【摘 要】
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目的构建GFP-LC3真核表达载体,验证其在胶质瘤U87细胞系中对细胞自噬现象的指示作用,并获得稳定转染该载体的U87细胞。方法以人外周血cDNA为模板扩增全长LC3基因,通过分子生
【机 构】
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首都医科大学附属北京天坛医院临床医学研究实验室,
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目的构建GFP-LC3真核表达载体,验证其在胶质瘤U87细胞系中对细胞自噬现象的指示作用,并获得稳定转染该载体的U87细胞。方法以人外周血cDNA为模板扩增全长LC3基因,通过分子生物学操作将其导入pcDNA3-GFP中,得到重组质粒pcDNA3-GFP-LC3。将重组及对照质粒转染胶质瘤U87细胞系,雷帕霉素(Rapamycin)处理48 h后用Western blot方法检测细胞中自噬相关蛋白表达变化,荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达及Rapamycin处理后细胞的自噬情况。并利用G418筛选,获得稳定表达GFP-LC3的U87细胞系。结果成功构建pcDNA3-GFP-LC3真核表达载体,该载体能在胶质瘤U87细胞系中表达,荧光显微镜下可见绿色荧光。自噬诱导剂Rapamycin处理后,该载体可以很好地指示细胞中自噬泡的形成过程。成功获得稳定转染GFP-LC3载体的U87细胞系。结论 pcDNA3-GFP-LC3真核表达载体及稳定转染胶质瘤U87细胞系为研究胶质瘤细胞的自噬及抗肿瘤药物对胶质瘤细胞自噬的影响提供了简洁而有效的工具。
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