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基金项目：浙江省高等教育课堂教学改革研究项目kg20160123浙江理工大学教改项目kg201611。
摘 要： 基因敲除是生物学研究常用的研究技术。作为一个多学科的综合实验，其涉及生物化学、分子生物学、微生物学、遗传学与基因工程等相关学科的知识。在学生中引入多学科综合实验，有助于学生更好地掌握理论知识并激发其科研兴趣，又能有效地培养科学思维。在开展本教学实验后，大部分学生都能完成实验任务，成功地敲除目的基因，并观察到突变菌株表型的变化。对学生的调查反馈显示多数学生通过此实验取得不同的收获。
关键词： 多学科综合实验， 重叠PCR， In-Fusion连接， 基因敲除
【中图分类号】 R319 【文献标识码】 A 【文章编号】 2236-1879（2018）06-0027-02
随着生物学本身的发展，不同学科之间相互渗透，不同课程的之间联系日益紧密。而当前依附于单学科的教学，不利于培养学生的综合分析能力。因此迫切需要打破学科之间限制以建立多学科综合的系统实验教学体系。针对传统教学体系的不足，我们在前期广泛调研的基础上，针對学生现有的专业基础和经验，设计相应的基因敲除实验课程。
实验通过三亲接合的方式进行基因敲除，在平板时菌落形态从野生菌株的粘性表型突变为非粘性表型，非常直观有助于学生快速判断实验成功与否。在具体实验设计时，注意新的实验技术的引入，尤其单学科较少涉及的技术。比如，上下游同源片段的克隆与连接分别采用普通PCR与重叠PCR相结合的技术；构建质粒时，既介绍了常规的酶切实验，同时又引入In-fusion克隆连接技术[1]。通过在多学科综合实验中新的实验方案及实验技术的介绍，希望有效提高学生的综合实践能力。
1 S. elodea引物糖基转移酶基因gelB敲除实验的操作步骤
1.1 pLO3-gelB基因敲除质粒的构建。
1.1.1 PCR扩增gelB基因上下游片段。
根据少动鞘氨醇单胞菌S. elodea基因组的序列信息，设计上下游同源片段的扩增引物，引物序列如下：gelB-F1：5'- TCGAGCTCGGTACCCGGGCGTTTGCGATCATCACTAGTTG G-3'；gelB-R1：5'- GCCTGTCGCTGCTGCGCGGCGGCAGCGCGGTTCCGCCGCCTGC CTCGT CGGGCTCCCT -3'；gelB-F2：5'- GTCAGCGTGCACAAACCGTTGAGGGAGCCCGA CGAGGC AGGCGGCGGAACCGCGCT -3'；gelB-R2：5'- ATTAGCTTGCAT GCCTGCAGTCGGATTGT TGCCCA CGAAATC -3'。
用引物对分别扩增上游或下游的同源片段。20μL的反应体系中含有2μL的基因组DNA模板及2U的rTaq（其他浓度按照说明书）。反应程度如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后再72℃延伸10min。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为40mM Tris-acetate-EDTA，电泳60V，电泳时间1h。 选择目的条带割胶回收。
1.1.2引物糖基转移酶基因上下游同源序列的重叠PCR连接。
以上下游扩增片段纯化产物为共同模板，通过PCR方法将上下游片段连接。具体步骤为： gelB基因的上下游回收产物按等比例混合（只加扩增基因片段的回收产物） ， 加入相应的不含引物的其他反应物，去离子水补足至25 μL。95 °C 5 min后再经95°C 40 s、54 °C 1 min， 72 °C 2 min 扩增5 个循环，另加入25μL的反应溶液。95 °C 5 min， 95°C 40 s、54 °C 1 min， 72 °C 2 min，共 30 个循环， 72 °C 10 min。目的片段通过琼脂糖凝胶电泳、割胶回收试剂盒纯化。
1.1.3连接产物与敲除载体pLO3的 In-Fusion克隆的连接及转化。
此同源片段与敲除载体的连接pLO3不采用常规的酶切连接方式，而是采用基于同源重组酶的In-Fusion法连接[2]。其具体操作见试剂盒说明书。
1.2Δgel B基因敲除菌株的构建。
1.2.1 三亲接合。
采用三亲接合的方法将敲除载体pLO3-gel B转移至S. elodea株中。利用两次同源重组，构建基因敲除菌株。具体步骤见文献[3，4]
1.2.2 第一次交换重组子的筛选。
当pLO3-gelB载体转移至宿主菌后，分别同源臂间单交换将整个敲除质粒整合入基因组而完成第一次单交换。在上述YM抗性平板上挑取发生第一交换的重组子，接种至YM液体培养基中，于30℃200rpm培养16h，根据pLO3-gelB上的序列设计引物扩增存在于质粒上的sacB基因序列。引物序列为SacB-FW：5'-CGAACCAAAAGCCATATAAG-3'和sacB-RV：5'-AGCGAAGTGTGAGTAAGTAA-3'。PCR验证敲除载体是否整合入基因组。
1.2.3 第二次交换重组子的筛选。
将经过PCR验证确认发生第一次交换的重组子接种至YM液体培养基中30℃、200rpm培养，每隔24h转接一次，共传代5次，取菌液涂布含8%蔗糖的YM平板上，30℃，培养72h，筛选发生第二次同源重组交换的重组子。将平板影印至含有15μg/mL 四环素的YM培养基中，30℃恒培养48h，不能生长的菌株已丢失抗性标记，进一步确认为第二次交换重组子。设计引物鉴定基因缺失菌株。引物序列为5'- TCTGGGGCTGTATCTGGTC -3'和5'- TGTATTGCGATTTCTGTTTCT -3'。琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小，鉴定基因缺失菌株。 1.2.4 野生型菌株及gelB基因敲除菌株菌落形態的比较。
将野生型菌株及经PCR验证确认gelB基因敲除的菌株涂布于YM平板中，30℃，培养72h，比较两者产多糖表型的变化，包括菌落大小、菌落光滑度、是否产多糖等。
2、实验结果
2.1 各步骤的PCR结果。
学生实验中各步骤的PCR结果见图一。其中泳道5为基因敲除菌株，其染色体中除去了gelB序列，根据gelB所在染色体侧翼序列设计引物后扩增，其所得到的片段比出发菌株小，说明已经成功敲除目的基因。
2.2野生型菌株及gelB基因敲除菌株菌落形态的比较。
野生型菌株及经PCR验证确认gelB基因敲除菌株在YM平板中形态比较见图二。从图中可以直观的观察到出发菌株产生多糖，为粘性表型，而基因敲除突变菌株为非粘性表型，不能产多糖。
3 实验建议
基因组DNA抽取及质粒抽取实验中许多试剂含有苯酚或者其他有害成分，在授课过中提醒学生注意操作的规范，戴好手套并且避免有机试剂。染色液溴化乙啶是一种潜在的致癌剂，操作过程中要注意做好防护。另外，在凝聚成像系统中观察结果时，也应注意紫外光对眼睛和皮肤的损伤。同时DNA割胶回收时避免长时间紫外照射从而造成对DNA的破坏。
4、学生反馈
为了解实验设置的合理性，实验结束之后在学生中开展了实验满意度调查，结果如下：
从反馈结果来看多数学生对实验的开展感到满意，因此，本实验课程取得了预期的效果。
5、总结
多学科综合实验的开展，打破了生物学不同学科课程间的界线，改变了传统实验教学过程中各二级学科互相独立的状况。通过优化资源配置，提高教学效率，节省教学时间。开拓学生视野，提高创新设计能力及分析解决科研问题能力，为后续开展研究打下了扎实的基础。
当然，多学科教学课程刚刚开展，有些方面还有待完善和提高。首先，需要相关教育部门及学校加大对多学科实验教学的投资，增添相关的分子生物实验设备。其次，多学科实验教学对教师的要求进一步提高，需有相应的激励手段，督促教师转变传统的思维方式和工作方式。另外，对实验室的教学管理模式也提出了新的要求。
参考文献
[1] BIRD L E， RADA H， FLANAGAN J， et al. Application of In-Fusion Cloning for the Parallel Construction of E. coli Expression Vectors [M]. DNA Cloning and Assembly Methods. Springer. 2014： 209-34.
[2] BERROW N S， ALDERTON D， SAINSBURY S， et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications [J]. Nucleic Acids Res， 2007， 35（6）： e45.
[3] ZHU L， WU X， LI O， et al. Cloning and characterization of genes involved in nostoxanthin biosynthesis of Sphingomonas elodea ATCC 31461 [J]. PLoS ONE， 2012， 7（4）： e35099.
[4] ZHU L， WU X， LI O， et al. Cloning and knockout of phytoene desaturase gene in Sphingomonas elodea ATCC 31461 for economic recovery of gellan gum [J]. J Ind Microbiol Biotechnol， 2011， 38（9）： 1507-13.
摘 要： 基因敲除是生物学研究常用的研究技术。作为一个多学科的综合实验，其涉及生物化学、分子生物学、微生物学、遗传学与基因工程等相关学科的知识。在学生中引入多学科综合实验，有助于学生更好地掌握理论知识并激发其科研兴趣，又能有效地培养科学思维。在开展本教学实验后，大部分学生都能完成实验任务，成功地敲除目的基因，并观察到突变菌株表型的变化。对学生的调查反馈显示多数学生通过此实验取得不同的收获。
关键词： 多学科综合实验， 重叠PCR， In-Fusion连接， 基因敲除
【中图分类号】 R319 【文献标识码】 A 【文章编号】 2236-1879（2018）06-0027-02
随着生物学本身的发展，不同学科之间相互渗透，不同课程的之间联系日益紧密。而当前依附于单学科的教学，不利于培养学生的综合分析能力。因此迫切需要打破学科之间限制以建立多学科综合的系统实验教学体系。针对传统教学体系的不足，我们在前期广泛调研的基础上，针對学生现有的专业基础和经验，设计相应的基因敲除实验课程。
实验通过三亲接合的方式进行基因敲除，在平板时菌落形态从野生菌株的粘性表型突变为非粘性表型，非常直观有助于学生快速判断实验成功与否。在具体实验设计时，注意新的实验技术的引入，尤其单学科较少涉及的技术。比如，上下游同源片段的克隆与连接分别采用普通PCR与重叠PCR相结合的技术；构建质粒时，既介绍了常规的酶切实验，同时又引入In-fusion克隆连接技术[1]。通过在多学科综合实验中新的实验方案及实验技术的介绍，希望有效提高学生的综合实践能力。
1 S. elodea引物糖基转移酶基因gelB敲除实验的操作步骤
1.1 pLO3-gelB基因敲除质粒的构建。
1.1.1 PCR扩增gelB基因上下游片段。
根据少动鞘氨醇单胞菌S. elodea基因组的序列信息，设计上下游同源片段的扩增引物，引物序列如下：gelB-F1：5'- TCGAGCTCGGTACCCGGGCGTTTGCGATCATCACTAGTTG G-3'；gelB-R1：5'- GCCTGTCGCTGCTGCGCGGCGGCAGCGCGGTTCCGCCGCCTGC CTCGT CGGGCTCCCT -3'；gelB-F2：5'- GTCAGCGTGCACAAACCGTTGAGGGAGCCCGA CGAGGC AGGCGGCGGAACCGCGCT -3'；gelB-R2：5'- ATTAGCTTGCAT GCCTGCAGTCGGATTGT TGCCCA CGAAATC -3'。
用引物对分别扩增上游或下游的同源片段。20μL的反应体系中含有2μL的基因组DNA模板及2U的rTaq（其他浓度按照说明书）。反应程度如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后再72℃延伸10min。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为40mM Tris-acetate-EDTA，电泳60V，电泳时间1h。 选择目的条带割胶回收。
1.1.2引物糖基转移酶基因上下游同源序列的重叠PCR连接。
以上下游扩增片段纯化产物为共同模板，通过PCR方法将上下游片段连接。具体步骤为： gelB基因的上下游回收产物按等比例混合（只加扩增基因片段的回收产物） ， 加入相应的不含引物的其他反应物，去离子水补足至25 μL。95 °C 5 min后再经95°C 40 s、54 °C 1 min， 72 °C 2 min 扩增5 个循环，另加入25μL的反应溶液。95 °C 5 min， 95°C 40 s、54 °C 1 min， 72 °C 2 min，共 30 个循环， 72 °C 10 min。目的片段通过琼脂糖凝胶电泳、割胶回收试剂盒纯化。
1.1.3连接产物与敲除载体pLO3的 In-Fusion克隆的连接及转化。
此同源片段与敲除载体的连接pLO3不采用常规的酶切连接方式，而是采用基于同源重组酶的In-Fusion法连接[2]。其具体操作见试剂盒说明书。
1.2Δgel B基因敲除菌株的构建。
1.2.1 三亲接合。
采用三亲接合的方法将敲除载体pLO3-gel B转移至S. elodea株中。利用两次同源重组，构建基因敲除菌株。具体步骤见文献[3，4]
1.2.2 第一次交换重组子的筛选。
当pLO3-gelB载体转移至宿主菌后，分别同源臂间单交换将整个敲除质粒整合入基因组而完成第一次单交换。在上述YM抗性平板上挑取发生第一交换的重组子，接种至YM液体培养基中，于30℃200rpm培养16h，根据pLO3-gelB上的序列设计引物扩增存在于质粒上的sacB基因序列。引物序列为SacB-FW：5'-CGAACCAAAAGCCATATAAG-3'和sacB-RV：5'-AGCGAAGTGTGAGTAAGTAA-3'。PCR验证敲除载体是否整合入基因组。
1.2.3 第二次交换重组子的筛选。
将经过PCR验证确认发生第一次交换的重组子接种至YM液体培养基中30℃、200rpm培养，每隔24h转接一次，共传代5次，取菌液涂布含8%蔗糖的YM平板上，30℃，培养72h，筛选发生第二次同源重组交换的重组子。将平板影印至含有15μg/mL 四环素的YM培养基中，30℃恒培养48h，不能生长的菌株已丢失抗性标记，进一步确认为第二次交换重组子。设计引物鉴定基因缺失菌株。引物序列为5'- TCTGGGGCTGTATCTGGTC -3'和5'- TGTATTGCGATTTCTGTTTCT -3'。琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小，鉴定基因缺失菌株。 1.2.4 野生型菌株及gelB基因敲除菌株菌落形態的比较。
将野生型菌株及经PCR验证确认gelB基因敲除的菌株涂布于YM平板中，30℃，培养72h，比较两者产多糖表型的变化，包括菌落大小、菌落光滑度、是否产多糖等。
2、实验结果
2.1 各步骤的PCR结果。
学生实验中各步骤的PCR结果见图一。其中泳道5为基因敲除菌株，其染色体中除去了gelB序列，根据gelB所在染色体侧翼序列设计引物后扩增，其所得到的片段比出发菌株小，说明已经成功敲除目的基因。
2.2野生型菌株及gelB基因敲除菌株菌落形态的比较。
野生型菌株及经PCR验证确认gelB基因敲除菌株在YM平板中形态比较见图二。从图中可以直观的观察到出发菌株产生多糖，为粘性表型，而基因敲除突变菌株为非粘性表型，不能产多糖。
3 实验建议
基因组DNA抽取及质粒抽取实验中许多试剂含有苯酚或者其他有害成分，在授课过中提醒学生注意操作的规范，戴好手套并且避免有机试剂。染色液溴化乙啶是一种潜在的致癌剂，操作过程中要注意做好防护。另外，在凝聚成像系统中观察结果时，也应注意紫外光对眼睛和皮肤的损伤。同时DNA割胶回收时避免长时间紫外照射从而造成对DNA的破坏。
4、学生反馈
为了解实验设置的合理性，实验结束之后在学生中开展了实验满意度调查，结果如下：
从反馈结果来看多数学生对实验的开展感到满意，因此，本实验课程取得了预期的效果。
5、总结
多学科综合实验的开展，打破了生物学不同学科课程间的界线，改变了传统实验教学过程中各二级学科互相独立的状况。通过优化资源配置，提高教学效率，节省教学时间。开拓学生视野，提高创新设计能力及分析解决科研问题能力，为后续开展研究打下了扎实的基础。
当然，多学科教学课程刚刚开展，有些方面还有待完善和提高。首先，需要相关教育部门及学校加大对多学科实验教学的投资，增添相关的分子生物实验设备。其次，多学科实验教学对教师的要求进一步提高，需有相应的激励手段，督促教师转变传统的思维方式和工作方式。另外，对实验室的教学管理模式也提出了新的要求。
参考文献
[1] BIRD L E， RADA H， FLANAGAN J， et al. Application of In-Fusion Cloning for the Parallel Construction of E. coli Expression Vectors [M]. DNA Cloning and Assembly Methods. Springer. 2014： 209-34.
[2] BERROW N S， ALDERTON D， SAINSBURY S， et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications [J]. Nucleic Acids Res， 2007， 35（6）： e45.
[3] ZHU L， WU X， LI O， et al. Cloning and characterization of genes involved in nostoxanthin biosynthesis of Sphingomonas elodea ATCC 31461 [J]. PLoS ONE， 2012， 7（4）： e35099.
[4] ZHU L， WU X， LI O， et al. Cloning and knockout of phytoene desaturase gene in Sphingomonas elodea ATCC 31461 for economic recovery of gellan gum [J]. J Ind Microbiol Biotechnol， 2011， 38（9）： 1507-13.