosec J P，Simon M，Causse V，et al. Detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus in shellfish:comparison of PCR protocols using pR72H or toxR targets with a culture method[J]. Int J Food Microbiol，2009，129（2）：136-145. [9] Haikuo Li，Huang JH，Lu JH，et al. Nanoparticle PCR:Nanogold-assisted PCR with enhanced specificity[J]. Angew. Chem.Int.Ed，2005，44（32）：5100-5103.
[10] 刘阳，孔繁德，彭小莉，等. 纳米PCR技术检测副溶血弧菌的建立与初步应用[J]. 福建畜牧兽医，2012，34（1）：9-12.
[11] 林强，李宁求，付小哲，等. 牡蛎中副溶血弧茵荧光定量PCR检测方法的建立及其应用[J]. 中国水产科学，2011，18（1）：96- 102.
[12] 王淑娜，周向阳，胡兴娟，等. 基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌[J]. 中国人兽共患病学报，2010，26 (5)：455-458.
[13] 彭宣宪，周樱，王三英，等. 采用 UPPCR-SSCP技术快速鉴定水产养殖病原性弧菌的研究[J]. 台湾海峡，2000，19（4）：260-464.
[14] 廖亮，刘宏生. 海产品中副溶血弧菌变性高效液相色谱检测技术研究[J]. 中国卫生工程学，2010，9（3）：220-222.
[15] Masuda N，Yasukaw a K，Isawa Y，et al. Rapid Detection of tdh and trh mRNAs of Vibrio parahaemolyticus by the Transcription-Reverse Transcription Concerted(TRC) Method[J]. Journal of Bioscience and Bioengneer- ing，2004(98): 236-243.
[16] Michel TK．Urease-positive-Kanagawa negative vibio parahaemolyticus from patients and environment in the pacific northwest[J]. J Clin Microbiol，1989(27)：2820- 2822.
[17] 杜玉萍，陈清，王雅贤，等. 胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究[J]. 热带医学杂志，2006，6（6）：650- 652.
[18] 罗立新，缪珑，潘力，等. 快速检测单增李斯特菌免疫胶体金层析法的研究[J]. 中国卫生检疫杂志，2006，16（2）：154-156.
[19] 朱立平，陈学清. 免疫学常用实验方法[M]. 北京：人民军医出版社，2000.
[20] 张龙翔，张庭芳，李令媛. 生化实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社，1997.
[21] 周顺伍．动物生物化学实验指导[M]．北京：中国农业出版社，2006.
[22] 王兰兰. 临床免疫学与免疫学检疫[M]. 北京: 人民卫生出版社，2007.
[23] 林清华. 免疫学实验[M]. 武汉：武汉大学出版社，1999.
[24] 李成文. 现代免疫化学技术[M]. 上海：上海科学技术出版社，1992.
[25] Faulk W，Taylorn G M. An irmnunocolloidal gold method for the electron microscope [J]. Immunochem，1971(8)：1081- 1087.
[关键词] 副溶血弧菌 胶体金 免疫层析
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，简称V.parahaemo- lyticus )最早是由Fujino等[1]于1953年从日本一个食物中毒患者身上初次分离得到的，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常呈多态性，有鞭毛，无荚膜和芽孢。在含3%～5%的食盐培养基中，pH7.5-8.5及37℃条件下，生长最为良好并且对酸敏感。该菌分布于世界各地，通常广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，在食物中的数量超过10 6即可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和头疼等典型胃肠炎反应，严重者可引起败血症甚至死亡，也曾有发烧和发冷的报道，但较少。我国沿海地区每年都有因副溶血性弧菌引起食物中毒的报道。1998年以来的资料显示，副溶血弧菌引发食物中毒的规模呈明显的上升趋势，已超过沙门菌食物中毒，跃居首位[2]。为有效控制副溶血弧菌病原的发生扩散，准确即时的检测手段正是预防控制、传播的关键所在。
目前，V.parahaemolyticus的检测技术主要有传统的细菌分离培养、酶联免疫吸附 (ELISA )法[3]和免疫荧光抗体技术[4]，也有现代的分子生物学检测技术，如环介导等温扩增技术[5]、PCR技术[6-10]、荧光定量PCR技术[11-12]、UPPCR-SSCP技术[13]、变性高效液相色谱（DHPLC）技术[14]和Transcription- reverse transcription concerted(TRC)方法[15]、DNA指纹图谱技术[16]等。但综合来看，以上介绍的各种方法各有其优缺点，在快速检测、定性和精确定量方面难以兼顾。传统方法费时费力，对于需要检测大量样本的出入境检疫、食品、卫生以及兽医部门的实验室是一种沉重的负担，不仅影响检验机构的工作效率，而且使生产部门的产品运输和仓储时间延长，生产成本加大。因此，快速检测方法方面的研究越来越受到关注。
目前快速检测研究主要集中在胶体金试纸条、斑点金渗滤法、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验、PCR和荧光PCR等方法上，其中免疫荧光技术和酶联免疫吸附试验需要一定的操作经验和仪器设备，而分子生物学检测技术，如PCR和荧光PCR，则更需要专业技术和检测经验以及较昂贵的检测设备，难以在口岸一线部门和基层养殖部门推广使用。免疫胶体金技术是20世纪90年代以来继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的一项新型体外固相标记免疫诊断技术，具有操作简单、快速、灵敏、可现场操作等优点[17-18]，适应于口岸快速检测的需要。本研究旨在以V.parahaemolyticus为试验材料，制备兔抗副溶血弧菌多克隆抗体，利用先进的胶体金生产工艺来研制检测V.parahaemol- yticus的金标检测试纸条。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
仪器主要有高速冷冻离心机(Backman)、硝酸纤维素膜（美国Millipore公司）、玻璃纤维膜（上海金标生物科技公司）、吸水纸、透析袋等；试剂均为分析纯，氯金酸（上海市试剂总厂化学试剂一厂产品）、柠檬酸三钠、酪蛋白、牛血清白蛋白、羊抗兔IgG、碳酸钾等，胶体金稀释液（含1％BSA，0.05％PEG20000，5％蔗糖，0.05%Tween-20的0.01mol/L pH7.2的PBS缓冲液）。
1.2 菌株
副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门菌、枸橼酸杆菌各1株，均由厦门出入境检验检疫局技术中心动检实验室提供。
1.3 兔抗副溶血弧菌多克隆抗体的制备与纯化
参照文献[19]中的方法稍作改进，将纯化好的副溶血弧菌接种3.5%碱性蛋白胨水，37℃培养18～24h后，用终浓度为0.3%的甲醛灭活24 h后取少量灭活菌液接种3.5%碱性蛋白胨水37℃培养24h后，检测灭活是否彻底。将灭活后的菌体用灭菌生理盐水洗涤三遍，然后再用含双抗的灭菌生理盐水稀释到原体积的1/10，将此灭活的菌液混匀后用于免疫家兔，采用背部皮下多点注射和静脉直接注射两种免疫方式，其中皮下多点注射为将菌液用弗氏完全佐剂等体积混匀后背部皮下多点注射4mL，2周后菌液用弗氏不完全佐剂等体积混匀后再次背部皮下多点注射4mL，2周后采血前5～7天静脉注射4mL，当凝集效价达到1:1280或1:2560时采血，所得抗体为兔抗V.parahaemolyticus IgG-1（简称兔抗-1）；静脉直接注射法，每10 d注射一次，首次注射1mL，第二、三、四次剂量依次为1.5、2、3mL，当凝集效价达到1:1280或1:2560时采血，所得抗体为兔抗V.parahaemolyticus IgG-2（简称兔抗-2）。将采集的血液放4℃过夜，次日3000 r/min离心10 min，分离血清，采用饱和硫酸铵沉淀法纯化[20]，然后用溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门菌、枸橼酸杆菌等菌体常温振荡吸附2～3 h，SDS-PAGE鉴定纯度[21]，直接血凝试验测定效价[22]。 1.4 胶体金的制备和金标多抗的制备
参照文献[23]的柠檬酸钠还原法并稍作改进，准确量取99 mL经0.22 ?m微孔滤膜过滤的去离子双蒸水加入到处理干净的三角锥形瓶中，再取1mL 1%氯金酸加入锥形瓶中，所得氯金酸溶液浓度为0.01%，置于磁力搅拌锅中加热至沸腾，在磁力搅拌器搅拌下快速加入2 mL的1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌加热煮沸，待溶液变为葡萄酒红色后再继续加热煮沸5～8 min。经紫外分光光度计测其吸收峰在520nm处，得到的胶体金颗粒直径约为20nm左右，冷却后置于4℃冰箱中避光保存。
将制备好的胶体金用0.1mol/L K2CO3调节pH至8.5[24]，取制备量的胶体金溶液，在磁力搅拌下逐滴加入纯化的兔抗-1（按每毫升胶体金溶液加入16.7?g纯化的兔抗-1），继续磁力搅拌30 min后加入经0.22 ?m滤膜过滤的5%PEG（MW6000）至终浓度为0.1%，继续磁力搅拌15min，最后放置4℃冰箱，静置过夜。次日将标记好的胶体金于4000 r/min离心10 min，取上清于15000 r/min离心30 min，小心吸弃上清，沉淀用胶体金稀释液恢复到原体积的1/20，置4℃冰箱备用。
1.5 金标快速检测试纸条的组装
把金标兔抗-1处理过的样品垫（玻璃纤维膜）、吸水纸、检测线（T线）（包被兔抗-2）和对照线（C线）（包被羊抗兔IgG）已包被好的硝酸纤维素膜（NC膜）按顺序贴到不干胶底板上，切割成条，分装到装有干燥剂的铝箔袋中密封。
1.6 胶体金免疫层析试纸条法（IGCA）最佳条件的确定[17-18]
1.6.1 最佳封闭液的选择
将T、C线已包被好相应成分的NC膜用不同配方的封闭液封闭，烘干后组装成试纸条进行IGCA实验，并将试验结果进行对比，选择条带颜色清晰且背景较浅的一组封闭液配方作为最适封闭液。
1.6.2 各成分最佳浓度和灵敏度的测定
分别把金标兔抗-1、兔抗-2和羊抗兔IgG按一定的比例进行稀释，组合成方阵，包被在玻璃纤维膜、检测线（T线）和对照线（C线）上，制成不同浓度的试纸条组合，然后用10倍梯度稀释的副溶血弧菌悬液进行检测，以得出最佳组合。
1.6.3 特异性试验
用上述条件优化后制备组装的试纸条，检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门氏菌，观察结果。
1.6.4 稳定性试验
将在同一时间按优化后的条件制备的试纸条平均分成三批，分装到装有干燥剂的铝箔袋中密封，然后分别置4℃冰箱、室温和37℃培养箱中保存，冰箱的每隔1个月取出2条，室温和培养箱的每隔1周取出2条，进行副溶血弧菌阳性检测，测试时间9个月，观察T、C线。
1.6.5 临床试验
进口冷冻带鱼、鱿鱼和墨鱼，活甲鱼、甲鱼蛋、螃蟹和虾等100份样品，用试纸条法检测，同时与传统检测方法进行比较。
2 结果与分析
2.1 最佳封闭液的选择
T、C线包被好的NC膜分别用以下8种封闭液进行封闭：(1)1%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(2)0.5%BSA、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(3)1%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(4)0.5%BSA、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(7)1%casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。(8)0.5% casein、0.5%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(9)1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS；(10)0.5% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS。结果显示，用含1% casein、0.05%Tween-20的0.01 mol/L pH7.2的PBS封闭效果最好，斑点显色清楚，背景较浅。如图1所示。
1-4，7-10分别为（1）-（4），（7）-（10）号封闭液
图1 最佳封闭液的选择
2.2 试纸条的最佳条件和灵敏度的确定
通过T线包被兔抗-2的抗体浓度为0、24.32、48.64、72.96、97.28、121.6、145.92、170.24mg/mL的8个浓度梯度，金标兔抗-1的体积为标记前胶体金体积的1/5、1/10、1/15、和1/20时，组合组装成方阵试纸条，然后用10倍系列稀释的副溶血弧菌菌悬液进行检测。结果当T线兔抗-2浓度为121.6mg/mL以上，金标兔抗-1的体积为标记前胶体金体积的1/15时，菌液浓度最低为3.592×106 cfu/mL时检测线显色较清楚，并且灵敏度可达到3.592×104 cfu/mL(见图2)。
对照线包被羊抗兔IgG，浓度为0、2、4、6、8、10 mg/mL的6个浓度梯度，再用前面确定的兔抗-2和金标兔抗-1的最佳浓度进行反应，最后得出C线包被羊抗兔IgG的最低浓度为6mg/mL（见图3）。
因此最终确定试纸条T线兔抗-2的浓度为121.6mg/mL，C线包被羊抗兔IgG的浓度为6mg/mL，金标兔抗-1稀释为标记前体积的1/15时显示最佳检测效果，并且灵敏度可达到3.592×104 cfu/mL。
1-6：V.parahaemolyticus的菌液浓度依次为3.592×108，3.592×107，3.592×106，3.592×105，3.592×104，3.592×103 cfu/mL
图2 灵敏度的测定
0、2、4、6、8、10依次为C线划线浓度0、2、4、6、8、10 mg/mL 图3 C线最佳划线浓度的测定
2.3 试纸条的特异性
检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、麦氏弧菌、弗氏枸橼酸杆菌、沙门菌7株菌株，只有V. para.的C、T线，均出现紫红色线，显示阳性结果；而其余6株菌株只有C线出现紫红色线，T线没有出现紫红色线，显示阴性结果，如图4所示。
1-7依次为沙门氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、麦氏弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌
图4 特异性的测定
2.4 试纸条的稳定性
测试期间，4℃密封放置6个月、室温密封放置3个月、37℃温箱密封放置1个月检测结果没有异常变化，监测试纸条放置4℃保存比较稳定。
2.5 临床试验
用试纸条法检测进口冷冻带鱼、鱿鱼和墨鱼，活甲鱼、甲鱼蛋、螃蟹和虾等100份样品，结果从进口甲鱼中检出2份副溶血弧菌阳性和3份溶藻弧菌阳性，从进口螃蟹中检出1份副溶血弧菌阳性和2份溶藻弧菌阳性，检测结果与常规细菌分离鉴定结果完全吻合，但检测时间从常规检测时间至少4d缩短为2d内，大大加快了检测进程。
3 讨论
副溶血弧菌是一种广泛分布于海洋与盐湖的嗜盐性细菌，能引起虾、蟹及海产贝类患病。该菌也是引起人类食源性疾病的主要病原之一，是我国沿海地区食物中毒和夏季腹泻的重要病，严重威胁人们的身体健康并造成经济财产的巨大损失[3]。1998年以来的数据显示，副溶血弧菌性食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已超过沙门氏菌食物，跃居细菌性中毒的首位。
为有效控制病原的发生扩散，有一个准确即时的检测手段正是预防控制VP传播的关键所在。近十几年，对副溶血弧菌的检测方法已从常规的培养检测发展到以免疫学或DNA为基础的快速检测。前者分离培养病原菌需要时间较长，而许多传染病在2～3d内就能造成很大的损失；免疫PCR技术和PCR-ELISA 技术虽然具有灵敏度高、特异性强、重复性好，以及不受病原发育时期的限制和不受环境影响的优点，但因使用的仪器精密、药品昂贵，同时检测程序复杂，要得到普及和广泛使用尚有一定难度；酶联免疫吸附检测技术(ELISA)，具有快速、准确、灵敏度高和可重复性强等特点，并且易制成检测特定种类病原菌的商品性试剂盒，更适合于野外操作及大量样品的检测，在病原性弧菌检测中有着突出的优点，但该方法检测所用的聚苯乙烯酶标板是一种良好的固相载体，对蛋白质有较强的物理吸附能力，但对颗粒性抗原如细菌等的吸附较差，直接将其包被在酶标板上较为困难[3]。
胶体金技术是目前比较常见的标记技术，自1971年Faulk和Taylon[25]用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合制成金标抗体检测沙门氏菌表面抗原的分布，40多年来胶体金标记技术得到不断的发展和成熟，这期间该技术发展到透射电镜、扫描电镜等各领域。它是继三大免疫标记技术之后又一较为成熟地得到广泛应用的免疫标记技术。
目前副溶血弧菌的检测方法很多，但是大多操作较复杂、检测时间较长、需要特异的引物、昂贵的试验仪器和专业的实验人员等因素导致这些方法不能适应现场的快速检测要求。本研究利用胶体金为示踪物，采用副溶血弧菌的兔多克隆抗体运用双抗夹心法成功研制了副溶血弧菌免疫层析试纸条。本试纸条法检测副溶血弧菌的灵敏度可达3.592×104 cfu/mL，与已知亚型副溶血弧菌呈强阳性反应，而与其它细菌无交叉反应。试纸条在4℃和室温存放数月，检测结果没有显著变化，说明其具有较好的稳定性。对临床采集样品阳性检出率高。由此可见，本研究研制的试纸条具有特异性强、敏感度高、稳定性好、操作简单、可现场操作、无需任何仪器和专业人员、可凭肉眼在30min内判定结果等优点，如果将此方法进行改良制备成商品试剂盒，不仅较其它方法快速准确，而且可大幅度降低检验成本，减少劳动强度，省时省料，更适合于野外操作及大批量、大范围的样品检测，有望实现对副溶血弧菌病的快速、准确诊断，特别适合于在基层单位推广使用，具有良好的应用前景。
综上所述，本研究建立的副溶血弧菌免疫金试纸条检测方法，与传统的细菌培养方法和生化鉴定相比，具有特异性强、灵敏度高，方便快捷、成本低等特点，为副溶血弧菌的检测提供了新的发展方向，有望成为简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构，对于海产品中副溶血弧菌的监控检测和养殖业健康持续发展，提高食品卫生水平，保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。
参考文献:
[1] Fujino T，Okuno Y，Nakada D，et al．On the bacteriological examination of shirasu food poisoning [J]．Med J Osaka Univ，1953（4）：299- 304.
[2] 刘秀梅. 食源性疾病监控技术的研究[J]．中国食品卫生杂志，2004，16（1）：3-9.
[3] 李国，闫茂仓，常维山，等. 文蛤副溶血弧菌间接ELISA 检测技术的研究[J]．海洋通报，2008，27（5）：85-90.
[4] 樊景凤，李光，王斌，等. 间接免疫荧光抗体技术检测凡纳滨对虾红体病病原-副溶血弧菌[J]. 海洋环境科学2007，26（6）：501-503.
[5] 徐芊，孙晓红，赵勇，等. 副溶血弧菌LAMP检测方法的建立[J]. 中国生物工程杂志，2007，27（12）：66- 72.
[6] 吕淑霞，祝儒刚，刘月萍，等. 扩增内标在副溶血弧菌多重PCR检测方法中的应用[J]. 沈阳农业大学学报，2010-12，41（6）：701- 705.
[7] 李青，钟青萍，王丽. EMA结合PCR技术有效鉴别副溶血弧茵死活细胞[J]. 华南农业大学学报，2011，32（1）：108-111.
[8] Rosec J P，Simon M，Causse V，et al. Detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus in shellfish:comparison of PCR protocols using pR72H or toxR targets with a culture method[J]. Int J Food Microbiol，2009，129（2）：136-145. [9] Haikuo Li，Huang JH，Lu JH，et al. Nanoparticle PCR:Nanogold-assisted PCR with enhanced specificity[J]. Angew. Chem.Int.Ed，2005，44（32）：5100-5103.
[10] 刘阳，孔繁德，彭小莉，等. 纳米PCR技术检测副溶血弧菌的建立与初步应用[J]. 福建畜牧兽医，2012，34（1）：9-12.
[11] 林强，李宁求，付小哲，等. 牡蛎中副溶血弧茵荧光定量PCR检测方法的建立及其应用[J]. 中国水产科学，2011，18（1）：96- 102.
[12] 王淑娜，周向阳，胡兴娟，等. 基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌[J]. 中国人兽共患病学报，2010，26 (5)：455-458.
[13] 彭宣宪，周樱，王三英，等. 采用 UPPCR-SSCP技术快速鉴定水产养殖病原性弧菌的研究[J]. 台湾海峡，2000，19（4）：260-464.
[14] 廖亮，刘宏生. 海产品中副溶血弧菌变性高效液相色谱检测技术研究[J]. 中国卫生工程学，2010，9（3）：220-222.
[15] Masuda N，Yasukaw a K，Isawa Y，et al. Rapid Detection of tdh and trh mRNAs of Vibrio parahaemolyticus by the Transcription-Reverse Transcription Concerted(TRC) Method[J]. Journal of Bioscience and Bioengneer- ing，2004(98): 236-243.
[16] Michel TK．Urease-positive-Kanagawa negative vibio parahaemolyticus from patients and environment in the pacific northwest[J]. J Clin Microbiol，1989(27)：2820- 2822.
[17] 杜玉萍，陈清，王雅贤，等. 胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究[J]. 热带医学杂志，2006，6（6）：650- 652.
[18] 罗立新，缪珑，潘力，等. 快速检测单增李斯特菌免疫胶体金层析法的研究[J]. 中国卫生检疫杂志，2006，16（2）：154-156.
[19] 朱立平，陈学清. 免疫学常用实验方法[M]. 北京：人民军医出版社，2000.
[20] 张龙翔，张庭芳，李令媛. 生化实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社，1997.
[21] 周顺伍．动物生物化学实验指导[M]．北京：中国农业出版社，2006.
[22] 王兰兰. 临床免疫学与免疫学检疫[M]. 北京: 人民卫生出版社，2007.
[23] 林清华. 免疫学实验[M]. 武汉：武汉大学出版社，1999.
[24] 李成文. 现代免疫化学技术[M]. 上海：上海科学技术出版社，1992.
[25] Faulk W，Taylorn G M. An irmnunocolloidal gold method for the electron microscope [J]. Immunochem，1971(8)：1081- 1087.