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摘 要 为了明确陆稻在不同逆境胁迫下的抗性表现，利用云南省4个稻瘟病菌优势小种对30个云南陆稻品种进行抗稻瘟病鉴定，并对其进行抗旱性评价及SSR多样性分析。结果表明：抗病能力中等以上品种占所检测品种的60%，抗旱能力中等以上品种占所有供试品种的66.7%，平均有效等位基因数为1.097 5、Nei’s基因多样性指数（H）平均为0.077 8；相关分析结果显示，供试品种的抗瘟性与抗旱性间存在显著的相关关系。本研究结果表明，供试品种间存在丰富的遗传多样性变异，且在面临不同逆境胁迫时具有相近的抗性表现，使得育种过程中培育兼具较好抗瘟、抗旱能力的栽培稻新品种成为可能。
关键词 陆稻；稻瘟病抗性；抗旱性；SSR分子标记
中图分类号 S332.1 文献标识码 A
植物对逆境的抵抗和耐受能力称之为抗逆性，即植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应性，这些不良环境包括干旱、高温、盐胁迫、低温、病原物入侵等多种形式[1-3]。植物在整个生命周期中，一直处于变化着的环境中。适宜的环境条件能保证植物正常的生长发育，而不适宜的生物或非生物逆境条件则会抑制植物的生长，甚至使植物死亡。稻瘟病是世界水稻生产最具有毁灭性的病害之一。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）生理小种的多样性、致病力的多样性和极易变异性是稻瘟病难以控制的主要原因[4-7]。干旱是植物生长和农作物产量影响最为明显的非生物逆境环境因子之一，由此产生的非生物胁迫是引起全球粮食作物减产的重要原因，从而造成了许多重要粮食作物大量减产[8]。 陆稻具有较好的抗稻瘟病能力， 张启星等[9]对河北省地方陆稻品种的抗病性研究后发现，陆稻品种在抗稻瘟病频度和强度上均高于当地水稻品种。近年来，国内外学者对陆稻抗旱性研究主要集中在水分胁迫对陆稻植株的伤害机理[10-12]、陆稻抗旱的生理生化机制[13]、抗旱性鉴定方法与指标上[14]，而在涉及抗旱性状相关的基因工程研究及抗旱性遗传与育种研究上则刚刚起步。
本研究以云南陆稻品种为材料，通过对供试品种进行苗期稻瘟病抗性鉴定、早期抗旱性评价与遗传多样性分析，试图探讨云南陆稻品种抗病性、抗旱性与遗传多样性三者之间的关系，以期能为陆稻抗逆性研究及优良亲本的选育提供一定的帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物 本实验所用的植物来源于云南省5个州/市、10个县/区的30个陆稻品种，其品种名称、来源详见表1。
1.1.2 供试菌株 选用近年来云南省稻区稻瘟病菌优势小种为致病菌株：1个小种（ZB15）来自籼稻区，3个小种（ZD3、ZE1和ZE3）来自粳稻区。
1.2 方法
1.2.1 稻瘟病抗性鉴定 供试品种先浸种24 h，再用2%的福尔马林（40%的甲醛溶液）消毒2 h，然后用自来水冲洗干净，于35 ℃的温度条件下进行催芽，露白后播种于育种盆内，每盆种5个陆稻品种和1个感病对照品种（丽江新团黑谷），每穴种15粒左右，每个处理设3个重复。在温室中育苗，稻苗长至四叶一心时，采用人工接种法对供试品种进行稻瘟病抗性鉴定。
选用混合菌株进行接种。产孢培养2～3 d后，用0.2%吐温20（Tween20）溶液将病菌孢子从培养皿表面冲洗入烧杯内，配置成混合孢子悬浮液（浓度为106孢子/mL），菌液浓度为100倍显微镜下30～50个孢子/视野。用空气压缩机连接喷雾器在接种箱中喷雾接种，接种后黑暗保湿24 h，辅以喷水保湿，促进病害的发生。接种后7～10 d观察记载发病情况，待感病对照品种的病情达9级时，按中华人民共和国农业部行业标准（2003）调查记载病情（表2）[15]。
1.2.2 抗旱性鉴定 在直径为90 mm的培养皿底部垫上圆形滤纸，每皿放50粒种子，再加PEG溶液20 mL，加液盖好后置28 ℃左右发芽，PEG溶液设置0%、15% 2个水平，设置3个重复，5 d后测量其相对幼芽粗度（Relative germ roughness， RGR）、相对幼根长度（Relative radicle length， RRL）和相对幼根粗度（Relative radicle roughness， RRR）。
1.2.3 遗传多样性分析 ①陆稻基因组DNA的提取：陆稻幼苗长到三叶一心期剪取叶片，利用CTAB法[16]提取每个品种的10个单株的全基因组DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。加入去离子双蒸水稀释至25 ng/μL，于-20 ℃下保存备用。
②SSR-PCR的扩增：选取均匀分布在水稻12条染色体上的24对多态性高、条带清晰、稳定性好的引物对供试品种进行SSR-PCR扩增。20 μL反应体系包括：1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.68 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L的SSR引物，25 ng DNA模板及1 U Taq酶。反应程序为：95 ℃预变性 5 min；然后94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，42个循环；最后72 ℃延伸10 min，产物于4 ℃保存备用，反应在Eppendorf PCR扩增仪上进行。PCR产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定电压100 V，电泳2.5 h，经银染、显影后，拍照贮存备用[17-18]。
1.3 数据处理
1.3.1 抗旱性数据分析 相对值=胁迫测定值/对照测定值，陆稻抗旱性评价方法采用抗旱性隶属函数法[19]。
Xij=
式中Xij为i品种j性状值，Xmin为j性状中最小值，Xmax为j性状中最大值，Xij为i品种j性状的抗旱隶属值。然后将品种所有性状的抗旱隶属值进行累加，求其平均数。
Xi=Xij
式中Xi是i品种的抗旱隶属函数值，Xi大的抗旱性强，并规定抗旱程度的指标值为：当Xi≥0.80为强抗，0.50 2 结果与分析
2.1 陆稻品种人工接种的测定
2.2 抗旱性鉴定
1个、中抗品种5个、低抗品种4个，红河州拥有中抗品种1个。
2.3 遗传多样性分析
30个陆稻品种间也存在相当大的遗传多样性变异，其中Ne的变化幅度为0.099 6～1.462 2，平均Ne为1.097 5；I的变化幅度为0.000 0～0.396 8，平均I为0.128 2；Ho的变化幅度为0.000 0～0.034 8，平均Ho为0.002 8；He变化幅度为0.000 0～0.258 1，平均He为0.081 8；H的变幅为0.000～0.245 2，平均H为0.077 8（表4）。
2.4 相关性分析
3 讨论与结论
物种遗传多样性丰富、群体稳定、抗逆性和抗病性较强[22]。而本研究结果却显示供试陆稻品种的遗传多样性与稻瘟病抗性和抗旱性之间无显著相关性，究其原因可能是本研究所选用的SSR标记为中性标记，反映的是基因组背景上的多态性，与功能基因多不连锁，即与表型不直接相关[23]。植物表现抗逆性是环境、植物自身和胁迫条件相互作用的结果，而SSR分子标记只是基因组中的一些片段，难以反映其抗性表现的全貌。
本研究供试品种的病害级别与抗旱隶属函数值之间却存在一个极显著的负相关关系，表明抗病能力越强的品种，在干旱胁迫下越能够表现出更好的抗旱能力。此现象的原因可能是因为植物在承受各种逆境胁迫条件时，存在某些共同的分子调节机制。例如在胁迫信号的感应和转导方面，脱落酸（Absicisic acid，ABA）是一种小分子亲脂性的植物激素，具有调节植物发育、种子休眠、发芽、细胞分裂和在细胞水平上具有对干旱、寒冷、盐碱、病害和紫外辐射等环境胁迫的响应能力[24-25]；促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）级联信号通路在抵抗植物的非生物和生物胁迫中也都发挥了重要的作用，大量的研究表明激素、非生物胁迫、病原物、病原物激发子在发育的特定阶都能激活植物中的MAPK途径[26]，水稻中OsMAPK5a在接种稻瘟病病菌时其表达上调，其活性可被ABA、茉莉酸（JA）等各种生物胁迫、非生物胁迫所激活，其超量表达增加了水稻对干旱胁迫的耐受性[27]。在基因的调控表达方面，自从l987年Paz-Ares等[28]首次报道玉米转录因子基因的克隆以来，相继从高等植物中分离出的调控植物干旱、高盐、低温、激素、病原胁迫反应及生长发育等相关基因表达的转录因子己达数百种[29-30]，如AP2/EREBP、bZIP、MYB和wRKY等家族，另外还有bHLH和HD同源域转录因子家族等。R2R3-MYB成员是植物中数目最多的一类MYB蛋白，它们以N-端含有MYB结构域为共同特征，参与次生代谢的调节、控制细胞的分化、应答激素刺激和环境胁迫及抵抗病原菌的侵害。例如从一种蕨类植物Craterostigma plantagineum中分离的Opm5、7、10蛋白，属于R2R3-MYB转录因子，它们参与植物对ABA和干旱的响应，R2R3-MYB转录因子是植物苯丙烷类次生代谢的主要调控者，该代谢所生成的许多次生代谢物广泛参与了植物对逆境的反应[31]。植物抗逆性的分子调节机制涉及胁迫信号的感受，细胞内第二信使（Ca2+、活性氧类ROS、磷酸甘油、ABA、二酰甘油等）的产生与介导下游的蛋白质磷酸化串联物（如CDPK、SOS/PKS、MAPK等）的磷酸化反应，这些蛋白质磷酸化串联物对下游一系列转录因子（EREBP/AP2、bZIP等）的激活，以及这些转录因子对胁迫应答靶基因的调控等多方面，是一项极其复杂的系统工程。目前对于陆稻抗逆性的分子机制还不完全清楚，有待进一步的深入研究。
栽培稻作为世界上最重要的粮食作物，养活了世界上超过半数的人口；同时栽培稻也是中国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。稻瘟病是中国稻区和世界其它稻区最为严重的病害之一，其发生历史悠久、分布广泛、危害严重；流行年份可减产10%～20%，严重时可减产40%～50%，甚至绝收。预防稻瘟病的综合策略有：首先选择抗稻瘟病较强的品种进行种植；其次运用水稻品种多样性防治稻瘟病技术控制稻瘟病的发生和流行；最后辅以化学农药防治措施。由此可以看出，筛选具有较高抗瘟能力的稻种资源是有效防治稻瘟病流行与发生的重要基础。由于世界性的水资源短缺，干旱是影响栽培稻生产最主要的障碍之一，提高栽培稻品种的抗旱性和准确地鉴定品种的抗旱性，成为育种家们关注的重要课题。单纯考虑产量或单一抗性的育种策略，必将导致育成的新品种具有其它某种缺陷，致使后期的推广应用面临困难。本研究结果表明，供试陆稻品种在面临生物与非生物胁迫时，在抗性表现上具有相似性。这就使得育种过程中培育兼具较好抗瘟、抗旱能力的栽培稻新品种成为可能。在一种抗性的育种过程中，兼顾其它抗性的选育；或是直接培育具有复合抗性的作物新品种，成为未来新品种选育过程中的新趋势。
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责任编辑：黄东杰
关键词 陆稻；稻瘟病抗性；抗旱性；SSR分子标记
中图分类号 S332.1 文献标识码 A
植物对逆境的抵抗和耐受能力称之为抗逆性，即植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应性，这些不良环境包括干旱、高温、盐胁迫、低温、病原物入侵等多种形式[1-3]。植物在整个生命周期中，一直处于变化着的环境中。适宜的环境条件能保证植物正常的生长发育，而不适宜的生物或非生物逆境条件则会抑制植物的生长，甚至使植物死亡。稻瘟病是世界水稻生产最具有毁灭性的病害之一。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）生理小种的多样性、致病力的多样性和极易变异性是稻瘟病难以控制的主要原因[4-7]。干旱是植物生长和农作物产量影响最为明显的非生物逆境环境因子之一，由此产生的非生物胁迫是引起全球粮食作物减产的重要原因，从而造成了许多重要粮食作物大量减产[8]。 陆稻具有较好的抗稻瘟病能力， 张启星等[9]对河北省地方陆稻品种的抗病性研究后发现，陆稻品种在抗稻瘟病频度和强度上均高于当地水稻品种。近年来，国内外学者对陆稻抗旱性研究主要集中在水分胁迫对陆稻植株的伤害机理[10-12]、陆稻抗旱的生理生化机制[13]、抗旱性鉴定方法与指标上[14]，而在涉及抗旱性状相关的基因工程研究及抗旱性遗传与育种研究上则刚刚起步。
本研究以云南陆稻品种为材料，通过对供试品种进行苗期稻瘟病抗性鉴定、早期抗旱性评价与遗传多样性分析，试图探讨云南陆稻品种抗病性、抗旱性与遗传多样性三者之间的关系，以期能为陆稻抗逆性研究及优良亲本的选育提供一定的帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物 本实验所用的植物来源于云南省5个州/市、10个县/区的30个陆稻品种，其品种名称、来源详见表1。
1.1.2 供试菌株 选用近年来云南省稻区稻瘟病菌优势小种为致病菌株：1个小种（ZB15）来自籼稻区，3个小种（ZD3、ZE1和ZE3）来自粳稻区。
1.2 方法
1.2.1 稻瘟病抗性鉴定 供试品种先浸种24 h，再用2%的福尔马林（40%的甲醛溶液）消毒2 h，然后用自来水冲洗干净，于35 ℃的温度条件下进行催芽，露白后播种于育种盆内，每盆种5个陆稻品种和1个感病对照品种（丽江新团黑谷），每穴种15粒左右，每个处理设3个重复。在温室中育苗，稻苗长至四叶一心时，采用人工接种法对供试品种进行稻瘟病抗性鉴定。
选用混合菌株进行接种。产孢培养2～3 d后，用0.2%吐温20（Tween20）溶液将病菌孢子从培养皿表面冲洗入烧杯内，配置成混合孢子悬浮液（浓度为106孢子/mL），菌液浓度为100倍显微镜下30～50个孢子/视野。用空气压缩机连接喷雾器在接种箱中喷雾接种，接种后黑暗保湿24 h，辅以喷水保湿，促进病害的发生。接种后7～10 d观察记载发病情况，待感病对照品种的病情达9级时，按中华人民共和国农业部行业标准（2003）调查记载病情（表2）[15]。
1.2.2 抗旱性鉴定 在直径为90 mm的培养皿底部垫上圆形滤纸，每皿放50粒种子，再加PEG溶液20 mL，加液盖好后置28 ℃左右发芽，PEG溶液设置0%、15% 2个水平，设置3个重复，5 d后测量其相对幼芽粗度（Relative germ roughness， RGR）、相对幼根长度（Relative radicle length， RRL）和相对幼根粗度（Relative radicle roughness， RRR）。
1.2.3 遗传多样性分析 ①陆稻基因组DNA的提取：陆稻幼苗长到三叶一心期剪取叶片，利用CTAB法[16]提取每个品种的10个单株的全基因组DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。加入去离子双蒸水稀释至25 ng/μL，于-20 ℃下保存备用。
②SSR-PCR的扩增：选取均匀分布在水稻12条染色体上的24对多态性高、条带清晰、稳定性好的引物对供试品种进行SSR-PCR扩增。20 μL反应体系包括：1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.68 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L的SSR引物，25 ng DNA模板及1 U Taq酶。反应程序为：95 ℃预变性 5 min；然后94 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，42个循环；最后72 ℃延伸10 min，产物于4 ℃保存备用，反应在Eppendorf PCR扩增仪上进行。PCR产物进行6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定电压100 V，电泳2.5 h，经银染、显影后，拍照贮存备用[17-18]。
1.3 数据处理
1.3.1 抗旱性数据分析 相对值=胁迫测定值/对照测定值，陆稻抗旱性评价方法采用抗旱性隶属函数法[19]。
Xij=
式中Xij为i品种j性状值，Xmin为j性状中最小值，Xmax为j性状中最大值，Xij为i品种j性状的抗旱隶属值。然后将品种所有性状的抗旱隶属值进行累加，求其平均数。
Xi=Xij
式中Xi是i品种的抗旱隶属函数值，Xi大的抗旱性强，并规定抗旱程度的指标值为：当Xi≥0.80为强抗，0.50
2.1 陆稻品种人工接种的测定
2.2 抗旱性鉴定
1个、中抗品种5个、低抗品种4个，红河州拥有中抗品种1个。
2.3 遗传多样性分析
30个陆稻品种间也存在相当大的遗传多样性变异，其中Ne的变化幅度为0.099 6～1.462 2，平均Ne为1.097 5；I的变化幅度为0.000 0～0.396 8，平均I为0.128 2；Ho的变化幅度为0.000 0～0.034 8，平均Ho为0.002 8；He变化幅度为0.000 0～0.258 1，平均He为0.081 8；H的变幅为0.000～0.245 2，平均H为0.077 8（表4）。
2.4 相关性分析
3 讨论与结论
物种遗传多样性丰富、群体稳定、抗逆性和抗病性较强[22]。而本研究结果却显示供试陆稻品种的遗传多样性与稻瘟病抗性和抗旱性之间无显著相关性，究其原因可能是本研究所选用的SSR标记为中性标记，反映的是基因组背景上的多态性，与功能基因多不连锁，即与表型不直接相关[23]。植物表现抗逆性是环境、植物自身和胁迫条件相互作用的结果，而SSR分子标记只是基因组中的一些片段，难以反映其抗性表现的全貌。
本研究供试品种的病害级别与抗旱隶属函数值之间却存在一个极显著的负相关关系，表明抗病能力越强的品种，在干旱胁迫下越能够表现出更好的抗旱能力。此现象的原因可能是因为植物在承受各种逆境胁迫条件时，存在某些共同的分子调节机制。例如在胁迫信号的感应和转导方面，脱落酸（Absicisic acid，ABA）是一种小分子亲脂性的植物激素，具有调节植物发育、种子休眠、发芽、细胞分裂和在细胞水平上具有对干旱、寒冷、盐碱、病害和紫外辐射等环境胁迫的响应能力[24-25]；促分裂原激活蛋白激酶（MAPK）级联信号通路在抵抗植物的非生物和生物胁迫中也都发挥了重要的作用，大量的研究表明激素、非生物胁迫、病原物、病原物激发子在发育的特定阶都能激活植物中的MAPK途径[26]，水稻中OsMAPK5a在接种稻瘟病病菌时其表达上调，其活性可被ABA、茉莉酸（JA）等各种生物胁迫、非生物胁迫所激活，其超量表达增加了水稻对干旱胁迫的耐受性[27]。在基因的调控表达方面，自从l987年Paz-Ares等[28]首次报道玉米转录因子基因的克隆以来，相继从高等植物中分离出的调控植物干旱、高盐、低温、激素、病原胁迫反应及生长发育等相关基因表达的转录因子己达数百种[29-30]，如AP2/EREBP、bZIP、MYB和wRKY等家族，另外还有bHLH和HD同源域转录因子家族等。R2R3-MYB成员是植物中数目最多的一类MYB蛋白，它们以N-端含有MYB结构域为共同特征，参与次生代谢的调节、控制细胞的分化、应答激素刺激和环境胁迫及抵抗病原菌的侵害。例如从一种蕨类植物Craterostigma plantagineum中分离的Opm5、7、10蛋白，属于R2R3-MYB转录因子，它们参与植物对ABA和干旱的响应，R2R3-MYB转录因子是植物苯丙烷类次生代谢的主要调控者，该代谢所生成的许多次生代谢物广泛参与了植物对逆境的反应[31]。植物抗逆性的分子调节机制涉及胁迫信号的感受，细胞内第二信使（Ca2+、活性氧类ROS、磷酸甘油、ABA、二酰甘油等）的产生与介导下游的蛋白质磷酸化串联物（如CDPK、SOS/PKS、MAPK等）的磷酸化反应，这些蛋白质磷酸化串联物对下游一系列转录因子（EREBP/AP2、bZIP等）的激活，以及这些转录因子对胁迫应答靶基因的调控等多方面，是一项极其复杂的系统工程。目前对于陆稻抗逆性的分子机制还不完全清楚，有待进一步的深入研究。
栽培稻作为世界上最重要的粮食作物，养活了世界上超过半数的人口；同时栽培稻也是中国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。稻瘟病是中国稻区和世界其它稻区最为严重的病害之一，其发生历史悠久、分布广泛、危害严重；流行年份可减产10%～20%，严重时可减产40%～50%，甚至绝收。预防稻瘟病的综合策略有：首先选择抗稻瘟病较强的品种进行种植；其次运用水稻品种多样性防治稻瘟病技术控制稻瘟病的发生和流行；最后辅以化学农药防治措施。由此可以看出，筛选具有较高抗瘟能力的稻种资源是有效防治稻瘟病流行与发生的重要基础。由于世界性的水资源短缺，干旱是影响栽培稻生产最主要的障碍之一，提高栽培稻品种的抗旱性和准确地鉴定品种的抗旱性，成为育种家们关注的重要课题。单纯考虑产量或单一抗性的育种策略，必将导致育成的新品种具有其它某种缺陷，致使后期的推广应用面临困难。本研究结果表明，供试陆稻品种在面临生物与非生物胁迫时，在抗性表现上具有相似性。这就使得育种过程中培育兼具较好抗瘟、抗旱能力的栽培稻新品种成为可能。在一种抗性的育种过程中，兼顾其它抗性的选育；或是直接培育具有复合抗性的作物新品种，成为未来新品种选育过程中的新趋势。
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责任编辑：黄东杰