背景:脑源性神经营养因子对多种神经元的发育、存活及轴突再生中起着重要作用,但由于血脑屏障的存在,限制了其应用。目的:构建大鼠脑源性神经营养因子基因重组真核表达载体,观察其在真核细胞内的表达。设计、时间及地点:单一样本实验,于2005-09/2006-09在昆明医学院神经科学研究所完成。材料:清洁级健康雄性8周龄SD大鼠,体质量250g。方法:①以反转录-聚合酶链反应从大鼠脑组织总RNA扩增脑源性神经营养因子基因编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组表达载体pcDNA3/BDNF。②将L939细胞分为pcDNA3/BDNF转染组、pcDNA3转染组和未转染组,以FuGene HD转染试剂介导相应质粒转染。主要观察指标:①重组质粒pcDNA3/BDNF的酶切鉴定与序列分析。②免疫细胞化学和western blot鉴定脑源性神经营养因子在L929细胞中的表达。结果:①重组质粒pcDNA3/BDNF经酶切产生783bp和5.2kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因编码序列完全一致。②基因转染后,免疫细胞化学、western blot结果表明脑源性神经营养因子能在真核细胞中正确表达。结论:成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/BDNF,为后续研究奠定了基础。