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摘要：【目的】跟蹤调查甘蔗花穗经不同温度水浴杀雄后的生物学特征变化，评价温汤杀雄效果，为进一步提高甘蔗杂交结实提供理论依据。【方法】以花粉较多的甘蔗品种ROC22和科5为试验材料，设48、50和52 ℃温水各处理 3 min 3个处理，以不进行温度处理为对照，对各处理2个甘蔗品种花穗的开花动态、雌蕊外部形态变化、单穗散粉量、花粉成熟度、花粉活力变化及授予外源花粉4 h后柱头原位萌发情况和结实性进行对比分析。【结果】与对照相比，不同温度处理下2个甘蔗品种的花穗均延迟开花，温度越高，延迟时间越长;单穗散粉量和花粉活力显著（P<0.05）或极显著（P<0.01，下同）降低;随着处理温度的升高，单穗自交出苗数和异交出苗数极显著降低，假杂种比例呈先降低后升高的变化趋势，其中以50 ℃处理的假杂种比例最低（0.09～0.11），处理效果最佳。3种温度处理对雌蕊外观、柱头可授性及成熟花粉影响较小。【结论】结合甘蔗杂交育种对实生苗后代选择需要，以50 ℃温水处理3 min的去雄效果较理想，可减少后代区分假杂种的人工投入，提高育种效率。
关键词： 甘蔗;花穗;温汤杀雄;花粉活力;柱头可授性
中图分类号： S566.1 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）12-2665-08
Biological characteristics of sugarcane tassels treated with the emasculation technology by hot water
CHANG Hai-long， QIU Yong-sheng， FANG Na， ZHANG Wei， GUO Yu-qiang，
CHEN Jun-lü， WU Jian-tao， LIU Zhuang， ZHOU Feng， CHEN Dao-qin，WANG Qin-nan*
（Hainan Sugarcane Breeding Station of Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Sugarcane Germplasm Resources and Utilization of Scientific Observation Test Station， Ministry of Agriculture and
Rural Affairs， Sanya， Hainan 572025， China）
Abstract：【Objective】According to a follow-up research on the biological characteristics of sugarcane tassels treated with the emasculation technology by hot water through three different temperatures， the relative effects were assessed，which provided a theoretical basis for further enhancing the efficiency of sugarcane tassel hybridization. 【Method】After treating with 3 min at 48，50 and 52 ℃， the flower dynamics，morphological characteristics in pistils，amount of pollen in single tassel，pollen maturity，pollen activity，stigma receptivity and natural fecundity of sugarcane varieties ROC22 and Ke 5 tassels that were transferred exogenous pollens more than 4 h were used to conduct the research on stigma germination observation and natural fecundity systematically. 【Result】Compared to control groups， after treating with 3 min at different temperatures， ROC22 and Ke 5 tassels delayed flowering， and the higher the temperature was，the longer delayed flowering time. In addition， the amount of pollen in single tassel and pollen activity were reduced significantly（P<0.05） or extremely（P<0.01， the same below）. With the increasing of temperature，the number of selfing and outcrossing seed germination seedlings in single tassels decreased at extremely significant level. Meanwhile，false hybrids ratio presented on a tendency of decreasing first and then increasing， the emasculation treatment with 3 min at 50 ℃ had the best effect and false hybrids ratio was the lowest（0.09-0.11）. The effects of three different temperatures on pistil appearance，stigma receptivity and mature pollen were small. 【Conclusion】 Considering the importance of sugarcane cross breeding to the selection of seedlings progenies， emasculation effects are the best after treating with 3 min at 50 ℃ water temperature， which reduces the labor efforts of distinguishing false hybrids and improves the breeding efficiency. Key words： sugarcane; tassels; emasculation technology by hot water; pollen activity; stigma receptivity
0 引言
【研究意义】甘蔗为无性繁殖作物，花穗杂交仍是目前甘蔗种质创新和新品种选育的主要方法（李奇伟，2000;刘少谋等，2011;经艳芬等，2019），该方法主要是利用甘蔗有性杂交的杂种优势。甘蔗花为顶生的大型圆锥花序，1个花穗上有小穗6000～18000个，每个小穗内含有1个子房、2个柱头、3～4个花药，为雌雄同花（常海龙等，2017a）。由于甘蔗花穗的小穗极小，难以人工去雄，通常以少花粉亲本作为母本、多花粉亲本作为父本进行杂交选育（王丽萍和马丽，2005;吴建涛等，2017），杂交后代不可避免会有假杂种产生，有的高达40%以上，导致一些优异亲本可能未被有效利用，而大量不适宜的自交种被保留下来频繁组配杂交，严重影响了甘蔗选育种的效率（李奇伟等，2000;张跃彬等，2008）。因此，很有必要在甘蔗进行有性杂交前对母本进行去雄处理。【前人研究进展】雌雄同花作物常用的花穗去雄方法有化学法杀雄（Adugna et al.，2004;Yu et al.，2006，2009;赵彩霞等，2013）、徒手去雄（詹永发等，2008）、水分敏感性杀雄、温汤去雄和辐射诱导杀雄。赵桂琴（2000）研究表明，草地早熟禾温汤去雄的最佳处理为47 ℃、2 min，扁秆早熟禾温汤去雄的最佳处理为48 ℃、1 min或47 ℃、3 min。樊龙江等（2003）研究认为，露水或喷水可使水稻花粉吸水涨破，达到去雄目的，将籼稻颖壳剪去2/3后，经过露水或喷水去雄的套袋自交结实率分别为2.1%和2.8%，异交结实率为34.2%和29.2%，可作为快速简单的去雄方法，具有一定的应用价值。范瑞等（2014）研究表明，在向日葵花蕾直径为1 cm时喷施0.035 mg/g赤霉素后可显著降低花粉活力，降低自交结实率而提高异交结实率。陶丽等（2015）研究表明，澳洲坚果盛花期采用切管连被去雄后48 h授粉，可避免伪杂种产生，提高杂交种纯度，显著提高澳洲坚果的杂交育种效率。耿雷跃等（2015）对比了10份水稻材料分别采用温汤杀雄和剪颖杀雄的效果，发现45 ℃温水中浸泡5 min较剪颖杀雄杂交结实率更高，自交结实率更低，是相对高效的水稻杀雄方式。郑建敏等（2018）研究认为，施用小麦化学杀雄剂SC2011 30 L/ha时，小麦雄性不育度大于98%，且对柱头活力无影响，可显著提高杂交小麦的育种效率。关于甘蔗花穗去雄的研究，本课题组前期试验发现，用50 ℃温水浸泡甘蔗花穗5 min可达到一定的去雄效果（周峰等，2016）。【本研究切入点】本课题组前期借鉴其他作物去雄方法尝试对甘蔗花穗进行人工去雄、化学去雄和温汤杀雄，发现以温汤杀雄法效果较好，但关于甘蔗花穗去雄后整个花穗形态变化及自交不育的原理仍需进一步探究。【拟解决的关键问题】通过跟踪调查甘蔗花穗经不同温度水浴杀雄后整个花期的开放特征、雌蕊外部形态、散粉量、花粉活力、花粉管在柱头的生长动态及杂交结实性，探讨不同温度处理对花穗生长结实的影响，为进一步提高甘蔗花穗杂交结实提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
以种植在海南甘蔗育种场亲本圃内花粉较多的ROC22和科5为试验材料。
1. 2 试验方法
2017年12月上旬起，试验前1 d选取长势一致、包茎长根，且第2 d可开花的亲本，靠发根底部整齐砍断，带回温室大棚将其养植于充氧的水槽中。翌日上午8：00将花穗上部1/5处花药即将成熟的枝条及下部1/5处未散开的枝条全部剪去，仅留中间的3/5处花穗，以保证试验材料一致性。将水浴锅温度设定为48、50和52 ℃，不同温度下花穗处理时间均为3 min（前期试验过程中发现许多材料花穗经50 ℃处理5 min后结实极差甚至死亡而无法完成杂交授粉，所以本研究中处理时间减少至3 min），每处理各6株，每品种设6株对照，对照花穗修剪后不设温度处理。将处理后的甘蔗及对照分别放置在独立的单元格中，防止串粉。每日观察甘蔗花穗，记录相关数据。
1. 3 测定项目及方法
1. 3. 1 开花生物学特性 自处理翌日开始每天上午8：00对花穗进行观察取样，统计其开花所需天数及开花程度，并在体视显微镜下观察花穗各部分的形态特征。每次随机取开花植株10个小穗，在体视显微镜下用镊子和针头将外颖壳剥开观察柱头、子房的形态，并拍照记录比较。
1. 3. 2 单穗花粉量及花粉活力测定 自处理翌日开始，每处理选取3株花穗，上午8：00对其单穗取粉，用5 mm方孔筛去掉花药等杂质，天平称重后迅速装入离心管中，带回实验室，利用碘化钾染色法检验花粉成熟度，用花粉质量分析仪（Ampha Z30）检验花粉活力。
所选试验材料花粉量较多，单穗取粉后还会继续散粉，颖花开放持续至9：30左右，同时通过荧光显微镜观察发现，花穗柱头沾满花粉，且许多花粉均已萌发，花粉管深入到子房底部，完成受精过程，故每天取一次花粉不影响其正常结实。
1. 3. 3 柱头可授性原位萌发检测 每处理选取另外3株花穗自开花日起，上午8：00人工授予ROC22新鲜花粉，每日授粉一次，直至开花结束。授粉4 h后取样，每株花穗采取当日授粉的10个柱头，在体视显微镜下用镊子挑出其完整的柱头和子房，将其保存在FAA固定液（50 %乙醇89 mL、冰乙酸6 mL和甲醛溶液5 mL混合）中，固定时间在24 h以上。经水洗、软化透明、苯胺蓝染色等处理，最后对处理好的材料进行镜检。镜检时将甘蔗子房和柱头置于载玻片上，加入1滴缓冲液，盖上盖玻片后用镊子轻轻压实，利用荧光显微镜（OLYMPUS BX53+DP80）將玻片在近紫外光315～380 mm的波长下镜检拍照记录。 1. 3. 4 花穗结实出苗情况统计 试验结束后，所有试验材料花穗套袋移出单元格放在阳光充足的温室内，等待成熟。收获后在阳光下晾晒5～7 d，促其后熟，然后在低温干燥环境下放置15～30 d，诱导种子复苏。2018年3月将处理后的甘蔗种子播种于40 cm×30 cm带孔育苗盘中，每穗播种1盘。育苗盘底部平铺一层3 cm厚营养土（泥炭土∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1），甘蔗花穗平铺到营养土上，盖上一层薄薄的蛭石，浇透水后育苗盘盖上薄膜，置于28～30 ℃温室内，5 d左右即可出苗。待实生苗长至高8 cm后统计其出苗情况。以测定花粉活力的花穗出苗数定为自交出苗数，以人工授粉ROC22花粉的花穗定为异交出苗数，假杂种比例=自交出苗数/异交出苗数。
1. 4 统计分析
试验数据采用Excel 2010进行整理并制表，以SPSS 22.0对花穗散粉量、花粉活力和出苗数进行方差分析和多重比较。
2 结果与分析
2. 1 温汤杀雄后甘蔗花穗开花动态变化
由表1可知，2个甘蔗品种的花穗经温汤杀雄处理后，开花始期较对照均有所延迟，且去雄温度越高，延迟天数越长，2个品种间开花动态略有差异。ROC22的花穗经不同温度处理后第1 d均未开花，对照组第2 d有少量颖花开放，开花高峰期在第3 d和第4 d，第5 d开花全部结束，整个开花期持续4 d; 48 ℃处理的花穗在第3 d开始开花，高峰期在第4 d，第6 d开花结束，整个开花期持续4 d;50 ℃处理的花穗开放情况与48 ℃处理相似，但开花始期相对延迟1 d，至第7 d全部开花结束;52 ℃处理的花穗在处理后第5 d开始开花，整个开花期持续3 d。科5的花穗开花情况与ROC22相似，但不同处理的开花始期均较ROC22花穗提前1 d，对照组第1 d颖花已开放1/3，第4 d开花全部结束，48和50 ℃处理的花穗均在处理后5 d内全部开花结束， 52 ℃处理的花穗第4 d起颖花有少许开放，至第7 d开花结束。
2. 2 温汤杀雄后甘蔗花穗雌蕊动态变化
2个甘蔗品种的花穗经温汤处理后，不同处理花穗颖花开放时间存在差异，跟踪调查整个花期开放过程，并于颖花开放的当天上午8：00及时采集刚裸露的柱头在体视显微镜下观察其外部形态，结果见图1、图2和表2。2个甘蔗品种不同处理间柱头外观差异不明显，均为深红色或紫红色的羽状柱头，呈蓬松状态，颜色鲜艳，子房相对于柱头较小，呈椭圆形，颜色亮丽，富有光泽（图1和图2）。ROC22对照组花穗柱头羽状鳞片上沾满花粉，各温度处理的花穗柱头上也沾有少许花粉，且总体来看处理温度越高，柱头沾染花粉越少，说明ROC22花穗经温汤处理后散粉量降低，但仍有部分花粉沾染到柱头上（图1）。科5对照组和48 ℃处理的花穗柱头沾染花粉量明显高于ROC22花穗柱头，50 ℃处理的花穗柱头沾染花粉量明显减少，52 ℃处理花穗柱头在连续观察的4 d中柱头沾染花粉量均较少（图2）。由此可知，2个甘蔗品种经不同温度去雄后柱头粘粉量明显减少，但雌蕊外部形态无明显变化。
2. 3 温汤杀雄后甘蔗单穗散粉量及活力变化
由表3可知，随着处理温度的升高，单穗散粉量快速降低，尤其是经52 ℃温汤处理后2个品种的单穗散粉量仅0.01 g，且仅在第一次开花时能采集到少许花粉，同一天内多数处理间花穗散粉量有极显著差异（P<0.01，下同）。从花粉成熟度来看，ROC22花穗48和50 ℃处理的花粉成熟度与对照组差异不显著（P>0.05），三者花粉成熟度均在75%以上，且极显著高于52 ℃处理;科5的花粉成熟度随温汤处理温度的升高呈波浪式变化，对照组和50 ℃处理的花粉成熟度较高，均极显著高于48和52 ℃处理。经温汤处理后，2个品种的花粉活力均极显著低于对照，其中52 ℃处理花粉活力降至21%以下，其余处理的花粉活力仍在60%以上，理论上在花穗杂交授粉中均具有极高的结实性。综上所述，经温汤处理后，2个甘蔗品种花穗的散粉量均有明显降低，去雄温度为52 ℃时对花粉成熟度及花粉活力影响极显著。
2. 4 柱头可授性原位萌发检测
甘蔗花穗颖花开放时间一般为晴朗天气的上午7：00—10：00，为准确跟踪温水处理后花穗颖花开放程度，每日上午8：00仔细查看花穗的开花情况，颖花开放后及时授予外源花粉并做好标记，4 h后取柱头，荧光显微镜下观察其花粉萌发情况，每日授于新开放柱头花粉，直至开花结束，结果见图3和图4。由图3可看出，ROC22柱头羽状鳞片上沾满花粉，且花粉均处于萌发生长状态，萌发长出的花粉管钻入柱头内部分支结构的细胞间隙内，向内生长，水溶性苯胺蓝染色后柱头上萌发的花粉管在荧光下显示出强烈的绿色荧光。甘蔗花柱较长，位于2个羽状柱头基部，花粉管在花柱内迅速伸长汇总于子房顶部，在该区域可见多条花粉管。甘蔗为单子房、单胚珠，子房腔较狭窄，珠孔由内珠被构成，在子房底部为成熟胚囊的珠孔端。部分花粉管穿出子房壁后，便在子房壁与外珠被间向底部生长，最后进入珠孔，此时花粉管绿色荧光有所减弱，4 h内大部分花粉管均已深入子房底部到达珠孔附近。温汤杀雄后柱头沾染花粉量明显少于对照组，且处理温度越高柱头沾染花粉越少，但花粉管在花柱内伸长速度未受影响，如A3、A5、A6、B5、B6、C5、C6和C7等花粉管均已达子房底部。科5花穗柱頭花粉萌发情况（图4）与ROC22相似，但柱头沾染花粉量明显增多，4 h内花粉管也基本到达子房底部。柱头沾染花粉数量取决于柱头羽状鳞片的粘着力，说明花穗经温汤杀雄后可不同程度地影响柱头粘着力。
落到羽状柱头上的花粉数量非常多，萌发长出花粉管并进入柱头分支结构组织中的数量有所减少，汇总于子房顶部长端花柱内的数量明显减少，而进入子房腔后，位于子房壁与外珠被间生长的花粉管更少，仅有几条，真正进入珠孔的通常只有一条。种子结实是由一个花粉中精细胞沿花粉管进入胚珠中与2个极核和卵细胞结合完成受精过程，说明柱头上过多花粉对种子结实影响有限。综上所述，本研究3个处理温度对甘蔗柱头可授性影响极小。 2. 5 甘蔗花穗温汤处理效果结实性检测
由表4可知，经温汤处理后，2个甘蔗品种花穗自交出苗数远低于对照组，品种内各处理间花穗自交出苗数和异交出苗数随处理温度升高降低明显，呈显著（P<0.05）或极显著差异。假杂种比例随着处理温度的升高呈波浪式变化，以50 ℃处理效果最好，ROC22和科5的花穗假杂种分别为0.09和0.11，自交出苗数分别为15.67和21.00株/穗，异交出苗数分别为172.67和187.00株/穗，出苗量可满足甘蔗花穗杂交选育种对种苗数量要求。
3 讨论
温汤处理在水稻杂交中应用较多，用45 ℃温水浸泡5 min即可获得较好效果（耿雷跃等，2015）。甘蔗属于雌雄同花，颖花极小，仅3～5 mm，人工去雄速度慢、易损伤柱头且不易去除干净，而温汤处理为较适宜的去雄方法。本研究结果表明，甘蔗花穗经温水浸泡去雄后，花穗较对照会延迟开放，处理温度越高延迟时间越长;各处理间的柱头和子房外观变化不明显，蓬松状柱头均呈深红色或紫红色，颜色亮丽，椭圆形子房为浅绿色且富有光泽。花穗经温汤处理后散粉量明显降低，各处理间与对照呈极显著差异，各处理间的散粉量在开花第1 d较多，之后迅速减少，特别是52 ℃处理仅在开花第1 d采集到极少量花粉。通过对采集到的花粉成熟度和活力进行鉴定，发现48和50 ℃处理的花粉成熟度与对照相比差异不显著，花粉活力虽达极显著差异，但仍在60%以上，不影响其正常杂交授粉，52 ℃处理效果显著，但仍有15%以上活力。说明花穗在温汤处理前已经成熟或即将成熟的花药通过温汤处理方式并不能将其完全杀死，去雄前一定要将即将开放的小花穗剪掉。
关于柱头可授性的研究已有较多报道（Honsho et al.，2007;Germain，2013），不同作物的可授性检验基本采用联苯胺—过氧化氢法测定柱头可授性。本课题组也曾用此方法对甘蔗柱头进行可授性检验，活的柱头含有过氧化氢酶可与过氧化氢反应，使联苯胺变色，根据变色程度判断强弱（常海龙等，2017b）。本研究通过原位萌发方式，将有活力花粉授于柱头上，荧光显微镜下观察其花粉萌发情况，结果表明，温汤处理后柱头粘着性有所降低，羽状柱头粘着花粉量明显低于对照，但不影响花粉在柱头正常萌发，花粉管通过花柱仍能到达子房底部珠孔附近，且与对照无明显差异。说明本研究中3个处理温度对甘蔗柱头可授性影响有限。
温汤处理效果最终要反映在杂交结实性上，以低自交结实高异交结实为目的。余波等（2014）在研究水稻温汤处理效果试验中发现，43～45 ℃、3～5 min条件下杀雄效果较好，水稻自交结实率在12%以下，异交结实率最高达32%。本研究结果表明，甘蔗花穗经温汤处理后自交出苗量远低于对照，异交出苗量也存在明显差异。说明甘蔗花穗经温汤处理后杂交结实性受到极大影响，本研究结果也证明雌蕊柱头外部形态和可授性未受影响，但出苗率显著降低，具体原因有待进一步研究。
4 结论
甘蔗花穗经温汤处理后，颖花开放时间略有延迟，雌蕊外观和柱头可授性变化不明显，花穗散粉量随温度的升高和时间的延长显著降低。结合甘蔗杂交育种对实生苗后代选择需要，以50 ℃温水处理3 min的去雄效果较理想，假杂种比例在0.11以下，可减少后代区分假杂种的人工投入，提高育种效率。
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（Hainan Sugarcane Breeding Station of Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Sugarcane Germplasm Resources and Utilization of Scientific Observation Test Station， Ministry of Agriculture and
Rural Affairs， Sanya， Hainan 572025， China）
Abstract：【Objective】According to a follow-up research on the biological characteristics of sugarcane tassels treated with the emasculation technology by hot water through three different temperatures， the relative effects were assessed，which provided a theoretical basis for further enhancing the efficiency of sugarcane tassel hybridization. 【Method】After treating with 3 min at 48，50 and 52 ℃， the flower dynamics，morphological characteristics in pistils，amount of pollen in single tassel，pollen maturity，pollen activity，stigma receptivity and natural fecundity of sugarcane varieties ROC22 and Ke 5 tassels that were transferred exogenous pollens more than 4 h were used to conduct the research on stigma germination observation and natural fecundity systematically. 【Result】Compared to control groups， after treating with 3 min at different temperatures， ROC22 and Ke 5 tassels delayed flowering， and the higher the temperature was，the longer delayed flowering time. In addition， the amount of pollen in single tassel and pollen activity were reduced significantly（P<0.05） or extremely（P<0.01， the same below）. With the increasing of temperature，the number of selfing and outcrossing seed germination seedlings in single tassels decreased at extremely significant level. Meanwhile，false hybrids ratio presented on a tendency of decreasing first and then increasing， the emasculation treatment with 3 min at 50 ℃ had the best effect and false hybrids ratio was the lowest（0.09-0.11）. The effects of three different temperatures on pistil appearance，stigma receptivity and mature pollen were small. 【Conclusion】 Considering the importance of sugarcane cross breeding to the selection of seedlings progenies， emasculation effects are the best after treating with 3 min at 50 ℃ water temperature， which reduces the labor efforts of distinguishing false hybrids and improves the breeding efficiency. Key words： sugarcane; tassels; emasculation technology by hot water; pollen activity; stigma receptivity
0 引言
【研究意义】甘蔗为无性繁殖作物，花穗杂交仍是目前甘蔗种质创新和新品种选育的主要方法（李奇伟，2000;刘少谋等，2011;经艳芬等，2019），该方法主要是利用甘蔗有性杂交的杂种优势。甘蔗花为顶生的大型圆锥花序，1个花穗上有小穗6000～18000个，每个小穗内含有1个子房、2个柱头、3～4个花药，为雌雄同花（常海龙等，2017a）。由于甘蔗花穗的小穗极小，难以人工去雄，通常以少花粉亲本作为母本、多花粉亲本作为父本进行杂交选育（王丽萍和马丽，2005;吴建涛等，2017），杂交后代不可避免会有假杂种产生，有的高达40%以上，导致一些优异亲本可能未被有效利用，而大量不适宜的自交种被保留下来频繁组配杂交，严重影响了甘蔗选育种的效率（李奇伟等，2000;张跃彬等，2008）。因此，很有必要在甘蔗进行有性杂交前对母本进行去雄处理。【前人研究进展】雌雄同花作物常用的花穗去雄方法有化学法杀雄（Adugna et al.，2004;Yu et al.，2006，2009;赵彩霞等，2013）、徒手去雄（詹永发等，2008）、水分敏感性杀雄、温汤去雄和辐射诱导杀雄。赵桂琴（2000）研究表明，草地早熟禾温汤去雄的最佳处理为47 ℃、2 min，扁秆早熟禾温汤去雄的最佳处理为48 ℃、1 min或47 ℃、3 min。樊龙江等（2003）研究认为，露水或喷水可使水稻花粉吸水涨破，达到去雄目的，将籼稻颖壳剪去2/3后，经过露水或喷水去雄的套袋自交结实率分别为2.1%和2.8%，异交结实率为34.2%和29.2%，可作为快速简单的去雄方法，具有一定的应用价值。范瑞等（2014）研究表明，在向日葵花蕾直径为1 cm时喷施0.035 mg/g赤霉素后可显著降低花粉活力，降低自交结实率而提高异交结实率。陶丽等（2015）研究表明，澳洲坚果盛花期采用切管连被去雄后48 h授粉，可避免伪杂种产生，提高杂交种纯度，显著提高澳洲坚果的杂交育种效率。耿雷跃等（2015）对比了10份水稻材料分别采用温汤杀雄和剪颖杀雄的效果，发现45 ℃温水中浸泡5 min较剪颖杀雄杂交结实率更高，自交结实率更低，是相对高效的水稻杀雄方式。郑建敏等（2018）研究认为，施用小麦化学杀雄剂SC2011 30 L/ha时，小麦雄性不育度大于98%，且对柱头活力无影响，可显著提高杂交小麦的育种效率。关于甘蔗花穗去雄的研究，本课题组前期试验发现，用50 ℃温水浸泡甘蔗花穗5 min可达到一定的去雄效果（周峰等，2016）。【本研究切入点】本课题组前期借鉴其他作物去雄方法尝试对甘蔗花穗进行人工去雄、化学去雄和温汤杀雄，发现以温汤杀雄法效果较好，但关于甘蔗花穗去雄后整个花穗形态变化及自交不育的原理仍需进一步探究。【拟解决的关键问题】通过跟踪调查甘蔗花穗经不同温度水浴杀雄后整个花期的开放特征、雌蕊外部形态、散粉量、花粉活力、花粉管在柱头的生长动态及杂交结实性，探讨不同温度处理对花穗生长结实的影响，为进一步提高甘蔗花穗杂交结实提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
以种植在海南甘蔗育种场亲本圃内花粉较多的ROC22和科5为试验材料。
1. 2 试验方法
2017年12月上旬起，试验前1 d选取长势一致、包茎长根，且第2 d可开花的亲本，靠发根底部整齐砍断，带回温室大棚将其养植于充氧的水槽中。翌日上午8：00将花穗上部1/5处花药即将成熟的枝条及下部1/5处未散开的枝条全部剪去，仅留中间的3/5处花穗，以保证试验材料一致性。将水浴锅温度设定为48、50和52 ℃，不同温度下花穗处理时间均为3 min（前期试验过程中发现许多材料花穗经50 ℃处理5 min后结实极差甚至死亡而无法完成杂交授粉，所以本研究中处理时间减少至3 min），每处理各6株，每品种设6株对照，对照花穗修剪后不设温度处理。将处理后的甘蔗及对照分别放置在独立的单元格中，防止串粉。每日观察甘蔗花穗，记录相关数据。
1. 3 测定项目及方法
1. 3. 1 开花生物学特性 自处理翌日开始每天上午8：00对花穗进行观察取样，统计其开花所需天数及开花程度，并在体视显微镜下观察花穗各部分的形态特征。每次随机取开花植株10个小穗，在体视显微镜下用镊子和针头将外颖壳剥开观察柱头、子房的形态，并拍照记录比较。
1. 3. 2 单穗花粉量及花粉活力测定 自处理翌日开始，每处理选取3株花穗，上午8：00对其单穗取粉，用5 mm方孔筛去掉花药等杂质，天平称重后迅速装入离心管中，带回实验室，利用碘化钾染色法检验花粉成熟度，用花粉质量分析仪（Ampha Z30）检验花粉活力。
所选试验材料花粉量较多，单穗取粉后还会继续散粉，颖花开放持续至9：30左右，同时通过荧光显微镜观察发现，花穗柱头沾满花粉，且许多花粉均已萌发，花粉管深入到子房底部，完成受精过程，故每天取一次花粉不影响其正常结实。
1. 3. 3 柱头可授性原位萌发检测 每处理选取另外3株花穗自开花日起，上午8：00人工授予ROC22新鲜花粉，每日授粉一次，直至开花结束。授粉4 h后取样，每株花穗采取当日授粉的10个柱头，在体视显微镜下用镊子挑出其完整的柱头和子房，将其保存在FAA固定液（50 %乙醇89 mL、冰乙酸6 mL和甲醛溶液5 mL混合）中，固定时间在24 h以上。经水洗、软化透明、苯胺蓝染色等处理，最后对处理好的材料进行镜检。镜检时将甘蔗子房和柱头置于载玻片上，加入1滴缓冲液，盖上盖玻片后用镊子轻轻压实，利用荧光显微镜（OLYMPUS BX53+DP80）將玻片在近紫外光315～380 mm的波长下镜检拍照记录。 1. 3. 4 花穗结实出苗情况统计 试验结束后，所有试验材料花穗套袋移出单元格放在阳光充足的温室内，等待成熟。收获后在阳光下晾晒5～7 d，促其后熟，然后在低温干燥环境下放置15～30 d，诱导种子复苏。2018年3月将处理后的甘蔗种子播种于40 cm×30 cm带孔育苗盘中，每穗播种1盘。育苗盘底部平铺一层3 cm厚营养土（泥炭土∶蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1），甘蔗花穗平铺到营养土上，盖上一层薄薄的蛭石，浇透水后育苗盘盖上薄膜，置于28～30 ℃温室内，5 d左右即可出苗。待实生苗长至高8 cm后统计其出苗情况。以测定花粉活力的花穗出苗数定为自交出苗数，以人工授粉ROC22花粉的花穗定为异交出苗数，假杂种比例=自交出苗数/异交出苗数。
1. 4 统计分析
试验数据采用Excel 2010进行整理并制表，以SPSS 22.0对花穗散粉量、花粉活力和出苗数进行方差分析和多重比较。
2 结果与分析
2. 1 温汤杀雄后甘蔗花穗开花动态变化
由表1可知，2个甘蔗品种的花穗经温汤杀雄处理后，开花始期较对照均有所延迟，且去雄温度越高，延迟天数越长，2个品种间开花动态略有差异。ROC22的花穗经不同温度处理后第1 d均未开花，对照组第2 d有少量颖花开放，开花高峰期在第3 d和第4 d，第5 d开花全部结束，整个开花期持续4 d; 48 ℃处理的花穗在第3 d开始开花，高峰期在第4 d，第6 d开花结束，整个开花期持续4 d;50 ℃处理的花穗开放情况与48 ℃处理相似，但开花始期相对延迟1 d，至第7 d全部开花结束;52 ℃处理的花穗在处理后第5 d开始开花，整个开花期持续3 d。科5的花穗开花情况与ROC22相似，但不同处理的开花始期均较ROC22花穗提前1 d，对照组第1 d颖花已开放1/3，第4 d开花全部结束，48和50 ℃处理的花穗均在处理后5 d内全部开花结束， 52 ℃处理的花穗第4 d起颖花有少许开放，至第7 d开花结束。
2. 2 温汤杀雄后甘蔗花穗雌蕊动态变化
2个甘蔗品种的花穗经温汤处理后，不同处理花穗颖花开放时间存在差异，跟踪调查整个花期开放过程，并于颖花开放的当天上午8：00及时采集刚裸露的柱头在体视显微镜下观察其外部形态，结果见图1、图2和表2。2个甘蔗品种不同处理间柱头外观差异不明显，均为深红色或紫红色的羽状柱头，呈蓬松状态，颜色鲜艳，子房相对于柱头较小，呈椭圆形，颜色亮丽，富有光泽（图1和图2）。ROC22对照组花穗柱头羽状鳞片上沾满花粉，各温度处理的花穗柱头上也沾有少许花粉，且总体来看处理温度越高，柱头沾染花粉越少，说明ROC22花穗经温汤处理后散粉量降低，但仍有部分花粉沾染到柱头上（图1）。科5对照组和48 ℃处理的花穗柱头沾染花粉量明显高于ROC22花穗柱头，50 ℃处理的花穗柱头沾染花粉量明显减少，52 ℃处理花穗柱头在连续观察的4 d中柱头沾染花粉量均较少（图2）。由此可知，2个甘蔗品种经不同温度去雄后柱头粘粉量明显减少，但雌蕊外部形态无明显变化。
2. 3 温汤杀雄后甘蔗单穗散粉量及活力变化
由表3可知，随着处理温度的升高，单穗散粉量快速降低，尤其是经52 ℃温汤处理后2个品种的单穗散粉量仅0.01 g，且仅在第一次开花时能采集到少许花粉，同一天内多数处理间花穗散粉量有极显著差异（P<0.01，下同）。从花粉成熟度来看，ROC22花穗48和50 ℃处理的花粉成熟度与对照组差异不显著（P>0.05），三者花粉成熟度均在75%以上，且极显著高于52 ℃处理;科5的花粉成熟度随温汤处理温度的升高呈波浪式变化，对照组和50 ℃处理的花粉成熟度较高，均极显著高于48和52 ℃处理。经温汤处理后，2个品种的花粉活力均极显著低于对照，其中52 ℃处理花粉活力降至21%以下，其余处理的花粉活力仍在60%以上，理论上在花穗杂交授粉中均具有极高的结实性。综上所述，经温汤处理后，2个甘蔗品种花穗的散粉量均有明显降低，去雄温度为52 ℃时对花粉成熟度及花粉活力影响极显著。
2. 4 柱头可授性原位萌发检测
甘蔗花穗颖花开放时间一般为晴朗天气的上午7：00—10：00，为准确跟踪温水处理后花穗颖花开放程度，每日上午8：00仔细查看花穗的开花情况，颖花开放后及时授予外源花粉并做好标记，4 h后取柱头，荧光显微镜下观察其花粉萌发情况，每日授于新开放柱头花粉，直至开花结束，结果见图3和图4。由图3可看出，ROC22柱头羽状鳞片上沾满花粉，且花粉均处于萌发生长状态，萌发长出的花粉管钻入柱头内部分支结构的细胞间隙内，向内生长，水溶性苯胺蓝染色后柱头上萌发的花粉管在荧光下显示出强烈的绿色荧光。甘蔗花柱较长，位于2个羽状柱头基部，花粉管在花柱内迅速伸长汇总于子房顶部，在该区域可见多条花粉管。甘蔗为单子房、单胚珠，子房腔较狭窄，珠孔由内珠被构成，在子房底部为成熟胚囊的珠孔端。部分花粉管穿出子房壁后，便在子房壁与外珠被间向底部生长，最后进入珠孔，此时花粉管绿色荧光有所减弱，4 h内大部分花粉管均已深入子房底部到达珠孔附近。温汤杀雄后柱头沾染花粉量明显少于对照组，且处理温度越高柱头沾染花粉越少，但花粉管在花柱内伸长速度未受影响，如A3、A5、A6、B5、B6、C5、C6和C7等花粉管均已达子房底部。科5花穗柱頭花粉萌发情况（图4）与ROC22相似，但柱头沾染花粉量明显增多，4 h内花粉管也基本到达子房底部。柱头沾染花粉数量取决于柱头羽状鳞片的粘着力，说明花穗经温汤杀雄后可不同程度地影响柱头粘着力。
落到羽状柱头上的花粉数量非常多，萌发长出花粉管并进入柱头分支结构组织中的数量有所减少，汇总于子房顶部长端花柱内的数量明显减少，而进入子房腔后，位于子房壁与外珠被间生长的花粉管更少，仅有几条，真正进入珠孔的通常只有一条。种子结实是由一个花粉中精细胞沿花粉管进入胚珠中与2个极核和卵细胞结合完成受精过程，说明柱头上过多花粉对种子结实影响有限。综上所述，本研究3个处理温度对甘蔗柱头可授性影响极小。 2. 5 甘蔗花穗温汤处理效果结实性检测
由表4可知，经温汤处理后，2个甘蔗品种花穗自交出苗数远低于对照组，品种内各处理间花穗自交出苗数和异交出苗数随处理温度升高降低明显，呈显著（P<0.05）或极显著差异。假杂种比例随着处理温度的升高呈波浪式变化，以50 ℃处理效果最好，ROC22和科5的花穗假杂种分别为0.09和0.11，自交出苗数分别为15.67和21.00株/穗，异交出苗数分别为172.67和187.00株/穗，出苗量可满足甘蔗花穗杂交选育种对种苗数量要求。
3 讨论
温汤处理在水稻杂交中应用较多，用45 ℃温水浸泡5 min即可获得较好效果（耿雷跃等，2015）。甘蔗属于雌雄同花，颖花极小，仅3～5 mm，人工去雄速度慢、易损伤柱头且不易去除干净，而温汤处理为较适宜的去雄方法。本研究结果表明，甘蔗花穗经温水浸泡去雄后，花穗较对照会延迟开放，处理温度越高延迟时间越长;各处理间的柱头和子房外观变化不明显，蓬松状柱头均呈深红色或紫红色，颜色亮丽，椭圆形子房为浅绿色且富有光泽。花穗经温汤处理后散粉量明显降低，各处理间与对照呈极显著差异，各处理间的散粉量在开花第1 d较多，之后迅速减少，特别是52 ℃处理仅在开花第1 d采集到极少量花粉。通过对采集到的花粉成熟度和活力进行鉴定，发现48和50 ℃处理的花粉成熟度与对照相比差异不显著，花粉活力虽达极显著差异，但仍在60%以上，不影响其正常杂交授粉，52 ℃处理效果显著，但仍有15%以上活力。说明花穗在温汤处理前已经成熟或即将成熟的花药通过温汤处理方式并不能将其完全杀死，去雄前一定要将即将开放的小花穗剪掉。
关于柱头可授性的研究已有较多报道（Honsho et al.，2007;Germain，2013），不同作物的可授性检验基本采用联苯胺—过氧化氢法测定柱头可授性。本课题组也曾用此方法对甘蔗柱头进行可授性检验，活的柱头含有过氧化氢酶可与过氧化氢反应，使联苯胺变色，根据变色程度判断强弱（常海龙等，2017b）。本研究通过原位萌发方式，将有活力花粉授于柱头上，荧光显微镜下观察其花粉萌发情况，结果表明，温汤处理后柱头粘着性有所降低，羽状柱头粘着花粉量明显低于对照，但不影响花粉在柱头正常萌发，花粉管通过花柱仍能到达子房底部珠孔附近，且与对照无明显差异。说明本研究中3个处理温度对甘蔗柱头可授性影响有限。
温汤处理效果最终要反映在杂交结实性上，以低自交结实高异交结实为目的。余波等（2014）在研究水稻温汤处理效果试验中发现，43～45 ℃、3～5 min条件下杀雄效果较好，水稻自交结实率在12%以下，异交结实率最高达32%。本研究结果表明，甘蔗花穗经温汤处理后自交出苗量远低于对照，异交出苗量也存在明显差异。说明甘蔗花穗经温汤处理后杂交结实性受到极大影响，本研究结果也证明雌蕊柱头外部形态和可授性未受影响，但出苗率显著降低，具体原因有待进一步研究。
4 结论
甘蔗花穗经温汤处理后，颖花开放时间略有延迟，雌蕊外观和柱头可授性变化不明显，花穗散粉量随温度的升高和时间的延长显著降低。结合甘蔗杂交育种对实生苗后代选择需要，以50 ℃温水处理3 min的去雄效果较理想，假杂种比例在0.11以下，可减少后代区分假杂种的人工投入，提高育种效率。
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