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摘 要： 水蛭素（Hirudin）是水蛭唾液腺分泌物中的一种蛋白，是迄今为止发现的最强的天然凝血酶特效抑制剂，具有活血化淤的作用。但水蛭軀体中存在无抗凝活性的伪水蛭素组分和分泌物中大量成分复杂的物质，增加了水蛭素分离纯化难度；临床运用对生物制品的纯度要求高，世界各地很多科学家对水蛭素的提取和纯化做了许多相关的研究。本文对水蛭素分离纯化方法进行了综述，比较了多种方法的优势与不足，为其分离纯化工艺的进一步优化提供参考。
关键词： 水蛭素；分离；纯化；
【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 2236-1879（2018）11-0256-01
水蛭是传统的中药材，早在《神农本草经》就有记载，具有破血、逐淤、通经的功效。 水蛭中有效成分为水蛭素，是目前已知的一种高效的、特异的、最强的凝血酶抑制剂水蛭素具有抗凝血和溶解血栓的作用，在治疗心脑血管疾病、动脉粥样硬化、败血休克、高血压及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的优越性和广阔的应用前景。
1水蛭素的理化性质
水蛭素干燥状态下稳定，室温下水中可稳定存在6个月，80℃下加热15min而不被破坏。PH值升高或降低均会导致稳定性下降，在0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15min。水蛭素不能被胰蛋白酶水解，对α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，其原因在于水蛭素存在一个由3个二硫键组成的不易被降解的N-端结构。但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
2 水蛭素的分离与纯化
2.1. 天然水蛭素的分离与纯化。
天然水蛭素产生于水蛭的唾液里， 水蛭吸血时被分泌出来。杨潼等使水蛭充分饥饿，采取一种特殊的技术从活体水蛭中提取唾液腺分泌物。黄仁槐等采取挤压的方法获取水蛭嗦囊内消化液。这些方式可以获得活性很高的粗体液，但是处理较为繁琐，效率很低。大多数研究均摘取水蛭头部进行匀浆处理，用丙酮、 乙醇或水提取。刘欣[1]等采用乙醇提取的方法，进行水蛭素提取，以水蛭素体积活力为指标，优化乙醇提取的条件。刘洋等利用丙酮对医用水蛭匀浆液进行提取水蛭素粗品[2]，张彬等采用盐浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法进行粗提，结果表明，丙酮提取具有更高的得率[3]。丙酮沉淀法必须严格控制温度，否则很容易造成水蛭素失活。覃裕永[4]使用乙醇和丙酮分次提取，真空回收溶剂后合并滤液进行真空冷冻干燥，发明工艺简单、成本低廉，收率较高、产品质量好、保存期长。目前研究水蛭素分离纯化的方法很多，主要涉及到粗提纯和精制两个步骤。
2.1.1粗提
2.1.1.1 PH沉淀法：将水蛭素粗提液25 m L加入四倍体积即100mL 0.9%的Na Cl溶液稀释，搅拌20min：用15%的三氯醋酸溶液调p H值至2.5，于66.7℃保温30 min（适当搅拌）后，4℃5×103r/min离心15min，收集上清液；再用l mol/L NaOH调pH值至7.0，4℃ 5x103r/min离心10rain，上清液即为粗提液，分别测定蛋白质含量和水蛭素活性，同时计算蛋白质回收率、活性回收率、纯化倍数和比活。得蛋白质回收率为45.58%，活性回收率为55.55%，纯化倍数为1.22，比活为6.41 AT-U/rag，得到的水蛭素粗提液虽然比较澄清，但其纯化倍数相对而言较低，原因可能是这种方法采用加入较大体积的Na Cl溶液，提供一个温和的环境造成的溶液过稀，造成需要进一步的处理才能得到更好的浓度；
2.1.1.2有机溶剂沉淀法：取水蛭素唾液腺分泌物10 m L，用4倍体积即40 m L含水15%的冷丙酮溶液沉淀（含水15%的冷丙酮溶液预先配制好，放冰箱中预冷保存）用玻璃棒轻轻搅拌冷丙酮溶液和水蛭素唾液腺分泌物的混合物，存放在冰箱中过夜。将混合物在5x103 r/min下离心15min，滤去上清液部分，收集沉淀，然后用15%的20 m L三氯乙酸溶液溶解，再次在5x103r/rain下离心5 rain，去除不溶解的物质，收集上清液，分别测定蛋白质含量和水蛭素活性，同时计算蛋白质回收率、活性回收率、纯化倍数和比活。得蛋白质回收率为18.70%，活性回收率为33.34%，纯化倍数为1.78，比活为4.71AT-U/mg，通过添加丙酮来达到沉淀的目的，但是同时给测定活性造成的了很大的困难，要求低温操作使操作过程容易引起目标蛋自失活；
2.1.2 精制
2.1.2.1离子交换层析法：用磷酸盐缓冲液平衡离子交换层析柱，取10ml粗提液进样，用起始缓冲液充分流洗，再以0—1.0 mol/L Na Cl梯度洗脱，收集速度为10 min/管， ，自动收集后，每隔3管（O.5 h）测定活性一次，根据所测的结果，收集活性峰，经透析浓缩后再测定活性峰的蛋白质含量和活性。
结果表明，利用DEAE SephadexA-50和DEAESepharoseCL-6B树脂对水蛭素粗提液进行离子交换层析，经过DEAE Sephadex A一50柱层析得到的水蛭素比活性仅达到15.9AT-U/mg水蛭素，纯化倍数不到3，同时回收率也不高；但是经过DEAE Sepharosc CL-6B柱层析所得到的水蛭素比活性能达到100AT-U/mg水蛭素以上，纯化倍数也接近20，活性回收率较高。可知DEAE Sepharose CL-6B柱层析的分离效果和产物理想程度比DEAESephadexA-50柱层析要好。
2.1.2.2凝胶过滤层析法：经DEAE Sepharose CL-6B柱层析后的水蛭素溶液3mL上样，经Sephadex G.25柱层析后，收集有效峰后，经浓缩再测定其蛋白质含量和活性。用此法进行脱盐，效果最好，规律性较强，同时随着洗脱速度的增加，所需的洗脱时间越来越短。用30 m L/h的流速进行脱盐的效果最好，其收集液比活为1017AT-U/mg，蛋白质回收率为7.22%，活性回收率为63%，纯化倍数为8.73。
参考文献
[1] 刘欣， 张文清， 夏玮，等. 提取水蛭有效成分初探[J]. 中成药， 2002， 24（11）：894-895.
[2] 刘洋， 崔红. 水蛭素的分离与纯化[J]. 牡丹江医学院学报， 2004， 25（2）：35-36.
[3] 张彬， 汪波， 龚元，等. 几种水蛭抗凝血物质提取及活性分析[J]. 中山大学学报（自然科学版）， 2012， 51（4）：92-96.
[4] 覃裕永. 一种天然水蛭素有效成分的提取方法： CN， CN 101108879 A[P]. 2008.
关键词： 水蛭素；分离；纯化；
【中图分类号】 R285.5 【文献标识码】 A 【文章编号】 2236-1879（2018）11-0256-01
水蛭是传统的中药材，早在《神农本草经》就有记载，具有破血、逐淤、通经的功效。 水蛭中有效成分为水蛭素，是目前已知的一种高效的、特异的、最强的凝血酶抑制剂水蛭素具有抗凝血和溶解血栓的作用，在治疗心脑血管疾病、动脉粥样硬化、败血休克、高血压及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的优越性和广阔的应用前景。
1水蛭素的理化性质
水蛭素干燥状态下稳定，室温下水中可稳定存在6个月，80℃下加热15min而不被破坏。PH值升高或降低均会导致稳定性下降，在0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15min。水蛭素不能被胰蛋白酶水解，对α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，其原因在于水蛭素存在一个由3个二硫键组成的不易被降解的N-端结构。但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性。
2 水蛭素的分离与纯化
2.1. 天然水蛭素的分离与纯化。
天然水蛭素产生于水蛭的唾液里， 水蛭吸血时被分泌出来。杨潼等使水蛭充分饥饿，采取一种特殊的技术从活体水蛭中提取唾液腺分泌物。黄仁槐等采取挤压的方法获取水蛭嗦囊内消化液。这些方式可以获得活性很高的粗体液，但是处理较为繁琐，效率很低。大多数研究均摘取水蛭头部进行匀浆处理，用丙酮、 乙醇或水提取。刘欣[1]等采用乙醇提取的方法，进行水蛭素提取，以水蛭素体积活力为指标，优化乙醇提取的条件。刘洋等利用丙酮对医用水蛭匀浆液进行提取水蛭素粗品[2]，张彬等采用盐浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法进行粗提，结果表明，丙酮提取具有更高的得率[3]。丙酮沉淀法必须严格控制温度，否则很容易造成水蛭素失活。覃裕永[4]使用乙醇和丙酮分次提取，真空回收溶剂后合并滤液进行真空冷冻干燥，发明工艺简单、成本低廉，收率较高、产品质量好、保存期长。目前研究水蛭素分离纯化的方法很多，主要涉及到粗提纯和精制两个步骤。
2.1.1粗提
2.1.1.1 PH沉淀法：将水蛭素粗提液25 m L加入四倍体积即100mL 0.9%的Na Cl溶液稀释，搅拌20min：用15%的三氯醋酸溶液调p H值至2.5，于66.7℃保温30 min（适当搅拌）后，4℃5×103r/min离心15min，收集上清液；再用l mol/L NaOH调pH值至7.0，4℃ 5x103r/min离心10rain，上清液即为粗提液，分别测定蛋白质含量和水蛭素活性，同时计算蛋白质回收率、活性回收率、纯化倍数和比活。得蛋白质回收率为45.58%，活性回收率为55.55%，纯化倍数为1.22，比活为6.41 AT-U/rag，得到的水蛭素粗提液虽然比较澄清，但其纯化倍数相对而言较低，原因可能是这种方法采用加入较大体积的Na Cl溶液，提供一个温和的环境造成的溶液过稀，造成需要进一步的处理才能得到更好的浓度；
2.1.1.2有机溶剂沉淀法：取水蛭素唾液腺分泌物10 m L，用4倍体积即40 m L含水15%的冷丙酮溶液沉淀（含水15%的冷丙酮溶液预先配制好，放冰箱中预冷保存）用玻璃棒轻轻搅拌冷丙酮溶液和水蛭素唾液腺分泌物的混合物，存放在冰箱中过夜。将混合物在5x103 r/min下离心15min，滤去上清液部分，收集沉淀，然后用15%的20 m L三氯乙酸溶液溶解，再次在5x103r/rain下离心5 rain，去除不溶解的物质，收集上清液，分别测定蛋白质含量和水蛭素活性，同时计算蛋白质回收率、活性回收率、纯化倍数和比活。得蛋白质回收率为18.70%，活性回收率为33.34%，纯化倍数为1.78，比活为4.71AT-U/mg，通过添加丙酮来达到沉淀的目的，但是同时给测定活性造成的了很大的困难，要求低温操作使操作过程容易引起目标蛋自失活；
2.1.2 精制
2.1.2.1离子交换层析法：用磷酸盐缓冲液平衡离子交换层析柱，取10ml粗提液进样，用起始缓冲液充分流洗，再以0—1.0 mol/L Na Cl梯度洗脱，收集速度为10 min/管， ，自动收集后，每隔3管（O.5 h）测定活性一次，根据所测的结果，收集活性峰，经透析浓缩后再测定活性峰的蛋白质含量和活性。
结果表明，利用DEAE SephadexA-50和DEAESepharoseCL-6B树脂对水蛭素粗提液进行离子交换层析，经过DEAE Sephadex A一50柱层析得到的水蛭素比活性仅达到15.9AT-U/mg水蛭素，纯化倍数不到3，同时回收率也不高；但是经过DEAE Sepharosc CL-6B柱层析所得到的水蛭素比活性能达到100AT-U/mg水蛭素以上，纯化倍数也接近20，活性回收率较高。可知DEAE Sepharose CL-6B柱层析的分离效果和产物理想程度比DEAESephadexA-50柱层析要好。
2.1.2.2凝胶过滤层析法：经DEAE Sepharose CL-6B柱层析后的水蛭素溶液3mL上样，经Sephadex G.25柱层析后，收集有效峰后，经浓缩再测定其蛋白质含量和活性。用此法进行脱盐，效果最好，规律性较强，同时随着洗脱速度的增加，所需的洗脱时间越来越短。用30 m L/h的流速进行脱盐的效果最好，其收集液比活为1017AT-U/mg，蛋白质回收率为7.22%，活性回收率为63%，纯化倍数为8.73。
参考文献
[1] 刘欣， 张文清， 夏玮，等. 提取水蛭有效成分初探[J]. 中成药， 2002， 24（11）：894-895.
[2] 刘洋， 崔红. 水蛭素的分离与纯化[J]. 牡丹江医学院学报， 2004， 25（2）：35-36.
[3] 张彬， 汪波， 龚元，等. 几种水蛭抗凝血物质提取及活性分析[J]. 中山大学学报（自然科学版）， 2012， 51（4）：92-96.
[4] 覃裕永. 一种天然水蛭素有效成分的提取方法： CN， CN 101108879 A[P]. 2008.