探讨微小RNA-34a对沉默信息调节因子1(SIRT1)的调节作用及SIRT1对严重烧伤大鼠早期心肌损伤的影响。
方法(1)将24只SD大鼠按照随机数字表法(分组方法下同)分为假伤组、单纯烧伤组和SIRT1激动剂组，每组8只。单纯烧伤组、SIRT1激动剂组大鼠背部造成30%体表总面积Ⅲ度烫伤(以下称烧伤)，假伤组大鼠背部致假伤。伤后即刻，假伤组、单纯烧伤组大鼠腹腔注射生理盐水50 mL/kg，SIRT1激动剂组大鼠腹腔注射生理盐水50 mL/kg+1 mg/mL白藜芦醇(50 mg/kg)。伤后6 h，抽取腹主动脉血制备血清，取心肌组织。(2)取12只SD大鼠乳鼠心肌细胞，分为微小RNA-34a模拟物对照组、微小RNA-34a模拟物组、微小RNA-34a抑制物对照组及微小RNA-34a抑制物组，分别用微小RNA-34a的模拟物对照、模拟物、抑制物对照、抑制物序列进行转染。实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌细胞微小RNA-34a表达，蛋白质印迹法检测心肌细胞SIRT1的蛋白表达。另取心肌细胞，分为微小RNA-34a抑制物对照+烧伤血清组、微小RNA-34a抑制物+烧伤血清组及微小RNA-34a抑制物+烧伤血清+EX527组。微小RNA-34a抑制物对照+烧伤血清组心肌细胞转染微小RNA-34a抑制物的对照序列，后2组心肌细胞转染微小RNA-34a抑制物序列。转染48 h，微小RNA-34a抑制物+烧伤血清+EX527组心肌细胞用含体积分数10%的单纯烧伤组大鼠血清+终物质的量浓度为1 mol/L EX527的DMEM培养液培养6 h，其余2组心肌细胞用含体积分数10%的单纯烧伤组大鼠血清的DMEM培养液培养。蛋白质印迹法检测心肌细胞SIRT1及剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、Bax的蛋白表达。(3)取来自(1)的心肌组织，实时荧光定量RT-PCR法检测假伤组和单纯烧伤组大鼠心肌组织中微小RNA-34a及SIRT1的mRNA表达；生物图像导航仪下观察假伤组、单纯烧伤组和SIRT1激动剂组大鼠心肌组织形态；实时荧光定量RT-PCR法检测假伤组、单纯烧伤组和SIRT1激动剂组大鼠心肌组织中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达；蛋白质印迹法检测假伤组、单纯烧伤组和SIRT1激动剂组大鼠心肌组织剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和Bax的蛋白表达。对数据行单因素方差分析及LSD检验。
结果(1)转染48 h后，微小RNA-34a模拟物组心肌细胞微小RNA-34a的表达量为4.67±0.92，显著高于微小RNA-34a模拟物对照组的1.03±0.04(P<0.01)；微小RNA-34a模拟物组心肌细胞SIRT1的蛋白表达量为0.35±0.06，显著低于微小RNA-34a模拟物对照组的1.12±0.11(P<0.01)。转染48 h后，微小RNA-34a抑制物组心肌细胞微小RNA-34a表达量为0.26±0.07，低于微小RNA-34a抑制物对照组的1.33±0.07(P<0.01)；微小RNA-34a抑制物对照组心肌细胞SIRT1的蛋白表达量为1.12±0.16，显著低于微小RNA-34a抑制物组的1.74±0.34(P<0.01)。培养6 h后，与微小RNA-34a抑制物对照+烧伤血清组比较，微小RNA-34a抑制物+烧伤血清组心肌细胞SIRT1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与微小RNA-34a抑制物+烧伤血清组比较，微小RNA-34a抑制物+烧伤血清+EX527组心肌细胞SIRT1的蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。(2)伤后6 h，与假伤组比较，单纯烧伤组大鼠心肌组织微小RNA-34a表达显著升高(P<0.01)；SIRT1的mRNA表达量明显降低(P<0.01)。伤后6 h，假伤组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核形态正常，未见炎性细胞浸润；单纯烧伤组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞核消失或形态异常，炎性细胞浸润明显；SIRT1激动剂组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核形态正常，少量炎性细胞浸润。伤后6 h，与单纯烧伤组比较，假伤组、SIRT1激动剂组大鼠心肌组织IL-1β、TNF-α的mRNA表达量及剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3和Bax蛋白水平显著降低(P<0.01)。
结论严重烧伤大鼠早期心肌组织微小RNA-34a表达升高，导致SIRT1表达降低，IL-1β、TNF-α及剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、Bax表达升高，心肌损伤明显。SIRT1活化后，可通过降低IL-1β、TNF-α及剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、Bax的表达，减轻大鼠严重烧伤早期诱发的心肌损伤。