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摘 要：以牦牛背最长肌为原料，采用静态腌制法，研究不同腌制时间牛干巴内外部的水分、盐度、色泽、蛋白质含量变化特征，以及脂肪和蛋白氧化的变化。结果表明：随着腌制时间的延长，牛干巴内部和外部的水分含量逐步下降，而盐度先增加后下降；内部和外部的L*变化不显著（P>0.05），但a*、b*在静态腌制的前3d降低，至第20天时升至最高值后缓慢下降，内部和外部差异显著（P<0.05）；随着水分的蒸发，蛋白质含量逐渐增加，且内部和外部无显著差异（P>0.05）；静态腌制过程中，牛干巴发生蛋白质和脂肪氧化，且蛋白质氧化和脂肪氧化之间存在相互作用，脂肪氧化程度先增后降，蛋白质氧化水平升至0.55nmol/mg后逐步下降。总之，牛干巴静态腌制过程中，肌肉成分发生均衡变化，30d的腌制有利于控制氧化程度。
关键词：牛干巴；静态腌制；理化特性
中图分类号：TS251.52 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）08-0001-04
牛干巴起源于云南省寻甸县，是云、贵、川、青海和重庆等地的风味特产，至今己有700余年历史。传统牛干巴的生产，以牛胴体肌肉饱满、脂肪含量少的部位为原料，于寒露至立春采用食盐腌制2～3周，之后干燥1周加工而成，属于低温发酵牛肉制品[1]。目前，牛干巴生产主要遵循传统经验，而腌制过程中的原辅料作用机制研究较少，从而难以实现食盐腌制定量化、标准化和安全化，无法生产出质量稳定并安全的产品。国内学者对牛干巴的生产工艺、安全性、保藏技术等方面进行了初步研究[2-4]，但对牛干巴制作过程中理化特性变化未见研究，从而导致牛干巴的标准化腌制缺少数据基础和理论指导。基于此，本实验对低温变湿静态腌制过程中牛干巴理化成分的变化特征进行深入研究，为创新牛干巴产业化快速腌制技术提供数据支持，为改进云南、四川、青海等地区特色腌腊牛肉制品加工工艺提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
3岁牦牛的背最长肌（M. longissimus dorsi），采集于青海省河南蒙古族自治县。
无碘盐 中国盐业总公司；三氯乙酸、TBA、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、石英砂、焦磷酸钠、氯化钾、氯化镁、DNPH、乙酸乙酯、盐酸胍、磷酸二氢钾，均为分析纯 国药化学试剂有限公司；EGTA（分析纯） 美国Sigma公司；盐酸、乙醇（分析纯） 北京化工厂。
1.2 仪器与设备
ML204/02电子天平 上海梅特勒-托利多有限公司；PAL-FM1盐度计 日本Atago公司；CR400色差计 Konica Minolta公司；Neofuge 15R型台式高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司；DH-101-3BS型电热恒温鼓风干燥箱 天津市中环实验电炉有限公司；T6系列紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HWS-150型恒温恒湿箱 上海印溪仪器仪表责任有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程及操作
牦牛背最长肌→剔除表面脂肪和筋膜→称质量→静态腌制（5%食盐）→于恒湿恒温箱中静置→取样进行指标测定
选取大小相似、质量相近的3块牦牛背最长肌解冻，剔除表面的筋膜和可见脂肪，称质量，按质量比5%添加食盐，在肉块表面涂抹均匀，适当按摩，促进盐分的吸收。将肉块置于托盘中，放入4℃、湿度90%恒温恒湿箱中静置20d，之后将温度、湿度调为20℃、65%，分别在0、3、20、30d取样，用于各项指标的测定。
1.3.2 水分测定
参考GB/T 9695.15—2008《肉与肉制品：水分含量测定》。将牛干巴纵向剖开，以切面的几何中心为圆心，2cm之内的为内部，表皮向内2cm的为外部，各取3次样品，每次取3块牛干巴。
分别于肉块外部和中心切取肉样，在玻璃板上进行四分法处理，用万分之一天平称质量5g肉样m。根据肉样与石英砂5：8的比例，称取适量的石英砂（大约5g肉样，8g石英砂），放入干净烧杯中，接着选取适合的玻璃棒均匀搅拌，并用万分之一天平称得样品，石英砂、玻璃棒和玻璃杯的总质量记为m1。将玻璃杯中的所有物品放入鼓风干燥箱中，干燥2h，冷却干燥后称质量，重复干燥至恒质量，得到质量m2。
1.3.3 盐浓度的测定
使用盐度计直接测定，选取肉块外部和内部中心区域进行测定，取平均值。
1.3.4 色差测定
使用色差计直接测定，分别在肉块外部和内部中心区域选取4个点进行测定，各取平均值，颜色以L*、a*、b*值表示。
1.3.5 脂肪氧化测定（TBARS）
参考Marcos等[5]的酸水解法。2.5g样品加20mL超纯水，用IKA均浆器在室温条件下以转速13500r/min均质3min。取冷的25%TCA溶液5mL加入均质液中，在10000×g、4℃条件下离心15min，取上清液3.5mL，加入1.5mL 0.6%的TBA溶液，（70±2）℃条件下水浴30min，冷却后在532nm波长处测定吸光度。2.5mL超纯水+1mL 25% TCA溶液+1.5mL 0.6% TBA溶液做空白。采用TEP作为标准液。
式中：A为吸光度；b为标准曲线中的截距；k为斜率；m为干物质的质量。
1.3.6 蛋白质含量测定
根据GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》。
1.3.7 蛋白质氧化测定
参考Lund等[6]的方法，取1g样品加入10mL的焦磷酸缓冲液（2.0mmol/L Na4P2O7、10mmol/L Trizma-maleate、100mmol/L KCl、2.0mmol/L MgCl2、2.0mmol/L EGTA，pH7.4），13500r/min均质2min。用Lowry法测定溶液的蛋白质浓度C，取两等分（1mL）均质液，加入2mL 20%的TCA，12000×g离心5min后弃上清液，一份加入2mL 10mmol/L 2，4-二硝基苯肼（DNPH），另一份加入2mL 2mmol/L HCl做空白，在室温条件下培育30min，每间隔3min振荡10s。之后用2mL 20% TCA沉淀蛋白质，12000×g离心5min后用5mL含10mmol/L HCl溶液的乙醇-乙酸乙酯（1：1，V/V）溶液洗涤DNPH 3次，每次12000×g离心5min。沉淀物中加入2mL磷酸二氢钾溶液（含6.0mmol/L盐酸胍，pH2.3），4℃条件下放置过夜后于370nm波长处测定吸光度，用样品的吸光度A1减去相应空白的吸光度A0。 2 结果与分析
2.1 静态腌制过程中水分、盐度、色泽的变化
水分进入肌肉内部是一个以时间为参数的动力学过程，必须克服各种物理屏障和束缚才能扩散进入肌肉纤维和肌原纤维网络结构中，这里的物理障碍和束缚主要是肌肉肌纤维膜以及肌球蛋白的交叉连接等[7]。在腌制过程中，内外部水分逐步下降。腌制前20d内的牛干巴内、外部水分并无差异；至第30天时内、外部差异显著（P<0.05），且外部水分含量总低于内部水分含量。这是由于牛干巴表皮逐渐干硬，抑制了内部水分蒸发，因而外部水分较内侧含量低，且深层肌肉水分蒸发速率也逐步降低；牛干巴表皮没有脂肪覆盖，直接暴露于空气中，因此外部较内部的水分含量降低速率快。
盐度是指产品中食盐的质量分数，是水和食盐组成的溶液体系的质量分数，它决定着组织渗透压的大小、食盐的保藏作用和扩散渗透过程的时间。在静态腌制过程中，腌制品内部的可溶性成分、食盐和水发生再分配[8]。由于这种再分配的结果，根据组织成分、食盐质量分数、盐渍持续的时间，使产品脱水或者是充水[9]。当以干腌法腌制时，肉表面高质量分数的食盐分子逐步向产品中心渗透，形成了扩散作用，使盐分子渗入肌肉内部。如表1所示，随着静态腌制时间的推移，牛干巴外部的盐度逐渐降低，这是盐自外向内逐步渗透的结果；内部的盐度则先增后降，在腌制第20天达到最高，之后盐度下降则是食盐在肌肉各部中逐渐渗透，内部盐度达到平衡所致。
如同干腌火腿的加工过程中肌肉的颜色的变化规律[10]，在整个静态腌制过程中，牛干巴的L*变化不显著（P>0.05）。腌制初期，牛干巴a*、b*都降低，在第20天最高，之后缓慢降低，这与盐分的渗透有极大关联。随着盐分由外向内逐步渗入，牛干巴肉色逐渐加深；在腌制后期随着水分蒸发和盐分在肌肉各部分中溶解，a*、b*逐步降低。
2.2 静态腌制过程中脂肪氧化的变化
TBARS值测定原理是根据食品中不饱和脂肪酸氧化分解而产生丙二醛（CHO-CH2-CHO），利用丙二醛含量对脂肪氧化的程度进行评价。由图1可以看出，静态腌制期间，TBARS的值逐步增加，这是由于加工前期，不饱和脂肪酸持续氧化，生成了大量的挥发性成分，导致丙二醛含量增加[11]，但是到了腌制后期，随着温度的升高，丙二醛进一步氧化生成有机醇和羧酸[12]，从而使TBARS值降低。
图 1 不同静态腌制时间牛干巴脂肪氧化程度
Fig.1 Change in TBARS during the static curing process
原料肉表面新鲜，脂肪氧化是自由基产生的结果[13]，食盐具有较弱的氧化催化作用[14]，同时，食盐也通常被认为是脂肪氧化的介质[15]。由图1可以看出，脂肪氧化值与盐度的趋势趋于一致。在静态腌制初期，随着盐分的渗入，脂肪氧化迅速加快。在腌制20d之后，肌肉表面水分蒸发，肉质变硬，隔绝一部分空气，减少内部肌肉与空气接触，因而脂肪氧化速率降低。
2.3 静态腌制过程中蛋白质含量及氧化水平的变化
图 2 不同静态腌制时间牛干巴中蛋白质（A）和羰基（B）含量
Fig.2 Change in protein （A） and carbonyl （B） content during the static curing process
由图2A可知，蛋白质含量在静态腌制过程中逐步增加，但蛋白质氧化水平也随之加剧。在氧化自由基存在的情况下，会发生蛋白质氧化，导致游离氨基酸和肽段更易酶解[16]。从图2B可知，原料肉表面与空气接触，存在一定蛋白质氧化，内部与空气接触机会少，氧化程度低；后期由于水分降低、盐度升高等原因，蛋白质氧化水平逐步攀升，这与众多学者在熟肉加工过程中的研究结果相一致[17-18]。蛋白质氧化并不是单一的过程，有研究表明脂肪氧化和蛋白质氧化存在一定的相关性[19-20]。脂肪氧化的初级产物和次级产物都可以与蛋白质发生反应，从而引起蛋白质的氧化[21]。同时外在的羰基化合物可通过4-OH-壬烯醛反应结合蛋白质[22]，这些脂肪-蛋白质氧化交互反应产生的羰基复合物形成较快，并且相对稳定[20]。
3 结 论
随着温度湿度的增高，牛干巴在静态腌制过程中盐度先增加后降低，最终质量分数在2%左右。水分随着盐分升高而逐步降低，外部的水分蒸发较内部更为剧烈。在腌制过程中，肌内脂肪和蛋白质氧化持续进行，脂肪氧化先增加后降低，而蛋白质氧化水平逐步升高。
参考文献：
[1] 吕彩霞. 牛干巴中发酵剂的筛选及其在发酵香肠中作用机理的研究[D]. 长春： 吉林农业大学， 2008.
[2] 邱燕， 陈韬， 崔薇， 等. 低盐嫩化牛干巴与传统牛干巴的品质比较[J]. 肉类工业， 2011（10）： 31-35.
[3] 肖蓉， 徐昆龙， 施忠芬， 等. 辐照牛干巴在贮藏过程中微生物变化的研究[J]. 食品工业科技， 2009， 30（1）： 286-288.
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[8] 王晶， 杨海燕， 章建浩. 干腌羊火腿工艺过程部分理化性状的动态研究[J]. 新疆农业大学学报， 2008， 31（4）： 87-90.
[9] 王晶. 干腌羊火腿工艺过程蛋白质水解规律及其相关性研究[D]. 乌鲁木齐： 新疆农业大学， 2008.
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关键词：牛干巴；静态腌制；理化特性
中图分类号：TS251.52 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）08-0001-04
牛干巴起源于云南省寻甸县，是云、贵、川、青海和重庆等地的风味特产，至今己有700余年历史。传统牛干巴的生产，以牛胴体肌肉饱满、脂肪含量少的部位为原料，于寒露至立春采用食盐腌制2～3周，之后干燥1周加工而成，属于低温发酵牛肉制品[1]。目前，牛干巴生产主要遵循传统经验，而腌制过程中的原辅料作用机制研究较少，从而难以实现食盐腌制定量化、标准化和安全化，无法生产出质量稳定并安全的产品。国内学者对牛干巴的生产工艺、安全性、保藏技术等方面进行了初步研究[2-4]，但对牛干巴制作过程中理化特性变化未见研究，从而导致牛干巴的标准化腌制缺少数据基础和理论指导。基于此，本实验对低温变湿静态腌制过程中牛干巴理化成分的变化特征进行深入研究，为创新牛干巴产业化快速腌制技术提供数据支持，为改进云南、四川、青海等地区特色腌腊牛肉制品加工工艺提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
3岁牦牛的背最长肌（M. longissimus dorsi），采集于青海省河南蒙古族自治县。
无碘盐 中国盐业总公司；三氯乙酸、TBA、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、石英砂、焦磷酸钠、氯化钾、氯化镁、DNPH、乙酸乙酯、盐酸胍、磷酸二氢钾，均为分析纯 国药化学试剂有限公司；EGTA（分析纯） 美国Sigma公司；盐酸、乙醇（分析纯） 北京化工厂。
1.2 仪器与设备
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1.3 方法
1.3.1 工艺流程及操作
牦牛背最长肌→剔除表面脂肪和筋膜→称质量→静态腌制（5%食盐）→于恒湿恒温箱中静置→取样进行指标测定
选取大小相似、质量相近的3块牦牛背最长肌解冻，剔除表面的筋膜和可见脂肪，称质量，按质量比5%添加食盐，在肉块表面涂抹均匀，适当按摩，促进盐分的吸收。将肉块置于托盘中，放入4℃、湿度90%恒温恒湿箱中静置20d，之后将温度、湿度调为20℃、65%，分别在0、3、20、30d取样，用于各项指标的测定。
1.3.2 水分测定
参考GB/T 9695.15—2008《肉与肉制品：水分含量测定》。将牛干巴纵向剖开，以切面的几何中心为圆心，2cm之内的为内部，表皮向内2cm的为外部，各取3次样品，每次取3块牛干巴。
分别于肉块外部和中心切取肉样，在玻璃板上进行四分法处理，用万分之一天平称质量5g肉样m。根据肉样与石英砂5：8的比例，称取适量的石英砂（大约5g肉样，8g石英砂），放入干净烧杯中，接着选取适合的玻璃棒均匀搅拌，并用万分之一天平称得样品，石英砂、玻璃棒和玻璃杯的总质量记为m1。将玻璃杯中的所有物品放入鼓风干燥箱中，干燥2h，冷却干燥后称质量，重复干燥至恒质量，得到质量m2。
1.3.3 盐浓度的测定
使用盐度计直接测定，选取肉块外部和内部中心区域进行测定，取平均值。
1.3.4 色差测定
使用色差计直接测定，分别在肉块外部和内部中心区域选取4个点进行测定，各取平均值，颜色以L*、a*、b*值表示。
1.3.5 脂肪氧化测定（TBARS）
参考Marcos等[5]的酸水解法。2.5g样品加20mL超纯水，用IKA均浆器在室温条件下以转速13500r/min均质3min。取冷的25%TCA溶液5mL加入均质液中，在10000×g、4℃条件下离心15min，取上清液3.5mL，加入1.5mL 0.6%的TBA溶液，（70±2）℃条件下水浴30min，冷却后在532nm波长处测定吸光度。2.5mL超纯水+1mL 25% TCA溶液+1.5mL 0.6% TBA溶液做空白。采用TEP作为标准液。
式中：A为吸光度；b为标准曲线中的截距；k为斜率；m为干物质的质量。
1.3.6 蛋白质含量测定
根据GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》。
1.3.7 蛋白质氧化测定
参考Lund等[6]的方法，取1g样品加入10mL的焦磷酸缓冲液（2.0mmol/L Na4P2O7、10mmol/L Trizma-maleate、100mmol/L KCl、2.0mmol/L MgCl2、2.0mmol/L EGTA，pH7.4），13500r/min均质2min。用Lowry法测定溶液的蛋白质浓度C，取两等分（1mL）均质液，加入2mL 20%的TCA，12000×g离心5min后弃上清液，一份加入2mL 10mmol/L 2，4-二硝基苯肼（DNPH），另一份加入2mL 2mmol/L HCl做空白，在室温条件下培育30min，每间隔3min振荡10s。之后用2mL 20% TCA沉淀蛋白质，12000×g离心5min后用5mL含10mmol/L HCl溶液的乙醇-乙酸乙酯（1：1，V/V）溶液洗涤DNPH 3次，每次12000×g离心5min。沉淀物中加入2mL磷酸二氢钾溶液（含6.0mmol/L盐酸胍，pH2.3），4℃条件下放置过夜后于370nm波长处测定吸光度，用样品的吸光度A1减去相应空白的吸光度A0。 2 结果与分析
2.1 静态腌制过程中水分、盐度、色泽的变化
水分进入肌肉内部是一个以时间为参数的动力学过程，必须克服各种物理屏障和束缚才能扩散进入肌肉纤维和肌原纤维网络结构中，这里的物理障碍和束缚主要是肌肉肌纤维膜以及肌球蛋白的交叉连接等[7]。在腌制过程中，内外部水分逐步下降。腌制前20d内的牛干巴内、外部水分并无差异；至第30天时内、外部差异显著（P<0.05），且外部水分含量总低于内部水分含量。这是由于牛干巴表皮逐渐干硬，抑制了内部水分蒸发，因而外部水分较内侧含量低，且深层肌肉水分蒸发速率也逐步降低；牛干巴表皮没有脂肪覆盖，直接暴露于空气中，因此外部较内部的水分含量降低速率快。
盐度是指产品中食盐的质量分数，是水和食盐组成的溶液体系的质量分数，它决定着组织渗透压的大小、食盐的保藏作用和扩散渗透过程的时间。在静态腌制过程中，腌制品内部的可溶性成分、食盐和水发生再分配[8]。由于这种再分配的结果，根据组织成分、食盐质量分数、盐渍持续的时间，使产品脱水或者是充水[9]。当以干腌法腌制时，肉表面高质量分数的食盐分子逐步向产品中心渗透，形成了扩散作用，使盐分子渗入肌肉内部。如表1所示，随着静态腌制时间的推移，牛干巴外部的盐度逐渐降低，这是盐自外向内逐步渗透的结果；内部的盐度则先增后降，在腌制第20天达到最高，之后盐度下降则是食盐在肌肉各部中逐渐渗透，内部盐度达到平衡所致。
如同干腌火腿的加工过程中肌肉的颜色的变化规律[10]，在整个静态腌制过程中，牛干巴的L*变化不显著（P>0.05）。腌制初期，牛干巴a*、b*都降低，在第20天最高，之后缓慢降低，这与盐分的渗透有极大关联。随着盐分由外向内逐步渗入，牛干巴肉色逐渐加深；在腌制后期随着水分蒸发和盐分在肌肉各部分中溶解，a*、b*逐步降低。
2.2 静态腌制过程中脂肪氧化的变化
TBARS值测定原理是根据食品中不饱和脂肪酸氧化分解而产生丙二醛（CHO-CH2-CHO），利用丙二醛含量对脂肪氧化的程度进行评价。由图1可以看出，静态腌制期间，TBARS的值逐步增加，这是由于加工前期，不饱和脂肪酸持续氧化，生成了大量的挥发性成分，导致丙二醛含量增加[11]，但是到了腌制后期，随着温度的升高，丙二醛进一步氧化生成有机醇和羧酸[12]，从而使TBARS值降低。
图 1 不同静态腌制时间牛干巴脂肪氧化程度
Fig.1 Change in TBARS during the static curing process
原料肉表面新鲜，脂肪氧化是自由基产生的结果[13]，食盐具有较弱的氧化催化作用[14]，同时，食盐也通常被认为是脂肪氧化的介质[15]。由图1可以看出，脂肪氧化值与盐度的趋势趋于一致。在静态腌制初期，随着盐分的渗入，脂肪氧化迅速加快。在腌制20d之后，肌肉表面水分蒸发，肉质变硬，隔绝一部分空气，减少内部肌肉与空气接触，因而脂肪氧化速率降低。
2.3 静态腌制过程中蛋白质含量及氧化水平的变化
图 2 不同静态腌制时间牛干巴中蛋白质（A）和羰基（B）含量
Fig.2 Change in protein （A） and carbonyl （B） content during the static curing process
由图2A可知，蛋白质含量在静态腌制过程中逐步增加，但蛋白质氧化水平也随之加剧。在氧化自由基存在的情况下，会发生蛋白质氧化，导致游离氨基酸和肽段更易酶解[16]。从图2B可知，原料肉表面与空气接触，存在一定蛋白质氧化，内部与空气接触机会少，氧化程度低；后期由于水分降低、盐度升高等原因，蛋白质氧化水平逐步攀升，这与众多学者在熟肉加工过程中的研究结果相一致[17-18]。蛋白质氧化并不是单一的过程，有研究表明脂肪氧化和蛋白质氧化存在一定的相关性[19-20]。脂肪氧化的初级产物和次级产物都可以与蛋白质发生反应，从而引起蛋白质的氧化[21]。同时外在的羰基化合物可通过4-OH-壬烯醛反应结合蛋白质[22]，这些脂肪-蛋白质氧化交互反应产生的羰基复合物形成较快，并且相对稳定[20]。
3 结 论
随着温度湿度的增高，牛干巴在静态腌制过程中盐度先增加后降低，最终质量分数在2%左右。水分随着盐分升高而逐步降低，外部的水分蒸发较内部更为剧烈。在腌制过程中，肌内脂肪和蛋白质氧化持续进行，脂肪氧化先增加后降低，而蛋白质氧化水平逐步升高。
参考文献：
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