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[摘要]目的：建立藏药二十五味珊瑚丸中B-细辛醚的HPLC含量测定方法。方法：采用Waters XSELECT CSHc投色谱柱，以甲醇-水（56：44）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，柱温为35℃。结果：B-细辛醚在0.9926～2.9778ug范围内线性良好（r=0.9999），平均回收率为99.27%，RSD为1.1%。结论：该方法准确、可靠、快速、灵敏，可用于藏药二十五味珊瑚丸的质量控制。
[关键词]二十五味珊瑚丸；B-细辛醚；高效液相色谱法；含量测定
二十五味珊瑚丸是传统藏药，由珊瑚、珍珠、青金石、珍珠母、诃子、木香、红花、丁香、沉香、朱砂、龙骨等二十五味药材制成，具有清热定惊、开窍通络、止痛的功效，用于治疗“白脉病”，即中枢神经系统疾病，如神志不清，身体麻木，头昏目眩，脑部疼痛，血压不调，头痛，癫痫及各种神经性疼痛。首次收载于1995《中国药典》标本版，1997年被国家卫生部批准为国家中药保护品种，目前被《中国药典》2010年版收载。现行检验标准包含简单的化学反应和西红花、红花主要成分的薄层色谱鉴别以及乌头碱的限量测定。涉及的药材少，代表性不足，缺乏组方药材的质控指标及定量标准，难以保证产品质量的稳定和用药安全有效。
二十五味珊瑚丸治疗癫痫等神经性疼痛，藏菖蒲中有效成分B-细辛醚起重要作用，采用UP-LC-DAD/Q-TOF-MS对二十五味珊瑚丸全方进行了系统的成分分析，鉴定出6大类61个成分，其中苯丙素类B-细辛醚和a-细辛醚来自藏菖蒲，且二十五味珊瑚丸成药中B-细辛醚含量较高。研究表明，B-细辛醚能降低小鼠癫痫发作级别，延长癫痫发作潜伏期，减少湿狗样抖动次数。而B-细辛醚是主要入血入脑的成分，既是有效成分，但在高浓度下又是潜在的毒性成分，因此控制B-细辛醚的含量关系到全方的安全性和有效性。本研究拟采用HPLC建立了二十五味珊瑚丸中B-细辛醚的含量测定方法，为藏药二十五味珊瑚丸的质量控制提供参考方法。
1.仪器与材料
1.1仪器 Waters高效液相色谱仪（Waters2695泵自动进样器，2998二极管阵列紫外检测器，Waters自带数据处理器）；超声仪；旋转蒸发仪；十万分之一电子天平。
1.2材料 B-细辛醚（批号：C10301000，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；二十五味珊瑚丸（抽自青海金诃、西藏神猴、昌都光于利民、西藏甘露、西藏藏医学院等9个生产企业，占全国生产企业的73%）。配制阴性样品的药材由西藏自治区食品药品检验所标本室提供。甲醇为色谱纯（美国Fisher公司），水为超纯水。
2.方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱：Waters Xselect CSH Cls（4.6mm×250mm，5txm）；柱温：35～C；流动相：甲醇一水（56：44）；流速：1mlZmin；检测波长：254nm；进样量：10uL。
2.2空白试验 按处方中药味比例，配制不含藏菖蒲的群药，按其工艺制成阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备并测定，色谱图见图1。表明阴性样品溶液在与B-细辛醚对照品相同保留时间处未现色谱峰，故认为无干扰。
2.3对照品溶液的制备 精密称取B-细辛醚对照品适量，加甲醇制成1mL含0.25mg的溶液，作为对照品溶液。
2.4供试品溶液的制备 取本品2g，研细，精密称定，加甲醇20mL，加热回流提取1h，过滤后，药渣再用20mL甲醇加热回流提取1h。合并两次提取液，用旋转蒸发仪在30℃下减压干燥完全，加入少量甲醇洗涤，用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
2.5线性关系的考察 精密称取B-细辛醚对照品适量，制得浓度溶液为0.24815mg/mL，分别进样2、4、6、8、10、12ul，按上述色谱条件，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，回归方程：y=2.23e+006X-8.85e+004（r=0.9999），结果表明，B-细辛醚在0.4963～2.9778ug范围内线性关系良好。
2.6精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，RSD值为0.5%。表明仪器的精密度良好。
2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别在室温下放置0、2、4、8、12h进样测定，结果峰面积基本不变，RSD值为0.73%，表明供试品溶液在12h内基本稳定。
2.8重复性试验 取本品1批，按照上述方法制备成6份供试品溶液，测得B-细辛醚平均含量为2.04mg/g，RSD值为1.1%。
2.9回收率试验 精密称取来自7个不同生产企业已知含量的样品约1g，分别精密加入浓度的B一细辛醚对照品，进样测定，平均回收率及RSD值见表1。
2.10样品的测定 取7个生产企业样品，按上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，进行含量测定。计算样品中B-细辛醚的含量，结果见表2。
3.讨论
3.1用甲醇、水超声提取，结果杂质峰干扰严重，分离度较差。而采用甲醇加热回流提取后用旋转蒸发仪回收溶剂，可除去较多杂质峰，各组分能够良好分离。
3.2采用不同流动相进行考察，乙腈和0.05%磷酸溶液梯度洗脱，结果出峰时间推迟且峰拖尾，甲醇和水比例为（65：35），结果峰分离差。用甲醇和水比例（46：44）结果峰形对称，分离好且分析時间缩短。
3.3二十五味珊瑚丸中同时含B-细辛醚和a-细辛醚，是藏菖蒲发挥药效的重要指标成分。目前国内无B-细辛醚和a-细辛醚标准品，国外购进的纯度较低，B-细辛醚对照品色谱图显示含B-细辛醚和a-细辛醚两种成分，但是样品中a-细辛醚的含量低，故未建立a-细辛醚的含量测定方法。
3.4由于藏菖蒲药材产地、年限、采收季节等因素不同，B-细辛醚含量明显不同。同时结合78批次样品含量测定结果，考虑该药品存放时问、生产工艺稳定对B-细辛醚含量影响等因素，暂订本品每1g含藏菖蒲以B-细辛醚计，应为0.40～2.20mg。
3.5对全国8家生产企业涉及的78批次的二十五味珊瑚丸进行了B-细辛醚的含量测定，范围在0.30～2.20 mg/g之间，表2可以看出西藏甘露生产（批号：14125A）的二十五味珊瑚丸中B-细辛醚的含量最高，比由西藏藏医学院生产（140701）的高6倍，说明不同生产企业的该药品B-细辛醚含量差异较大，含量较低难以保证药效，故建议现行标准增加B-细辛醚的含量测定以便控制该药品质量。
综上，本实验采用HPLC法对藏药二十五味珊瑚丸的质量进行了评价，并对建立的方法进行了详尽的方法学考察，为二十五味珊瑚丸质量标准的提高提供了实验依据，可作为二十五味珊瑚丸的质量控制方法。
[关键词]二十五味珊瑚丸；B-细辛醚；高效液相色谱法；含量测定
二十五味珊瑚丸是传统藏药，由珊瑚、珍珠、青金石、珍珠母、诃子、木香、红花、丁香、沉香、朱砂、龙骨等二十五味药材制成，具有清热定惊、开窍通络、止痛的功效，用于治疗“白脉病”，即中枢神经系统疾病，如神志不清，身体麻木，头昏目眩，脑部疼痛，血压不调，头痛，癫痫及各种神经性疼痛。首次收载于1995《中国药典》标本版，1997年被国家卫生部批准为国家中药保护品种，目前被《中国药典》2010年版收载。现行检验标准包含简单的化学反应和西红花、红花主要成分的薄层色谱鉴别以及乌头碱的限量测定。涉及的药材少，代表性不足，缺乏组方药材的质控指标及定量标准，难以保证产品质量的稳定和用药安全有效。
二十五味珊瑚丸治疗癫痫等神经性疼痛，藏菖蒲中有效成分B-细辛醚起重要作用，采用UP-LC-DAD/Q-TOF-MS对二十五味珊瑚丸全方进行了系统的成分分析，鉴定出6大类61个成分，其中苯丙素类B-细辛醚和a-细辛醚来自藏菖蒲，且二十五味珊瑚丸成药中B-细辛醚含量较高。研究表明，B-细辛醚能降低小鼠癫痫发作级别，延长癫痫发作潜伏期，减少湿狗样抖动次数。而B-细辛醚是主要入血入脑的成分，既是有效成分，但在高浓度下又是潜在的毒性成分，因此控制B-细辛醚的含量关系到全方的安全性和有效性。本研究拟采用HPLC建立了二十五味珊瑚丸中B-细辛醚的含量测定方法，为藏药二十五味珊瑚丸的质量控制提供参考方法。
1.仪器与材料
1.1仪器 Waters高效液相色谱仪（Waters2695泵自动进样器，2998二极管阵列紫外检测器，Waters自带数据处理器）；超声仪；旋转蒸发仪；十万分之一电子天平。
1.2材料 B-细辛醚（批号：C10301000，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；二十五味珊瑚丸（抽自青海金诃、西藏神猴、昌都光于利民、西藏甘露、西藏藏医学院等9个生产企业，占全国生产企业的73%）。配制阴性样品的药材由西藏自治区食品药品检验所标本室提供。甲醇为色谱纯（美国Fisher公司），水为超纯水。
2.方法与结果
2.1色谱条件 色谱柱：Waters Xselect CSH Cls（4.6mm×250mm，5txm）；柱温：35～C；流动相：甲醇一水（56：44）；流速：1mlZmin；检测波长：254nm；进样量：10uL。
2.2空白试验 按处方中药味比例，配制不含藏菖蒲的群药，按其工艺制成阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制备并测定，色谱图见图1。表明阴性样品溶液在与B-细辛醚对照品相同保留时间处未现色谱峰，故认为无干扰。
2.3对照品溶液的制备 精密称取B-细辛醚对照品适量，加甲醇制成1mL含0.25mg的溶液，作为对照品溶液。
2.4供试品溶液的制备 取本品2g，研细，精密称定，加甲醇20mL，加热回流提取1h，过滤后，药渣再用20mL甲醇加热回流提取1h。合并两次提取液，用旋转蒸发仪在30℃下减压干燥完全，加入少量甲醇洗涤，用甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，用0.45um微孔滤膜过滤，取续滤液即得。
2.5线性关系的考察 精密称取B-细辛醚对照品适量，制得浓度溶液为0.24815mg/mL，分别进样2、4、6、8、10、12ul，按上述色谱条件，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，回归方程：y=2.23e+006X-8.85e+004（r=0.9999），结果表明，B-细辛醚在0.4963～2.9778ug范围内线性关系良好。
2.6精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，RSD值为0.5%。表明仪器的精密度良好。
2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别在室温下放置0、2、4、8、12h进样测定，结果峰面积基本不变，RSD值为0.73%，表明供试品溶液在12h内基本稳定。
2.8重复性试验 取本品1批，按照上述方法制备成6份供试品溶液，测得B-细辛醚平均含量为2.04mg/g，RSD值为1.1%。
2.9回收率试验 精密称取来自7个不同生产企业已知含量的样品约1g，分别精密加入浓度的B一细辛醚对照品，进样测定，平均回收率及RSD值见表1。
2.10样品的测定 取7个生产企业样品，按上述方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，进行含量测定。计算样品中B-细辛醚的含量，结果见表2。
3.讨论
3.1用甲醇、水超声提取，结果杂质峰干扰严重，分离度较差。而采用甲醇加热回流提取后用旋转蒸发仪回收溶剂，可除去较多杂质峰，各组分能够良好分离。
3.2采用不同流动相进行考察，乙腈和0.05%磷酸溶液梯度洗脱，结果出峰时间推迟且峰拖尾，甲醇和水比例为（65：35），结果峰分离差。用甲醇和水比例（46：44）结果峰形对称，分离好且分析時间缩短。
3.3二十五味珊瑚丸中同时含B-细辛醚和a-细辛醚，是藏菖蒲发挥药效的重要指标成分。目前国内无B-细辛醚和a-细辛醚标准品，国外购进的纯度较低，B-细辛醚对照品色谱图显示含B-细辛醚和a-细辛醚两种成分，但是样品中a-细辛醚的含量低，故未建立a-细辛醚的含量测定方法。
3.4由于藏菖蒲药材产地、年限、采收季节等因素不同，B-细辛醚含量明显不同。同时结合78批次样品含量测定结果，考虑该药品存放时问、生产工艺稳定对B-细辛醚含量影响等因素，暂订本品每1g含藏菖蒲以B-细辛醚计，应为0.40～2.20mg。
3.5对全国8家生产企业涉及的78批次的二十五味珊瑚丸进行了B-细辛醚的含量测定，范围在0.30～2.20 mg/g之间，表2可以看出西藏甘露生产（批号：14125A）的二十五味珊瑚丸中B-细辛醚的含量最高，比由西藏藏医学院生产（140701）的高6倍，说明不同生产企业的该药品B-细辛醚含量差异较大，含量较低难以保证药效，故建议现行标准增加B-细辛醚的含量测定以便控制该药品质量。
综上，本实验采用HPLC法对藏药二十五味珊瑚丸的质量进行了评价，并对建立的方法进行了详尽的方法学考察，为二十五味珊瑚丸质量标准的提高提供了实验依据，可作为二十五味珊瑚丸的质量控制方法。