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【关键词】 精浆外泌体;精子发生;功能调控
中图分类号：R711.6 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.09.014
精浆是精子运输和功能调控的载体[1]，精浆微环境直接影响精子质量和受精功能，精浆外泌体作为精浆成分中重要部分，具有膜结合特征的双层磷脂结构，可携带并传递各种调控分子如蛋白质、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）与脂质内容物等[2]，特殊的结构使其拥有信号运输和调控等重要功能，近年研究发现精浆外泌体中信号传递通路对精子发生和运动能力获得有重要调控作用[3～4]。因此本文就精浆外泌体的结构功能、提取方法以及在精子发生成熟、功能调控中的作用机制进行综述。
1 精浆外泌体概述
外泌体是细胞分泌的一种类似于囊泡的纳米级颗粒，外泌体中蕴含有多种机体代谢和生长所必须的重要物质，例如DNA、RNA和蛋白质等[5]，能实现信号传递以及调控功能，对机体的多种细胞信号传输做介導，因此在很多疾病上可利用外泌体作为诊断指标[6]。在对癌症研究的进展中，发现循环体液中的外泌体可作为癌症诊断的分子标记，外泌体中含有一种miR-1910-3p血清能够促进乳腺癌细胞的迁移和增殖，该血清与传统肿瘤标志物CA153结合使用可增加乳腺癌诊断的敏感性[7]。在肝癌细胞研究上也发现肝癌的发生过程中外泌体可以通过内吞作用或者配体-受体结合来传递信息至靶细胞后发挥作用，是肝癌细胞增殖的重要部分[8]。因此对外泌体进行研究不仅对癌细胞意义重大，对整个机体细胞的活动都至关重要。
精浆外泌体是存在于精浆中的膜性囊泡，按分泌器官来源可以分为前列腺小体和附睾小体，它们主要由上皮细胞以顶浆分泌的形式进入精浆，是精浆微环境的重要组成部分，由于精子特殊的生理结构，胞质含量极少，缺乏体细胞具有的清除酶和细胞器，同时精子受精前基因组转录处于沉默状态，因此精子发生与成熟对其微环境较为依赖。精浆外泌体发挥功能主要依靠其作为载体携带的特殊组分，包括蛋白质、核酸、脂质和离子等，精浆外泌体通过膜融合机制被精子摄取，在精子自身的成熟和功能调控中发挥作用。研究发现不育男性与正常男性精浆外泌体的相关miRNA表达谱存在显著差异，表明某些关键miRNA可能介导了男性不育发生[9]。精浆外泌体作为载体运输的piRNAs在生殖系统细胞中的转录、逆转录以及逆转录后的基因沉默中有重要作用，特别是在精子发生过程中，piRNAs扮演着信息传递的角色[10]。因此对精浆外泌体的研究有可能发现男性不育疾病发生的新机制，筛选的差异性功能因子有可能成为男性不育诊断的特异性指标。
2 精浆外泌体的提取方法
不同组织来源的外泌体提取方法不同，整体而言大致分为两种，离心法和试剂盒提取法[11]。离心法常见的有密度梯度离心法、超速离心法、差速离心法。精浆外泌体提取与胞外囊泡提取相似，刘聪慧等[12]研究发现，利用差速离心法与密度梯度离心法能顺利提取胞外囊泡，但可能提取后产物纯度低。差速离心法主要原理为根据密度和粒子大小设置不同离心力，有差别离心后通过平衡沉降原理完成提纯，但因为设置的范围内涵盖的粒子较广，可能提取产物纯度不高。密度梯度离心法应用在常见组织提纯中，特别是针对细胞内的分子与大分子物质，一般分离分子密度介于1.1～1.9 g/mL之间，因此离心常用介质为蔗糖，但介质密度范围过大，会造成滤过不纯的结果。因早期外泌体提取方法有一定的误差，提取物不纯，有研究者开始使用纳米级材料提取外泌体[13]，例如在血浆中提取外泌体，使用ExoQuick试剂盒提取外泌体，该方法提取到的外泌体蛋白质浓度是传统密度梯度离心法的19倍以上。随着研究的深入与发展，最近有研究者还尝试了纯化试剂盒提取法提取小鼠血清的外泌体[14]，此方法提取外泌体操作简单快捷，并且不容易出错，适合提取容量较大的样本，提高研究效率。总结来说提取外泌体如试验要求纯度不高时可利用简单快捷的传统方法如超速离心法与密度梯度离心法，或者使用纯化试剂盒提取法，但要求高时可利用纳米级操作提取，并且不同方法提取的外泌体成分可能有所差异，因此未来研究要进一步优化精浆外泌体提取操作，以便对精浆外泌体调控作用原理以及机制进行深入研究。
3 精浆外泌体在精子发生中的作用
精浆外泌体在精子发生过程中起到信号传递的作用，对调节精子发生有重要影响。精子发生要经过许多器官的作用，还需要许多因素协同作用，而调节协同作用传输信号的关键物质就是精浆外泌体。精浆外泌体成分复杂，其来自附睾、前列腺还有精囊等[15]。外泌体是细胞间通讯的关键，能够为细胞相互传递信号分子和物质建立桥梁，不仅如此，精浆外泌体还能在弱酸条件下（pH为5～7）与精子进行融合;当pH值过高时（pH>7）则基本不会进行融合[16]。前列腺液与精液的pH值在7.4左右，这证明精浆外泌体促进精子获能和运动一般不发生在射精前，主要发生在射精后[17]。精浆外泌体还携带多种具有生物学功能的蛋白质，蛋白质组学研究发现人精浆外泌体中的蛋白质相对分子质量大且具有不同功能类别，包括酶、黏附分子、转运和信号传递蛋白等，其对精子有多方面生物学作用[18]，醛酮还原酶家族1成员B1、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、5型谷胱甘肽过氧化物酶、泛素和精子黏附分子-1等直接参与精子活力和受精能力获得，在精子氧化损伤防护中起到作用，FRENETTE等[19]发现巨噬细胞移动抑制因子与附睾小体结合，当附睾小体与精子融合时进入精子，通过作用于精子鞭毛上游离的巯基基团，防止二硫键提前形成，移除结合于精子鞭毛上的锌离子，进而改变精子活力，促进精子成熟。精浆外泌体中的mRNA和非编码小RNA不仅是潜在的免疫调节分子，还具有遗传性[20～21]。
4 精浆外泌体在精子功能调控中的作用 据统计目前育龄夫妇不孕不育症的发生率为15%～20%，其中男性因素约占50%[22～23]，精子功能是保证正常受精的关键，精子活力及功能异常是导致男性不育的重要原因[24～25]。我们前期研究证实精子功能障碍常呈多因素并发[26～27]，精子活力低下多与精子形态异常、精子DNA碎片率升高、顶体功能障碍等并发，显著影响精子正常受精功能，是导致男性不育的重要诱因，同时也是导致辅助生殖助孕周期受精失败、胚胎发育异常、早期流产等治疗结局差的重要原因[28]。精浆外泌体作为精浆微环境的重要组成部分，既参与精子发生，又在调节成熟精子功能中起到重要作用。有研究认为精浆外泌体具有免疫抑制效应，促进精液液化，同时精浆外泌体含有丰富的胆固醇、钙离子和表面膜蛋白，与精子融合之后能够促进精子活力、顶体反应发生[29]。同时精浆外泌体在精子活力调控中也具有重要作用，SULLIVAN等[30]发现精子在附睾的成熟过程中，外泌体是产生具有最佳受精能力的雄性配子所必须的，MURDICA等[10]的研究显示，精浆中外泌体可以通过增加诱导酪氨酸磷酸化来促进精子获能，从而引发顶体反应。DU等[31]的研究通过添加不同比例的公猪精浆外泌体证实外泌体可以提高体外储存精子活力，延长精子保存期限，改善精子质膜完整性，增加抗氧化能力。因此我们推测，精浆外泌体对精子功能调控具有重大影响，其中还有许多调控通路与机制值得进行深入研究。
5 小结与展望
精浆外泌体在精浆中广泛存在，其作为精子生存的重要生理微环境，在精子成熟及活力调控中起到至关重要作用，精浆外泌体功能及作用机制研究已成为男性不育研究中全新热点领域，但目前精浆外泌体调控精子活力及运动的具体机制仍未完全阐明，因此开展相关研究非常有必要。尤其基于现在多组学联合分析技术的发展，针对男性不育患者精浆外泌体进行全蛋白组、全转录组的系统研究，绘制出不育男性精浆外泌体蛋白质组、转录组的全景图及其与正常男性的动态差异图，从疾病整体角度进行联合分析，进而挖掘出在精子发生与功能调控过程中的关键蛋白及关键基因表达调控通路，将有助于阐明男性不育发生的分子机理，有可能提供精浆外泌体中关键因子影响精子发生与功能的直接证据，揭示精浆外泌体调控精子功能的具体机制，为男性不育的诊断提供新的诊断指标，为男性不育临床治疗提供新的途径。
参 考 文 献
[1] 彭佳丽，肖卓妮.精液外泌体在生殖系统中的研究进展[J].中国性科学，2020，29（3）：11-14.
[2] 徐天星，徐望明，张婕.外泌体与囊胚发育及种植关系研究新进展[J].生殖医学杂志，2020，29（6）：829-833.
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[4] PORTNOY V，EVGUENIEVA-HACKENBERG- E，KLEIN F，et al.RNA polyadenylation in Archaea：not observed in Haloferax while the exosome polynucleotidylates RNA in Sulfolobus[J].EMBO Rep，2005，6（12）：1188-1193.
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（收稿日期：2021-08-18 修回日期：2021-09-01）
（编辑：潘明志）
中图分类号：R711.6 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.09.014
精浆是精子运输和功能调控的载体[1]，精浆微环境直接影响精子质量和受精功能，精浆外泌体作为精浆成分中重要部分，具有膜结合特征的双层磷脂结构，可携带并传递各种调控分子如蛋白质、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）与脂质内容物等[2]，特殊的结构使其拥有信号运输和调控等重要功能，近年研究发现精浆外泌体中信号传递通路对精子发生和运动能力获得有重要调控作用[3～4]。因此本文就精浆外泌体的结构功能、提取方法以及在精子发生成熟、功能调控中的作用机制进行综述。
1 精浆外泌体概述
外泌体是细胞分泌的一种类似于囊泡的纳米级颗粒，外泌体中蕴含有多种机体代谢和生长所必须的重要物质，例如DNA、RNA和蛋白质等[5]，能实现信号传递以及调控功能，对机体的多种细胞信号传输做介導，因此在很多疾病上可利用外泌体作为诊断指标[6]。在对癌症研究的进展中，发现循环体液中的外泌体可作为癌症诊断的分子标记，外泌体中含有一种miR-1910-3p血清能够促进乳腺癌细胞的迁移和增殖，该血清与传统肿瘤标志物CA153结合使用可增加乳腺癌诊断的敏感性[7]。在肝癌细胞研究上也发现肝癌的发生过程中外泌体可以通过内吞作用或者配体-受体结合来传递信息至靶细胞后发挥作用，是肝癌细胞增殖的重要部分[8]。因此对外泌体进行研究不仅对癌细胞意义重大，对整个机体细胞的活动都至关重要。
精浆外泌体是存在于精浆中的膜性囊泡，按分泌器官来源可以分为前列腺小体和附睾小体，它们主要由上皮细胞以顶浆分泌的形式进入精浆，是精浆微环境的重要组成部分，由于精子特殊的生理结构，胞质含量极少，缺乏体细胞具有的清除酶和细胞器，同时精子受精前基因组转录处于沉默状态，因此精子发生与成熟对其微环境较为依赖。精浆外泌体发挥功能主要依靠其作为载体携带的特殊组分，包括蛋白质、核酸、脂质和离子等，精浆外泌体通过膜融合机制被精子摄取，在精子自身的成熟和功能调控中发挥作用。研究发现不育男性与正常男性精浆外泌体的相关miRNA表达谱存在显著差异，表明某些关键miRNA可能介导了男性不育发生[9]。精浆外泌体作为载体运输的piRNAs在生殖系统细胞中的转录、逆转录以及逆转录后的基因沉默中有重要作用，特别是在精子发生过程中，piRNAs扮演着信息传递的角色[10]。因此对精浆外泌体的研究有可能发现男性不育疾病发生的新机制，筛选的差异性功能因子有可能成为男性不育诊断的特异性指标。
2 精浆外泌体的提取方法
不同组织来源的外泌体提取方法不同，整体而言大致分为两种，离心法和试剂盒提取法[11]。离心法常见的有密度梯度离心法、超速离心法、差速离心法。精浆外泌体提取与胞外囊泡提取相似，刘聪慧等[12]研究发现，利用差速离心法与密度梯度离心法能顺利提取胞外囊泡，但可能提取后产物纯度低。差速离心法主要原理为根据密度和粒子大小设置不同离心力，有差别离心后通过平衡沉降原理完成提纯，但因为设置的范围内涵盖的粒子较广，可能提取产物纯度不高。密度梯度离心法应用在常见组织提纯中，特别是针对细胞内的分子与大分子物质，一般分离分子密度介于1.1～1.9 g/mL之间，因此离心常用介质为蔗糖，但介质密度范围过大，会造成滤过不纯的结果。因早期外泌体提取方法有一定的误差，提取物不纯，有研究者开始使用纳米级材料提取外泌体[13]，例如在血浆中提取外泌体，使用ExoQuick试剂盒提取外泌体，该方法提取到的外泌体蛋白质浓度是传统密度梯度离心法的19倍以上。随着研究的深入与发展，最近有研究者还尝试了纯化试剂盒提取法提取小鼠血清的外泌体[14]，此方法提取外泌体操作简单快捷，并且不容易出错，适合提取容量较大的样本，提高研究效率。总结来说提取外泌体如试验要求纯度不高时可利用简单快捷的传统方法如超速离心法与密度梯度离心法，或者使用纯化试剂盒提取法，但要求高时可利用纳米级操作提取，并且不同方法提取的外泌体成分可能有所差异，因此未来研究要进一步优化精浆外泌体提取操作，以便对精浆外泌体调控作用原理以及机制进行深入研究。
3 精浆外泌体在精子发生中的作用
精浆外泌体在精子发生过程中起到信号传递的作用，对调节精子发生有重要影响。精子发生要经过许多器官的作用，还需要许多因素协同作用，而调节协同作用传输信号的关键物质就是精浆外泌体。精浆外泌体成分复杂，其来自附睾、前列腺还有精囊等[15]。外泌体是细胞间通讯的关键，能够为细胞相互传递信号分子和物质建立桥梁，不仅如此，精浆外泌体还能在弱酸条件下（pH为5～7）与精子进行融合;当pH值过高时（pH>7）则基本不会进行融合[16]。前列腺液与精液的pH值在7.4左右，这证明精浆外泌体促进精子获能和运动一般不发生在射精前，主要发生在射精后[17]。精浆外泌体还携带多种具有生物学功能的蛋白质，蛋白质组学研究发现人精浆外泌体中的蛋白质相对分子质量大且具有不同功能类别，包括酶、黏附分子、转运和信号传递蛋白等，其对精子有多方面生物学作用[18]，醛酮还原酶家族1成员B1、磷脂酰乙醇胺结合蛋白、5型谷胱甘肽过氧化物酶、泛素和精子黏附分子-1等直接参与精子活力和受精能力获得，在精子氧化损伤防护中起到作用，FRENETTE等[19]发现巨噬细胞移动抑制因子与附睾小体结合，当附睾小体与精子融合时进入精子，通过作用于精子鞭毛上游离的巯基基团，防止二硫键提前形成，移除结合于精子鞭毛上的锌离子，进而改变精子活力，促进精子成熟。精浆外泌体中的mRNA和非编码小RNA不仅是潜在的免疫调节分子，还具有遗传性[20～21]。
4 精浆外泌体在精子功能调控中的作用 据统计目前育龄夫妇不孕不育症的发生率为15%～20%，其中男性因素约占50%[22～23]，精子功能是保证正常受精的关键，精子活力及功能异常是导致男性不育的重要原因[24～25]。我们前期研究证实精子功能障碍常呈多因素并发[26～27]，精子活力低下多与精子形态异常、精子DNA碎片率升高、顶体功能障碍等并发，显著影响精子正常受精功能，是导致男性不育的重要诱因，同时也是导致辅助生殖助孕周期受精失败、胚胎发育异常、早期流产等治疗结局差的重要原因[28]。精浆外泌体作为精浆微环境的重要组成部分，既参与精子发生，又在调节成熟精子功能中起到重要作用。有研究认为精浆外泌体具有免疫抑制效应，促进精液液化，同时精浆外泌体含有丰富的胆固醇、钙离子和表面膜蛋白，与精子融合之后能够促进精子活力、顶体反应发生[29]。同时精浆外泌体在精子活力调控中也具有重要作用，SULLIVAN等[30]发现精子在附睾的成熟过程中，外泌体是产生具有最佳受精能力的雄性配子所必须的，MURDICA等[10]的研究显示，精浆中外泌体可以通过增加诱导酪氨酸磷酸化来促进精子获能，从而引发顶体反应。DU等[31]的研究通过添加不同比例的公猪精浆外泌体证实外泌体可以提高体外储存精子活力，延长精子保存期限，改善精子质膜完整性，增加抗氧化能力。因此我们推测，精浆外泌体对精子功能调控具有重大影响，其中还有许多调控通路与机制值得进行深入研究。
5 小结与展望
精浆外泌体在精浆中广泛存在，其作为精子生存的重要生理微环境，在精子成熟及活力调控中起到至关重要作用，精浆外泌体功能及作用机制研究已成为男性不育研究中全新热点领域，但目前精浆外泌体调控精子活力及运动的具体机制仍未完全阐明，因此开展相关研究非常有必要。尤其基于现在多组学联合分析技术的发展，针对男性不育患者精浆外泌体进行全蛋白组、全转录组的系统研究，绘制出不育男性精浆外泌体蛋白质组、转录组的全景图及其与正常男性的动态差异图，从疾病整体角度进行联合分析，进而挖掘出在精子发生与功能调控过程中的关键蛋白及关键基因表达调控通路，将有助于阐明男性不育发生的分子机理，有可能提供精浆外泌体中关键因子影响精子发生与功能的直接证据，揭示精浆外泌体调控精子功能的具体机制，为男性不育的诊断提供新的诊断指标，为男性不育临床治疗提供新的途径。
参 考 文 献
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[7] 劉瀚予，贾莉莉，喻文立，等.外泌体在肝癌中的作用机制[J].医学信息，2020，33（8）：26-28.
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[9] RENNEBERG H，KONRAD L，DAMMSHUSER I，et al.Immunohistochemistry of prostasomes from human semen[J].Prostate，1997，30（2）：98-106.
[10] MURDICA V，GIACOMINI E，ALTERI A，et al.Seminal plasma of men with severe asthenozoospermia contain exosomes that affect spermatozoa motility and capacitation[J].Fertil Steril，2019，111（5）：897-908.e2. [11] 王有礼，谭明娟，葛贤秀.胆汁中外泌体及外泌体RNA提取方法比较[J].检验医学与临床，2019，16（23）：3405-3409.
[12] 刘聪慧，殷慧群，姜宏.胞外囊泡分离提取方法的研究进展[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2017，36（2）：125-129.
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[14] 孙有良，王宇童.两种提取小鼠血清来源外泌体方法的比较[J].中国医药导报，2020，17（7）：4-7.
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（收稿日期：2021-08-18 修回日期：2021-09-01）
（编辑：潘明志）