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摘 要 以实际应用价值较高的大田成龄去顶番木瓜侧芽为外植体，对采摘的外植体及时进行预处理及不同组合处理，与常规外植体消毒方法作对比试验。结果表明，“采摘时预处理+不同组合处理+常规消毒方法”的多重消毒模式，有利于增加番木瓜外植体的成活率，其中以“外植体采摘去叶后用300 mg/L青霉素钠浸泡→饱和肥皂水洗净→500 mg/L青霉素钠浸泡3 h→75%酒精浸泡30 s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞消毒10 min→无菌水冲洗3次”的灭菌效果最好，外植体成活率达到57.78%。
关键词 番木瓜；外植体；预处理；青霉素钠；多重消毒模式；消毒效果
中图分类号：S667.9；S603.8 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）10-060-03
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20160422.1545.048.html 网络出版时间：2016-4-22 15：45：20
番木瓜（Carica papaya L.）是番木瓜科番木瓜属植物，也称木瓜、万寿果，原产于墨西哥南部和美洲地区，目前在我国热带、亚热带地区广泛种植[1]。因其营养丰富，肉质细滑，柔软香甜，爽口多汁，还具有一定保健作用，是深受人们喜爱的热带水果之一，故其食用价值、经济价值也越来越受到人们的重视，是有广阔发展前景的热带特色果树[2]。由于番木瓜种性复杂，属于特殊的雌雄异株果树，同时存在雌株、雄株和两性株3种株型，常规的种子繁殖难以保证植株株性一致；采用扦插、嫁接等无性繁殖技术的成活率又低，达不到工厂化、规模化的育苗要求[1， 3]。通过选择优良植株的茎尖、侧芽为外植体来进行组织培养，可获得大量同质的种苗，是解决以上难题的有效途径[1， 4]，但是番木瓜外植体初次接种污染率高、成活率低的问题成为制约番木瓜快速繁殖发展的一大瓶颈。
生长健壮、株型、果型、品质、抗性等性状优良的田间成龄番木瓜植株，虽然具有很高的实际应用价值，但生长环境相对复杂，植株表面带菌量多且杂，自身又含有乳白汁液，只对其进行常规外植体消毒很难得到成活率高的无菌体。本研究以性状优良的大田成龄番木瓜侧芽为外植体，外植体采摘时就进行预处理，在常规消毒的基础上，针对番木瓜成龄侧芽带菌多又组织幼嫩不可过度灭菌的特点，选择对幼嫩组织伤害较轻的试剂进行多重消毒灭菌，找出有效降低污染率的方法，为番木瓜组培快繁及工厂化生产打下基础和提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以云南省红河热带农业科学院水果研究中心大田种植，性状优良的番木瓜品种‘苏罗’成龄去顶侧芽为外植体，一般采摘茎段直径0.3～0.6 cm的侧芽。试验中用到的消毒灭菌试剂有：青霉素钠消毒溶液，由哈药集团制药总厂生产的青霉素钠和无菌水配制而成；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液，由中国医药集团上海化学试剂公司生产的聚乙烯吡咯烷酮（K30）和无菌水配制而成；1%NaClO溶液，由贝康生物技术有限公司生产的3%次氯酸钠注入纯水稀释而成；0.1%高锰酸钾溶液，由上海兴塔化工厂生产的分析纯高锰酸钾和无菌水配制而成；多菌灵溶液，由国光农化股份有限公司生产的多菌灵可湿性粉剂与无菌水按比例稀释而成；75%酒精溶液；0.1%升汞溶液。
1.2 试验方法
1.2.1 采摘时预处理
将采摘下的番木瓜侧芽去叶后立即作如下处理：浸入300 mg/L青霉素钠溶液中；用70%酒精棉球涂抹表面和切面后侵入无菌水中；放入干净密封容器中。在进行以上预处理后，用无菌水冲洗干净，进行常规消毒，消毒方法为：75%酒精浸泡30 s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞浸泡10 min→无菌水冲洗3次。然后接种到初步培养基上。以上每个处理接种外植体15个，重复3次，15 d后统计污染率。
1.2.2 多重消毒模式
将采摘时经过300 mg/L青霉素钠浸泡处理的番木瓜侧芽，冲洗干净，再放入饱和肥皂水中洗涤，并用无菌水冲洗，然后用不同试剂处理+常规消毒方法进行外植体消毒对比试验。不同组合处理方式见表1，常规消毒方法同上，每个处理接种外植体30个，重复3次，接入初步培养基上，初步培养基为“MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+5 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖”，pH=5.8。外植体接种后，先暗培养7 d后，置于日光灯下，光照强度为1500 lx，每天光照10～12 h，培养温度（30±2）℃。
1.2.3 统计分析方法
外植体接种15 d后统计污染率、死亡率、成活率。
污染率（%）=污染外植体数/外植体总数×100
死亡率（%）=死亡外植体数/外植体总数×100
成活率（%）=成活外植体数/外植体总数×100
试验数据用SPSS19.0 for windows中的ANOVA进行统计分析，用LSD进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 采摘时预处理对外植体的消毒效果
试验结果表明，“采摘时预处理+常规消毒”对番木瓜外植体消毒有一定降低污染率的作用，与“无菌水+常规消毒”（CK）比较消毒效果显著，其中以300 mg/L青霉素钠溶液浸泡较好，70%酒精棉球涂抹次之（见表2）。由于大田番木瓜露天栽培，生长环境复杂，含菌量多且杂，番木瓜侧芽表皮较薄，植物组织幼嫩，内含有白色乳汁，因此给外植体的消毒灭菌增加了难度。笔者在试验生产过程中发现，取侧芽的番木瓜大田到组培室往往有很长的距离，采摘侧芽到进行外植体消毒也要经过一段时间，根据番木瓜侧芽的特性，采摘时就进行预处理，减少二次污染的概率，提高外植体的成活率是很有必要的。
2.2 多重消毒模式对外植体消毒效果的影响 从图1可见，多重消毒模式比常规消毒模式污染率明显降低，效果显著，其中Y2处理对番木瓜大田成龄侧芽效果最好，污染率最低（35.56%），死亡率较低（6.67%），成活率最高（57.78%）。Y1处理对番木瓜大田成龄侧芽效果次之，成活率42.22%，污染率52.22%，与对照组的污染率、死亡率、成活率相比较也有很好的消毒灭菌效果，和周鹏等研究报道一致[1]。试验也首次尝试利用非化学试剂进行消毒灭菌，选择无残留、无污染的臭氧（Y6处理）进行外植体表面灭菌，效果虽比对照组（CK）稍好，但污染率还是较高，不能达到初次接种的无菌要求。表明消毒效果较好，成活率较高，较实用的消毒方式为Y2组合处理（500 mg/L青霉素钠溶液浸泡3 h+常规消毒方法）。
3 小结与讨论
利用成龄番木瓜侧芽作为外植体材料进行离体培养快速繁殖较具实际应用价值，但田间采摘成年番木瓜侧芽的外植体材料携带大量微生物，如何消毒灭菌，获得无菌外植体，是组培生产中首先要解决的问题。吴坤林等[5]采用合适的消毒剂和消毒程序建立高效无菌外植体技术体系，大幅度提高了消毒灭菌成功率；王龙甫等[6]用ClO2和消佳净为番木瓜外植体消毒新组合试剂也取得一定的效果；王丽萍等[7] 用热水浸泡外植体，再用“75%酒精+15%次氯酸钠5 min+0.1%升汞17 min”消毒剂组合对外植体消毒效果也好。但笔者在实际试验中发现，番木瓜侧芽在0.1%升汞溶液中浸泡时间超过14 min时外植体死亡率就开始急剧增加，建议在实际生产中适当缩短升汞消毒的时间。
对番木瓜成龄侧芽外植体要取得较理想的消毒效果，不但表面消毒灭菌要干净彻底，抑制内生菌的生长也是关键，本试验预处理使用青霉素钠溶液浸泡对内生菌的抑制有一定的效果，通过试验得到如下的多重消毒模式：外植体采摘后及时用300 mg/L青霉素钠浸泡→饱和肥皂水洗净→500 mg/L青霉素钠溶液浸泡3 h+75%酒精浸泡30 s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞浸泡10 min→无菌水冲洗3次，然后接种到初步培养基上。这种多重消毒模式效果较好，外植体成活率达到55%以上，大大提高了获得无菌外植体的成功率。
参考文献：
[1] 周鹏，沈文涛.番木瓜生物技术[M].北京：中国农业出版社，2011.
[2] 陈健.番木瓜品种与栽培彩色图说[M].北京：中国农业出版社，2002.
[3] Litz R E，Conover R A. Effect of sex type，season and other factors on in vitro establishment and culture of Carica papaya L.explants [J].Journal of the American Society of Horticultural Science，1981，106（6）：792-794.
[4] Larkin P J，Scowcroft W R. Some clonal variation anoval source of variability from cell culture for plant improvement [J].Theory and Applied Genet， 1981（60）：197-214.
[5] 吴坤林，曾宋君，张志胜，等.番木瓜外植体消毒方法研究[J].福建林业科技，2008，35（3）：76-79.
[6] 王龙甫，陈彪，梁钾贤，等.大田番木瓜外植体消毒灭菌方法探讨[J].中国南方果树，2010，39（2）：42-44.
[7] 王丽萍，邓泽周，叶祖烈，等.成龄番木瓜组培快繁技术研究[J].广东农业科学，2012（3）：43-45.
（责任编辑：丁志祥）
关键词 番木瓜；外植体；预处理；青霉素钠；多重消毒模式；消毒效果
中图分类号：S667.9；S603.8 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2016）10-060-03
知网出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20160422.1545.048.html 网络出版时间：2016-4-22 15：45：20
番木瓜（Carica papaya L.）是番木瓜科番木瓜属植物，也称木瓜、万寿果，原产于墨西哥南部和美洲地区，目前在我国热带、亚热带地区广泛种植[1]。因其营养丰富，肉质细滑，柔软香甜，爽口多汁，还具有一定保健作用，是深受人们喜爱的热带水果之一，故其食用价值、经济价值也越来越受到人们的重视，是有广阔发展前景的热带特色果树[2]。由于番木瓜种性复杂，属于特殊的雌雄异株果树，同时存在雌株、雄株和两性株3种株型，常规的种子繁殖难以保证植株株性一致；采用扦插、嫁接等无性繁殖技术的成活率又低，达不到工厂化、规模化的育苗要求[1， 3]。通过选择优良植株的茎尖、侧芽为外植体来进行组织培养，可获得大量同质的种苗，是解决以上难题的有效途径[1， 4]，但是番木瓜外植体初次接种污染率高、成活率低的问题成为制约番木瓜快速繁殖发展的一大瓶颈。
生长健壮、株型、果型、品质、抗性等性状优良的田间成龄番木瓜植株，虽然具有很高的实际应用价值，但生长环境相对复杂，植株表面带菌量多且杂，自身又含有乳白汁液，只对其进行常规外植体消毒很难得到成活率高的无菌体。本研究以性状优良的大田成龄番木瓜侧芽为外植体，外植体采摘时就进行预处理，在常规消毒的基础上，针对番木瓜成龄侧芽带菌多又组织幼嫩不可过度灭菌的特点，选择对幼嫩组织伤害较轻的试剂进行多重消毒灭菌，找出有效降低污染率的方法，为番木瓜组培快繁及工厂化生产打下基础和提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以云南省红河热带农业科学院水果研究中心大田种植，性状优良的番木瓜品种‘苏罗’成龄去顶侧芽为外植体，一般采摘茎段直径0.3～0.6 cm的侧芽。试验中用到的消毒灭菌试剂有：青霉素钠消毒溶液，由哈药集团制药总厂生产的青霉素钠和无菌水配制而成；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）溶液，由中国医药集团上海化学试剂公司生产的聚乙烯吡咯烷酮（K30）和无菌水配制而成；1%NaClO溶液，由贝康生物技术有限公司生产的3%次氯酸钠注入纯水稀释而成；0.1%高锰酸钾溶液，由上海兴塔化工厂生产的分析纯高锰酸钾和无菌水配制而成；多菌灵溶液，由国光农化股份有限公司生产的多菌灵可湿性粉剂与无菌水按比例稀释而成；75%酒精溶液；0.1%升汞溶液。
1.2 试验方法
1.2.1 采摘时预处理
将采摘下的番木瓜侧芽去叶后立即作如下处理：浸入300 mg/L青霉素钠溶液中；用70%酒精棉球涂抹表面和切面后侵入无菌水中；放入干净密封容器中。在进行以上预处理后，用无菌水冲洗干净，进行常规消毒，消毒方法为：75%酒精浸泡30 s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞浸泡10 min→无菌水冲洗3次。然后接种到初步培养基上。以上每个处理接种外植体15个，重复3次，15 d后统计污染率。
1.2.2 多重消毒模式
将采摘时经过300 mg/L青霉素钠浸泡处理的番木瓜侧芽，冲洗干净，再放入饱和肥皂水中洗涤，并用无菌水冲洗，然后用不同试剂处理+常规消毒方法进行外植体消毒对比试验。不同组合处理方式见表1，常规消毒方法同上，每个处理接种外植体30个，重复3次，接入初步培养基上，初步培养基为“MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+5 g/L卡拉胶+30 g/L蔗糖”，pH=5.8。外植体接种后，先暗培养7 d后，置于日光灯下，光照强度为1500 lx，每天光照10～12 h，培养温度（30±2）℃。
1.2.3 统计分析方法
外植体接种15 d后统计污染率、死亡率、成活率。
污染率（%）=污染外植体数/外植体总数×100
死亡率（%）=死亡外植体数/外植体总数×100
成活率（%）=成活外植体数/外植体总数×100
试验数据用SPSS19.0 for windows中的ANOVA进行统计分析，用LSD进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 采摘时预处理对外植体的消毒效果
试验结果表明，“采摘时预处理+常规消毒”对番木瓜外植体消毒有一定降低污染率的作用，与“无菌水+常规消毒”（CK）比较消毒效果显著，其中以300 mg/L青霉素钠溶液浸泡较好，70%酒精棉球涂抹次之（见表2）。由于大田番木瓜露天栽培，生长环境复杂，含菌量多且杂，番木瓜侧芽表皮较薄，植物组织幼嫩，内含有白色乳汁，因此给外植体的消毒灭菌增加了难度。笔者在试验生产过程中发现，取侧芽的番木瓜大田到组培室往往有很长的距离，采摘侧芽到进行外植体消毒也要经过一段时间，根据番木瓜侧芽的特性，采摘时就进行预处理，减少二次污染的概率，提高外植体的成活率是很有必要的。
2.2 多重消毒模式对外植体消毒效果的影响 从图1可见，多重消毒模式比常规消毒模式污染率明显降低，效果显著，其中Y2处理对番木瓜大田成龄侧芽效果最好，污染率最低（35.56%），死亡率较低（6.67%），成活率最高（57.78%）。Y1处理对番木瓜大田成龄侧芽效果次之，成活率42.22%，污染率52.22%，与对照组的污染率、死亡率、成活率相比较也有很好的消毒灭菌效果，和周鹏等研究报道一致[1]。试验也首次尝试利用非化学试剂进行消毒灭菌，选择无残留、无污染的臭氧（Y6处理）进行外植体表面灭菌，效果虽比对照组（CK）稍好，但污染率还是较高，不能达到初次接种的无菌要求。表明消毒效果较好，成活率较高，较实用的消毒方式为Y2组合处理（500 mg/L青霉素钠溶液浸泡3 h+常规消毒方法）。
3 小结与讨论
利用成龄番木瓜侧芽作为外植体材料进行离体培养快速繁殖较具实际应用价值，但田间采摘成年番木瓜侧芽的外植体材料携带大量微生物，如何消毒灭菌，获得无菌外植体，是组培生产中首先要解决的问题。吴坤林等[5]采用合适的消毒剂和消毒程序建立高效无菌外植体技术体系，大幅度提高了消毒灭菌成功率；王龙甫等[6]用ClO2和消佳净为番木瓜外植体消毒新组合试剂也取得一定的效果；王丽萍等[7] 用热水浸泡外植体，再用“75%酒精+15%次氯酸钠5 min+0.1%升汞17 min”消毒剂组合对外植体消毒效果也好。但笔者在实际试验中发现，番木瓜侧芽在0.1%升汞溶液中浸泡时间超过14 min时外植体死亡率就开始急剧增加，建议在实际生产中适当缩短升汞消毒的时间。
对番木瓜成龄侧芽外植体要取得较理想的消毒效果，不但表面消毒灭菌要干净彻底，抑制内生菌的生长也是关键，本试验预处理使用青霉素钠溶液浸泡对内生菌的抑制有一定的效果，通过试验得到如下的多重消毒模式：外植体采摘后及时用300 mg/L青霉素钠浸泡→饱和肥皂水洗净→500 mg/L青霉素钠溶液浸泡3 h+75%酒精浸泡30 s→无菌水冲洗2次→0.1%升汞浸泡10 min→无菌水冲洗3次，然后接种到初步培养基上。这种多重消毒模式效果较好，外植体成活率达到55%以上，大大提高了获得无菌外植体的成功率。
参考文献：
[1] 周鹏，沈文涛.番木瓜生物技术[M].北京：中国农业出版社，2011.
[2] 陈健.番木瓜品种与栽培彩色图说[M].北京：中国农业出版社，2002.
[3] Litz R E，Conover R A. Effect of sex type，season and other factors on in vitro establishment and culture of Carica papaya L.explants [J].Journal of the American Society of Horticultural Science，1981，106（6）：792-794.
[4] Larkin P J，Scowcroft W R. Some clonal variation anoval source of variability from cell culture for plant improvement [J].Theory and Applied Genet， 1981（60）：197-214.
[5] 吴坤林，曾宋君，张志胜，等.番木瓜外植体消毒方法研究[J].福建林业科技，2008，35（3）：76-79.
[6] 王龙甫，陈彪，梁钾贤，等.大田番木瓜外植体消毒灭菌方法探讨[J].中国南方果树，2010，39（2）：42-44.
[7] 王丽萍，邓泽周，叶祖烈，等.成龄番木瓜组培快繁技术研究[J].广东农业科学，2012（3）：43-45.
（责任编辑：丁志祥）