论文部分内容阅读
摘要：文章通过设计四因素三水平正交实验，探索超临界CO2流体萃取法提取延胡索乙素的最优工艺条件。利用SFE-CO2法提取延胡索中的延胡索乙素；利用HPLC法测定萃取物中延胡索乙素的含量。经实验探究，确定的最佳工艺条件为：延胡索粒度为30目，萃取压力20Mpa，萃取温度45℃，改性剂为饱和Ca（OH）2溶液，夹带剂为药材1.5倍量的95%乙醇。该工艺稳定可行，可用于延胡索乙素的提取。
关键词：延胡索；延胡索乙素；超临界C02流体萃取法；高效液相色谱法
延胡索（Corydalis yanhusuo），又名元胡、玄胡、元胡索等，为大宗常用中药，属“浙八味”之一。块茎为著名常用中药，具有活血散瘀、行气止痛的功效。其内含有延胡索甲素、延胡索乙素等20多种生物碱[1]。延胡索乙素又名盐酸四氢巴马丁，四氢掌叶防己碱。熔点在147～149℃，遇光受热颜色渐变深。中国药典（2015年版一部）以延胡索乙素为指标，对延胡索药材规定了TLC定性鉴别和HPLC含量测定方法，己成为延胡索及其制剂进行质量评价的重要依据[2]。
超临界CO2流体萃取法是国际上较先进的物理萃取技术，陈峰[3]、包玮鸳[4]等分别从萃取压力、萃取温度等因素设计正交实验，探索SFE-CO2法提取延胡索乙素的最优工艺条件。此外，在延胡索乙素提取过程中，SFE-CO2法与醇回流提取法等传统的提取方法相比较，工艺稳定可行，优于其他传统提取方法[5]。本研究在前人工作的基础上，进一步探究超临界CO2流体萃取过程中各项参数对延胡索乙素萃取率的影响，进而探究其更为完善的最佳工艺条件。
1 实验部分
1.1仪器与药剂
HA120-50-01超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司），LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津集团），DZF-6050MBE型电热恒温真空干燥箱（上海博讯实业有限公司），SB-5200DTN型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），RVIO基本型立式旋转蒸发仪（IKA旋转蒸发仪公司），CP225D型分析天平（德国Sartorius公司）。
延胡索药材（浙江东阳），延胡索乙素对照品（批号：110726-210213，中国食品药品检定研究院），延胡索对照药材（批号：120928-201208，中国食品药品检定研究院），工业二氧化碳（万州区三牧气体有限公司），其余试剂均为分析纯。
1.2实验方法
1.2.1延胡索乙素的SFE-CO2法提取
选取延胡索块茎若干，清洗，40℃条件下烘干，粉碎，制备大、中、小3个梯度延胡索粉末若干以备用。
精密称取相应粒度的延胡索粉末200g，与适量的碱性饱和Ca（OH）2溶液混合拌匀，于25℃恒温条件下密闭保存24 h。装入1L的萃取釜中，启动超临界萃取装置，萃取釜压力、温度按正交表L9（34）设计的实验参数进行设定。当分离釜I压力达到6Mpa、温度达到40℃，分离釜Ⅱ压力达到4Mpa、温度达到30℃，CO2流量基本稳定在20～40 kg/h后，从夹带剂泵处注入95%的乙醇，夹带剂用量依据正交表L9（34）设计的实验参数进行选择。稳定萃取2.5 h后，依次关闭装置阀门，停止萃取。期间间隔一段时间用洁净大烧杯于分离釜I和分离釜Ⅱ处收集萃取物。
1.2.2延胡索乙素的HPLC法测定
用旋转蒸发仪将所收集的萃取液浓缩蒸干，待蒸干瓶温度降低至接近室温后，加入80%的甲醇溶液溶解，利用超声波震荡至壁上无残留后，定容至50 mL容量瓶中，静置，取上层澄清液进行液相色谱测定。
色谱条件：色谱柱为Durashell C18色谱柱（250 mmx4.6 mm，5μm）；流动相A相为乙腈―水（92：8），B相为0.2%冰醋酸溶液（用三乙胺调节pH至5.05），进行梯度洗脱（0～15 min，20% A→20% A；15～35 min，20% A→80% A）：检测波长为280nm；柱温为35℃；体积流速为1.0 mL/min；进样量为20μL[6]。按照上述色谱条件进行分析，各成分分离度良好，对照品和样品HPLC图如图l所示。
2 结果与分析
2.1单因素预实验
通过单因素预实验，探索在超临界CO2流体萃取过程中，药材粒度、碱化剂、萃取压力、萃取温度4个关键因素对延胡索乙素提取率的影响，为后续正交实验的设计提供一个合理的数值范围。
2.1.1药材粒度对延胡索乙素提取率的影响
精密称取30、50、70、90目延胡索粉末各200g，用饱和Ca（OH）2溶液密闭浸泡24 h，装入1L的萃取釜中，设置萃取釜压力为15 Mpa，温度为40℃，其余步骤同“1.2实验方法”所述。本次单因素实验以所测得延胡索乙素含量（mg/g）為指标，旨在考察延胡索药材的不同粒度对提取效果的影响。从实验结果得出当延胡索目数为30目时，延胡索乙素提取率较高。
2.1.2有无碱化试剂对延胡索乙素提取率的影响
本实验在改性剂的选择中，从基于环境友好型溶剂考虑，放弃选用如三乙胺、氨水-乙醇溶液等与生物碱相容性较高但对环境有污染的化学试剂作为改性剂，选用饱和Ca（OH）2溶液作碱化试剂。其优势有两点：其一，Ca（OH）2属于无机碱性溶液，除对延胡索乙素这种生物碱具有碱化效果外，对不锈钢萃取釜的腐蚀性也相对其他有机溶剂较小；其二，Ca（OH）2溶液还可去除粘液性物质，对减少萃取液色谱图中的杂质峰数量有一定作用。
称取6份30目延胡索粉末各200g，分为甲、乙两组，甲组使用饱和Ca（OH）2溶液浸泡24h进行预处理，乙组不做任何碱化处理。分别按照2.1.1中提及的相关参数及方法条件提取3次，合并3次提取液，蒸干浓缩，HPLC测定，计算萃取率。由实验结果显示，使用饱和Ca（OH）2溶液浸泡的延胡索样品萃取率为0.81mg/g，未做任何碱化处理的取率为0.72mg/g，对比可知，样品碱化后萃取的效果优于未做碱化处理的。 2.1.3萃取压力对延胡索乙素提取率的影响
称取12份延胡索粉末（30目）各200g，分别在萃取釜设定压力为10Mpa、25Mpa、40Mpa、55Mpa的条件下提取3次，其余条件均依照2.1.1中提及的相关参数及方法进行。合并3次提取液，蒸干浓缩，HPLC测定，计算萃取率。从实验结果得出，25 Mpa条件下提取效果较好。
2.1.4萃取温度对延胡索乙素提取率的影响
称取12份30目延胡索粉末各200 g，分别在萃取釜设定温度为25℃、45℃、65℃的条件下提取3次，其余条件均依照2.1.1中提及的相关参数及方法进行。合并3次提取液，蒸干浓缩，HPLC测定，计算萃取率。从实验结果得出，35℃条件下提取效果較好。
2.1.5萃取过程中夹带剂的选择
本实验在夹带剂的选择中，基于延胡索乙素的理化性质及无毒环保性考虑，选取乙醇作为萃取夹带剂。
2.2正交实验
2.2.1正交因素水平确定
依据超临界制CO2流体萃取工艺特点，以及上述单因素预实验的基础上，选取萃取压力（A）、药材粒度（B）、萃取温度（C）、夹带剂用量（D）4个因素，每个因素各取3个水平进行正交实验，以所得萃取物中延胡索乙素的含量作为考察指标。具体因素水平如表1所示。
2.22实验结果及数据处理
按照上述L。（34）正交实验因素水平表，共进行了9组实验，每组设3个平行。正交实验有关数据及其计算结果如表2所示。
2.2.3方差分析
用SPSS软件（22.0）对测定结果进行方差分析，以延胡索乙素含量为考察指标，方差分析结果如表3所示。
从上述正交实验的结果中可以得出，最佳萃取条件为AIB2C3D2；因素的主次顺序为：B>D>A>C，故B2D2AIC3为超临界CO2流体萃取的最佳实验条件，即：延胡索粒度为30目；夹带剂为药材质量的1.5倍量；萃取压力为20 MPa；萃取温度为45℃。
2.3验证实验
称取30目a、b、c3份延胡索粉末各200g，按上述最佳工艺条件进行萃取，测定，计算，结果显示，a、b、c3组萃取率分别为1.08、1.16、1.23 mg/g，由此可知，延胡索乙素的提取率在3次重复实验中均处于较高水平，说明该工艺稳定可行。
3 结语
本研究在前人研究工作的基础上，另辟蹊径，在萃取温度、萃取压力、药材粒度与改性剂用量之间构建新的排列组合关系，在结合单因素实验的基础上，通过正交实验探寻上述4个要素条件下的最优工艺条件。
经过实验探究发现，用SFE-CO2法提取延胡索乙素，相较于索氏提取法、醇回流提取法、以及超声波一甲醇回流提取法（药典法）等传统提取工艺，具有操作温度低、耗能低、时间短、有效成分含量高、无有机残留等优点。该工艺方法稳定可行，可扩展到“中试”生产当中，并可作为中药材重要有效成分提取的一种高效的方法。
采用本研究中正交实验所探究的最优工艺条件进行验证性实验，测得每克延胡索药粉含有延胡索乙素达1.23 mg，明显优于传统的提取工艺，也优于同类型SFE-CO，法的提取效果[7]。在A383C2D1组实验中，萃取效率陡然降低，究其原因，可能是由于在使用高目数，高压力的条件下，因药材研磨程度较细，与夹带剂乙醇溶液混合后，加之在最大设定压力的冲击下，萃取物质以稠状形式存在，堵塞了萃取釜的联通孔隙，以至C02流通不畅，造成最终萃取效率较低。
[参考文献]
[1]张晓丽，王喆星，吴利军.延胡索化学成分研究[D].沈阳：沈阳医科大学，2008.
[2]国家药典委员会编中华人民共和国药典（2015年版一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[3]陈 峰，郭立玮，井山林，等.超临界C02流体萃取延胡索中延胡索乙素的正交实验研究[J].中药新药与临床药理，2005，16（2）：137-138.
[4]包玮鸳，吴立成，何忠平，等超临界C02流体萃取法提取延胡索乙素[J].中药材，2004，27 （7）：501-503
[5]王玳珠，井山林，陈峰，等.SFE等方法提取延胡索中延胡索乙素的研究[J].南京中医药大学学报，2003，19 （6）：356.
[6]祁俊生，张静，周 浓，等HPLC同时测定不同产地延胡索中6种.生物碱的含量[J].华西药学杂志，2016，31（4）：415-419.
[7]原永芳，李修禄，柳正良，等超临界流体萃取法及高效液相色谱法分析延胡索中延胡索乙素的含量[J].药学学报，1995，31（4）：282-286.
关键词：延胡索；延胡索乙素；超临界C02流体萃取法；高效液相色谱法
延胡索（Corydalis yanhusuo），又名元胡、玄胡、元胡索等，为大宗常用中药，属“浙八味”之一。块茎为著名常用中药，具有活血散瘀、行气止痛的功效。其内含有延胡索甲素、延胡索乙素等20多种生物碱[1]。延胡索乙素又名盐酸四氢巴马丁，四氢掌叶防己碱。熔点在147～149℃，遇光受热颜色渐变深。中国药典（2015年版一部）以延胡索乙素为指标，对延胡索药材规定了TLC定性鉴别和HPLC含量测定方法，己成为延胡索及其制剂进行质量评价的重要依据[2]。
超临界CO2流体萃取法是国际上较先进的物理萃取技术，陈峰[3]、包玮鸳[4]等分别从萃取压力、萃取温度等因素设计正交实验，探索SFE-CO2法提取延胡索乙素的最优工艺条件。此外，在延胡索乙素提取过程中，SFE-CO2法与醇回流提取法等传统的提取方法相比较，工艺稳定可行，优于其他传统提取方法[5]。本研究在前人工作的基础上，进一步探究超临界CO2流体萃取过程中各项参数对延胡索乙素萃取率的影响，进而探究其更为完善的最佳工艺条件。
1 实验部分
1.1仪器与药剂
HA120-50-01超临界萃取装置（江苏南通华安超临界萃取有限公司），LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津集团），DZF-6050MBE型电热恒温真空干燥箱（上海博讯实业有限公司），SB-5200DTN型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），RVIO基本型立式旋转蒸发仪（IKA旋转蒸发仪公司），CP225D型分析天平（德国Sartorius公司）。
延胡索药材（浙江东阳），延胡索乙素对照品（批号：110726-210213，中国食品药品检定研究院），延胡索对照药材（批号：120928-201208，中国食品药品检定研究院），工业二氧化碳（万州区三牧气体有限公司），其余试剂均为分析纯。
1.2实验方法
1.2.1延胡索乙素的SFE-CO2法提取
选取延胡索块茎若干，清洗，40℃条件下烘干，粉碎，制备大、中、小3个梯度延胡索粉末若干以备用。
精密称取相应粒度的延胡索粉末200g，与适量的碱性饱和Ca（OH）2溶液混合拌匀，于25℃恒温条件下密闭保存24 h。装入1L的萃取釜中，启动超临界萃取装置，萃取釜压力、温度按正交表L9（34）设计的实验参数进行设定。当分离釜I压力达到6Mpa、温度达到40℃，分离釜Ⅱ压力达到4Mpa、温度达到30℃，CO2流量基本稳定在20～40 kg/h后，从夹带剂泵处注入95%的乙醇，夹带剂用量依据正交表L9（34）设计的实验参数进行选择。稳定萃取2.5 h后，依次关闭装置阀门，停止萃取。期间间隔一段时间用洁净大烧杯于分离釜I和分离釜Ⅱ处收集萃取物。
1.2.2延胡索乙素的HPLC法测定
用旋转蒸发仪将所收集的萃取液浓缩蒸干，待蒸干瓶温度降低至接近室温后，加入80%的甲醇溶液溶解，利用超声波震荡至壁上无残留后，定容至50 mL容量瓶中，静置，取上层澄清液进行液相色谱测定。
色谱条件：色谱柱为Durashell C18色谱柱（250 mmx4.6 mm，5μm）；流动相A相为乙腈―水（92：8），B相为0.2%冰醋酸溶液（用三乙胺调节pH至5.05），进行梯度洗脱（0～15 min，20% A→20% A；15～35 min，20% A→80% A）：检测波长为280nm；柱温为35℃；体积流速为1.0 mL/min；进样量为20μL[6]。按照上述色谱条件进行分析，各成分分离度良好，对照品和样品HPLC图如图l所示。
2 结果与分析
2.1单因素预实验
通过单因素预实验，探索在超临界CO2流体萃取过程中，药材粒度、碱化剂、萃取压力、萃取温度4个关键因素对延胡索乙素提取率的影响，为后续正交实验的设计提供一个合理的数值范围。
2.1.1药材粒度对延胡索乙素提取率的影响
精密称取30、50、70、90目延胡索粉末各200g，用饱和Ca（OH）2溶液密闭浸泡24 h，装入1L的萃取釜中，设置萃取釜压力为15 Mpa，温度为40℃，其余步骤同“1.2实验方法”所述。本次单因素实验以所测得延胡索乙素含量（mg/g）為指标，旨在考察延胡索药材的不同粒度对提取效果的影响。从实验结果得出当延胡索目数为30目时，延胡索乙素提取率较高。
2.1.2有无碱化试剂对延胡索乙素提取率的影响
本实验在改性剂的选择中，从基于环境友好型溶剂考虑，放弃选用如三乙胺、氨水-乙醇溶液等与生物碱相容性较高但对环境有污染的化学试剂作为改性剂，选用饱和Ca（OH）2溶液作碱化试剂。其优势有两点：其一，Ca（OH）2属于无机碱性溶液，除对延胡索乙素这种生物碱具有碱化效果外，对不锈钢萃取釜的腐蚀性也相对其他有机溶剂较小；其二，Ca（OH）2溶液还可去除粘液性物质，对减少萃取液色谱图中的杂质峰数量有一定作用。
称取6份30目延胡索粉末各200g，分为甲、乙两组，甲组使用饱和Ca（OH）2溶液浸泡24h进行预处理，乙组不做任何碱化处理。分别按照2.1.1中提及的相关参数及方法条件提取3次，合并3次提取液，蒸干浓缩，HPLC测定，计算萃取率。由实验结果显示，使用饱和Ca（OH）2溶液浸泡的延胡索样品萃取率为0.81mg/g，未做任何碱化处理的取率为0.72mg/g，对比可知，样品碱化后萃取的效果优于未做碱化处理的。 2.1.3萃取压力对延胡索乙素提取率的影响
称取12份延胡索粉末（30目）各200g，分别在萃取釜设定压力为10Mpa、25Mpa、40Mpa、55Mpa的条件下提取3次，其余条件均依照2.1.1中提及的相关参数及方法进行。合并3次提取液，蒸干浓缩，HPLC测定，计算萃取率。从实验结果得出，25 Mpa条件下提取效果较好。
2.1.4萃取温度对延胡索乙素提取率的影响
称取12份30目延胡索粉末各200 g，分别在萃取釜设定温度为25℃、45℃、65℃的条件下提取3次，其余条件均依照2.1.1中提及的相关参数及方法进行。合并3次提取液，蒸干浓缩，HPLC测定，计算萃取率。从实验结果得出，35℃条件下提取效果較好。
2.1.5萃取过程中夹带剂的选择
本实验在夹带剂的选择中，基于延胡索乙素的理化性质及无毒环保性考虑，选取乙醇作为萃取夹带剂。
2.2正交实验
2.2.1正交因素水平确定
依据超临界制CO2流体萃取工艺特点，以及上述单因素预实验的基础上，选取萃取压力（A）、药材粒度（B）、萃取温度（C）、夹带剂用量（D）4个因素，每个因素各取3个水平进行正交实验，以所得萃取物中延胡索乙素的含量作为考察指标。具体因素水平如表1所示。
2.22实验结果及数据处理
按照上述L。（34）正交实验因素水平表，共进行了9组实验，每组设3个平行。正交实验有关数据及其计算结果如表2所示。
2.2.3方差分析
用SPSS软件（22.0）对测定结果进行方差分析，以延胡索乙素含量为考察指标，方差分析结果如表3所示。
从上述正交实验的结果中可以得出，最佳萃取条件为AIB2C3D2；因素的主次顺序为：B>D>A>C，故B2D2AIC3为超临界CO2流体萃取的最佳实验条件，即：延胡索粒度为30目；夹带剂为药材质量的1.5倍量；萃取压力为20 MPa；萃取温度为45℃。
2.3验证实验
称取30目a、b、c3份延胡索粉末各200g，按上述最佳工艺条件进行萃取，测定，计算，结果显示，a、b、c3组萃取率分别为1.08、1.16、1.23 mg/g，由此可知，延胡索乙素的提取率在3次重复实验中均处于较高水平，说明该工艺稳定可行。
3 结语
本研究在前人研究工作的基础上，另辟蹊径，在萃取温度、萃取压力、药材粒度与改性剂用量之间构建新的排列组合关系，在结合单因素实验的基础上，通过正交实验探寻上述4个要素条件下的最优工艺条件。
经过实验探究发现，用SFE-CO2法提取延胡索乙素，相较于索氏提取法、醇回流提取法、以及超声波一甲醇回流提取法（药典法）等传统提取工艺，具有操作温度低、耗能低、时间短、有效成分含量高、无有机残留等优点。该工艺方法稳定可行，可扩展到“中试”生产当中，并可作为中药材重要有效成分提取的一种高效的方法。
采用本研究中正交实验所探究的最优工艺条件进行验证性实验，测得每克延胡索药粉含有延胡索乙素达1.23 mg，明显优于传统的提取工艺，也优于同类型SFE-CO，法的提取效果[7]。在A383C2D1组实验中，萃取效率陡然降低，究其原因，可能是由于在使用高目数，高压力的条件下，因药材研磨程度较细，与夹带剂乙醇溶液混合后，加之在最大设定压力的冲击下，萃取物质以稠状形式存在，堵塞了萃取釜的联通孔隙，以至C02流通不畅，造成最终萃取效率较低。
[参考文献]
[1]张晓丽，王喆星，吴利军.延胡索化学成分研究[D].沈阳：沈阳医科大学，2008.
[2]国家药典委员会编中华人民共和国药典（2015年版一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.
[3]陈 峰，郭立玮，井山林，等.超临界C02流体萃取延胡索中延胡索乙素的正交实验研究[J].中药新药与临床药理，2005，16（2）：137-138.
[4]包玮鸳，吴立成，何忠平，等超临界C02流体萃取法提取延胡索乙素[J].中药材，2004，27 （7）：501-503
[5]王玳珠，井山林，陈峰，等.SFE等方法提取延胡索中延胡索乙素的研究[J].南京中医药大学学报，2003，19 （6）：356.
[6]祁俊生，张静，周 浓，等HPLC同时测定不同产地延胡索中6种.生物碱的含量[J].华西药学杂志，2016，31（4）：415-419.
[7]原永芳，李修禄，柳正良，等超临界流体萃取法及高效液相色谱法分析延胡索中延胡索乙素的含量[J].药学学报，1995，31（4）：282-286.