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摘 要：以玉米（Zea mays L.）自交系H99、丹988、丹598的胚性愈傷组织为材料，利用农杆菌介导的方法将带有pCAMBIA1301-BADH抗盐碱基因转入供试品种的胚性愈伤中，通过愈伤组织对盐（NaCl）的敏感性试验，确定愈伤组织适宜选择压，同时研究了2，4-D浓度对筛选结果的影响。结果表明，玉米自交系H99在盐筛培养基中NaCl浓度为200 mmol/L，2，4-D浓度为1.0 mg/L时筛选结果最佳。对移栽成活的48棵抗盐转pCAMBIA1301-BADH基因植株，经PCR检测有3株呈阳性，阳性株率达到6.3%，初步证明目的基因已整合到玉米基因组中。
关键词：玉米（Zea mays L.）;愈伤组织;耐盐性;筛选;NaCl
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 外植体 采用玉米自交系H99、丹988、丹598的胚性愈伤组织作为遗传转化的受体进行转化，3份材料由吉林农业大学植物生物技术中心实验室提供。
1.1.2 菌种、质粒 农杆菌菌株EHA105、质粒pCAMBIA1301-BADH，均由吉林农业大学植物生物技术中心实验室保存。
1.1.3 培养基
1）基本培养基：N6培养基。
2）诱导培养基：N6培养基+700 mg/L L-脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+2 mg/L 2，4-D。
3）继代培养基：N6培养基+1.0 mg/L 2，4-D。
4）筛选培养基：N6培养基+不同浓度2，4-D+不同浓度NaCl。
以上培养基中均含4%蔗糖和0.8%琼脂，pH 5.8。
1.2 试验方法
1.2.1 培养材料的处理 取经人工套袋授粉10～15 d的饱满且无病虫害的玉米雌幼穗扒去最外层数片苞叶，留3～5个苞叶，切取雌果穗头部无子粒部分，用75%乙醇浸泡10 min，扒去所有苞叶及花丝后再用50%的次氯酸钠溶液浸泡15～20 min，然后将果穗置于超净工作台上，用无菌水冲洗3～4次，并削去中部子粒的上面1/3胚乳，用解剖针挑出大小约1.5～2.0 mm的幼胚。
1.2.2 玉米幼胚愈伤组织的诱导和继代 取剥离玉米穗中部子粒的幼胚，将盾片向上接种于诱导培养基上。分别将H99、丹988、丹598玉米自交系的玉米幼胚接种到20个皿中，每个培养皿中接种30个盾片，从诱导出的愈伤组织中挑选不透明、淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织夹碎到2～3 mm大小，每皿接种30块，视各基因型产生的愈伤组织质量的差异，扩繁的数量也不同，以满足后续试验需求为宜。每15 d继代1次，共继代4次。
1.2.3 农杆菌转化 将愈伤组织进行预培养，并用含有质粒pCAMBIA1301-BADH的农杆菌菌株划板于YEP固态培养基（含1 mg/L Kan）中培养，挑单菌落接种于5 mL YEP液态培养基（含1 mg/L Kan）中，28 ℃振荡过夜培养，隔天放入50 mL YEP液态培养基中至其对数生长期OD值为0.5～0.6，离心收集菌体将其重悬于侵染液中备用，将预培养愈伤组织置于重悬后的菌液中，浸泡25 min，轻摇振荡，倒掉菌液，将外植体放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干愈伤组织表面多余的菌液，然后转入共培养培养基（含200 μg/L As），黑暗条件下培养3 d。
1.2.4 盐胁迫培养 将诱导培养基上获得的3个品种H99、丹988、丹598的胚性愈伤组织接种到不同浓度的盐胁迫筛选培养基上，NaCl浓度梯度依次为0、50、100、150、175、200、250、275、300 mmol/L，2，4-D浓度梯度依次为0、1.0、2.0、3.0 mg/L，每个梯度设置3次重复。以不添加NaCl和2，4-D的培养基为对照，20 d后及时统计愈伤组织存活率。根据愈伤组织存活率，确定愈伤组织最适宜的选择压。将筛选后的愈伤组织转至分化培养基，分化出的苗转至生根培养基[11]。
愈伤组织存活率=存活的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数×100%。
1.3 PCR检测
取抗性植株的叶片按照CTAB方法提取植物基因组DNA，进行PCR检测。反应体系为25 μL。扩增反应参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性55 s，退火50 ℃ 55 s，72 ℃延伸55 s，72 ℃后延伸10 min，35个循环。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪分析。
2 结果与分析
2.1 不同NaCl浓度对玉米自交系筛选结果的影响
用玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈伤组织进行耐盐性研究，观察统计各处理愈伤组织成活情况，用愈伤组织成活率分析玉米愈伤组织的耐盐性敏感浓度，结果见图1。由图1可知，随着培养基中NaCl浓度的升高，各基因型的愈伤组织存活率明显下降，当NaCl浓度达到300 mmol/L时，愈伤组织全部死亡;NaCl的半致死浓度稍高于175 mmol/L，对筛选结果有较明显影响;在NaCl浓度为200 mmol/L时盐筛结果最佳，这3种不同基因型玉米自交系中，H99的盐筛结果最佳。
2.2 不同2，4-D浓度对玉米自交系筛选结果的影响
如图2所示，2，4-D浓度过高或过低都会影响不同基因型玉米自交系愈伤组织在筛选培养基中的存活率，其中2，4-D浓度为1.0 mg/L时盐筛结果最佳。2，4-D浓度不同对不同基因型玉米自交系的筛选结果也不相同。由不同浓度的2，4-D对3种基因型玉米自交系愈伤组织筛选的影响可知，其对H99基因型的盐筛结果的影响最明显。
2.3 抗性植株的PCR检测
用CTAB法提取的玉米再生植株叶片DNA进行PCR扩增，转化玉米获得转BADH基因再生植株，利用BADH引物按照PCR体系进行扩增，扩增产物的电泳分析结果（图3）表明，转基因植株扩增出1 500 bp左右的特异条带，与阳性质粒作模板的PCR扩增条带大小吻合，而非转基因的对照植株则无此特异条带，初步证明BADH基因已整合到再生玉米植株中。经过筛选、分化、生根、移栽，有48株转基因植株成活，通过在大棚种植，经过PCR检测，其中阳性植株为3株，PCR阳性植株率为6.3%。
3 小结与讨论
本研究通过统计玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈伤组织在含有不同浓度NaCl及不同浓度2，4-D的筛选培养基上的愈伤存活率的情况，结果表明，当NaCl浓度为200 mmol/L，2，4-D浓度为1.0 mg/L时玉米愈伤组织存活率最高，其中H99、丹988、丹598 3种基因型中H99的愈伤组织存活率最高。转化玉米获得转BADH基因再生植株，阳性植株率达6.3%，对于其他相关因素还需进一步的分析。
参考文献
[1] 王丽燕，赵可夫. 玉米幼苗对盐胁迫的生理响应[J]. 作物学报，2005，31（2）：264-266.
[2] 王 宁.不同玉米品种苗期对盐胁迫的生物学响应及耐性机制研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2009.
关键词：玉米（Zea mays L.）;愈伤组织;耐盐性;筛选;NaCl
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 外植体 采用玉米自交系H99、丹988、丹598的胚性愈伤组织作为遗传转化的受体进行转化，3份材料由吉林农业大学植物生物技术中心实验室提供。
1.1.2 菌种、质粒 农杆菌菌株EHA105、质粒pCAMBIA1301-BADH，均由吉林农业大学植物生物技术中心实验室保存。
1.1.3 培养基
1）基本培养基：N6培养基。
2）诱导培养基：N6培养基+700 mg/L L-脯氨酸+500 mg/L水解酪蛋白+2 mg/L 2，4-D。
3）继代培养基：N6培养基+1.0 mg/L 2，4-D。
4）筛选培养基：N6培养基+不同浓度2，4-D+不同浓度NaCl。
以上培养基中均含4%蔗糖和0.8%琼脂，pH 5.8。
1.2 试验方法
1.2.1 培养材料的处理 取经人工套袋授粉10～15 d的饱满且无病虫害的玉米雌幼穗扒去最外层数片苞叶，留3～5个苞叶，切取雌果穗头部无子粒部分，用75%乙醇浸泡10 min，扒去所有苞叶及花丝后再用50%的次氯酸钠溶液浸泡15～20 min，然后将果穗置于超净工作台上，用无菌水冲洗3～4次，并削去中部子粒的上面1/3胚乳，用解剖针挑出大小约1.5～2.0 mm的幼胚。
1.2.2 玉米幼胚愈伤组织的诱导和继代 取剥离玉米穗中部子粒的幼胚，将盾片向上接种于诱导培养基上。分别将H99、丹988、丹598玉米自交系的玉米幼胚接种到20个皿中，每个培养皿中接种30个盾片，从诱导出的愈伤组织中挑选不透明、淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织夹碎到2～3 mm大小，每皿接种30块，视各基因型产生的愈伤组织质量的差异，扩繁的数量也不同，以满足后续试验需求为宜。每15 d继代1次，共继代4次。
1.2.3 农杆菌转化 将愈伤组织进行预培养，并用含有质粒pCAMBIA1301-BADH的农杆菌菌株划板于YEP固态培养基（含1 mg/L Kan）中培养，挑单菌落接种于5 mL YEP液态培养基（含1 mg/L Kan）中，28 ℃振荡过夜培养，隔天放入50 mL YEP液态培养基中至其对数生长期OD值为0.5～0.6，离心收集菌体将其重悬于侵染液中备用，将预培养愈伤组织置于重悬后的菌液中，浸泡25 min，轻摇振荡，倒掉菌液，将外植体放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干愈伤组织表面多余的菌液，然后转入共培养培养基（含200 μg/L As），黑暗条件下培养3 d。
1.2.4 盐胁迫培养 将诱导培养基上获得的3个品种H99、丹988、丹598的胚性愈伤组织接种到不同浓度的盐胁迫筛选培养基上，NaCl浓度梯度依次为0、50、100、150、175、200、250、275、300 mmol/L，2，4-D浓度梯度依次为0、1.0、2.0、3.0 mg/L，每个梯度设置3次重复。以不添加NaCl和2，4-D的培养基为对照，20 d后及时统计愈伤组织存活率。根据愈伤组织存活率，确定愈伤组织最适宜的选择压。将筛选后的愈伤组织转至分化培养基，分化出的苗转至生根培养基[11]。
愈伤组织存活率=存活的愈伤组织块数/接种的愈伤组织块数×100%。
1.3 PCR检测
取抗性植株的叶片按照CTAB方法提取植物基因组DNA，进行PCR检测。反应体系为25 μL。扩增反应参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性55 s，退火50 ℃ 55 s，72 ℃延伸55 s，72 ℃后延伸10 min，35个循环。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪分析。
2 结果与分析
2.1 不同NaCl浓度对玉米自交系筛选结果的影响
用玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈伤组织进行耐盐性研究，观察统计各处理愈伤组织成活情况，用愈伤组织成活率分析玉米愈伤组织的耐盐性敏感浓度，结果见图1。由图1可知，随着培养基中NaCl浓度的升高，各基因型的愈伤组织存活率明显下降，当NaCl浓度达到300 mmol/L时，愈伤组织全部死亡;NaCl的半致死浓度稍高于175 mmol/L，对筛选结果有较明显影响;在NaCl浓度为200 mmol/L时盐筛结果最佳，这3种不同基因型玉米自交系中，H99的盐筛结果最佳。
2.2 不同2，4-D浓度对玉米自交系筛选结果的影响
如图2所示，2，4-D浓度过高或过低都会影响不同基因型玉米自交系愈伤组织在筛选培养基中的存活率，其中2，4-D浓度为1.0 mg/L时盐筛结果最佳。2，4-D浓度不同对不同基因型玉米自交系的筛选结果也不相同。由不同浓度的2，4-D对3种基因型玉米自交系愈伤组织筛选的影响可知，其对H99基因型的盐筛结果的影响最明显。
2.3 抗性植株的PCR检测
用CTAB法提取的玉米再生植株叶片DNA进行PCR扩增，转化玉米获得转BADH基因再生植株，利用BADH引物按照PCR体系进行扩增，扩增产物的电泳分析结果（图3）表明，转基因植株扩增出1 500 bp左右的特异条带，与阳性质粒作模板的PCR扩增条带大小吻合，而非转基因的对照植株则无此特异条带，初步证明BADH基因已整合到再生玉米植株中。经过筛选、分化、生根、移栽，有48株转基因植株成活，通过在大棚种植，经过PCR检测，其中阳性植株为3株，PCR阳性植株率为6.3%。
3 小结与讨论
本研究通过统计玉米自交系H99、丹988、丹598胚性愈伤组织在含有不同浓度NaCl及不同浓度2，4-D的筛选培养基上的愈伤存活率的情况，结果表明，当NaCl浓度为200 mmol/L，2，4-D浓度为1.0 mg/L时玉米愈伤组织存活率最高，其中H99、丹988、丹598 3种基因型中H99的愈伤组织存活率最高。转化玉米获得转BADH基因再生植株，阳性植株率达6.3%，对于其他相关因素还需进一步的分析。
参考文献
[1] 王丽燕，赵可夫. 玉米幼苗对盐胁迫的生理响应[J]. 作物学报，2005，31（2）：264-266.
[2] 王 宁.不同玉米品种苗期对盐胁迫的生物学响应及耐性机制研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2009.