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摘要 目的：觀察跑步运动对小鼠端粒长度和体内氧化抗氧化的影响，探讨中医学“流水不腐，户枢不蠢”运动养生观的现代生物学机制。方法：选取并将8周龄雄性ICR小鼠随机分为3组（未施加运动组，运动1组，运动2组），两运动组按2种不同的运动量，每天跑步，共运动8周后取材。荧光定量PCR的方法检测血液细胞和肝脏组织中基因端粒的长短变化，化学法测定试剂盒检测肝脏组织中还原型胱甘肽（GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值的变化，总超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、心肌组织中蛋白质羰基和丙二醛（MDA）的水平，用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测心肌组织中8-异前列腺素F2α（Direct 8-iso-PGF2α8）的水平和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的水平。结果：运动1组和运动2组血液细胞中端粒的长度均长于未施加运动组，差异有统计学意义（ P <0.05）;肝脏组织中端粒的长度，虽长于未施加运动组，但差异无统计学意义（ P >0.05）。运动1组与未施加运动组比较，小鼠肝组织中GSH/GSSG的比值变大，差异有统计学意义（ P <0.05），运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）;运动1组和运动2组与未施加运动组比较，肝组织中过氧化氢酶（CAT）的水平升高，差异有统计学意义（ P <0.05），3组小鼠肝组织中总超氧化物歧化酶（SOD）水平差异无统计学意义（ P >0.05）。运动1组和运动2组与未施加运动组比较，8-OHdG水平、蛋白质羰基水平、异前列腺素F2α水平均降低，差异有统计学意义（ P <0.05）。运动1组与未施加运动组比较，丙二醛水平降低，差异有统计学意义（ P <0.05），运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。结论：一定强度的运动可以升高抗氧化防御作用，降低氧化损伤，减缓端粒的缩短速度。
关键词 中医养生;跑步运动;端粒;氧化抗氧化水平;氧化损伤;小鼠;过氧化氢酶;氧化物歧化酶
Effects of Running on Telomere Length and Oxidative Antioxidant Level in Mice
Zhang Shujing，Wang Yue，Zhou Yumei，Chen Lin，Gao Yushan，Huang Xiang，Sun Yan，Zheng Fengjie，Li Yuhang
（School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）
Abstract Objective： To observe the effects of running exercise on telomere length and the oxidation and antioxidation level in mice，and to explore the modern biological mechanism of exercise in the traditional Chinese medicine. Methods： Eight-week-old male ICR mice were randomly divided into three groups （no exercise group，exercise group 1，and exercise group 2）.The two exercise groups were given different amount of daily running for 8 weeks.The quantitative real-time PCR method was used to detect the change of telomere length in blood cells and liver tissue.The chemical assay kit was used to detect the change of glutathione （GSH）/oxidized glutathione （GSSG） in liver tissue，and to detect the change in total superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT），protein carbonyl and malondialdehyde （MDA） content in myocardial tissue.The content of 8-isoprostaglandin F2α and 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） in cardiac muscle tissue were detected using the ELISA kits. Results： Compared with the non-exercise group，the length of telomere in the blood cells of exercise group 1 and exercise group 2 was significantly longer than that of the no exercise group （ P <0.05 or P <0.01）.Although longer than the no exercise group，the length of telomeres in liver was not statistical significant.The ratio of GSH/GSSG in liver tissue of mice in exercise group 1 was higher than that in no exercise group，and there was no significant difference between exercise group 2 and non-exercise exercise group.Compared with the non-exercise group，the contents of catalase （CAT） in the liver tissue were significantly higher in exercise group 1 and exercise group 2，the difference was statistically significant （ P <0.05 or P <0.01）.No significant difference was found in the total superoxide dismutase （SOD） content in the tissues.Compared with no exercise group，the levels of 8-OHdG，protein carbonyl，and isoprostaglandin F2α in exercise group 1 and exercise 2 group were significantly decreased （ P <0.05 or P <0.01）.Compared with the no exercise group，the content of malondialdehyde in the exercise group 1 was decreased，and the difference was statistically significant （ P <0.05），while there was no significant difference between the exercise group 2 and the no exercise exercise group. Conclusion： A certain intensity of exercise can increase the antioxidant defenses，reduce oxidative damage，and slow down the telomere′s shortening. Key Words Traditional Chinese medicine regimen; Running; Telomere; Oxidation and antioxidant level; Oxidative damage; Mice; Catalase; Oxide dismutase
中图分类号：R228 文献标识码：A doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.016
后汉著名医家华陀曾创“五禽戏”防病治病，他说：“人体欲得劳动，但不当使极尔，动摇则谷气得消，血脉流通，病不得生，譬犹户枢不朽是也”[1]。《吕氏春秋》中亦有类似记载：“流水不腐，户枢不蠢，动也。形气亦然，形不动则精不流，精不流则气郁”[2]。均在强调运动与健康的关系，运动能促使经脉内气血通畅，使人体各个部位都得到气血津液的滋养。如果缺乏运动，就会像《素问·调经论篇》指出：“血气不和，百病乃变化而生”。由此可见，中医强调运动养生对于保持健康、延年益寿等具有重要意义。
端粒是真核生物染色体末端的一种保护性帽状结构，它是一段DNA重复序列，随着细胞分裂逐渐缩短。端粒长度在出生时最大，随着年龄的增长而逐渐减小，当端粒长度缩短到某一数值时，细胞会停止分裂、走向凋亡[3-4]，因此被认为是年龄老化的生物标志物。端粒长度的变化对于确定个体的寿命和年龄相关疾病的变化是非常重要的，最近有研究发现白细胞和骨骼肌细胞的端粒长度可能与健康运动生活正相关，并与包括癌症[5]，心血管疾病[6]，肥胖[7]，糖尿病[8-11]，慢性疼痛和压力在内的几种与年龄相关的疾病风险有一定的负相关[12-14]。流行病研究显示，运动员与经常参加体育锻炼者较其他人群拥有更长的端粒[15]，既往研究亦表明，适量的运动可以提高人体功能，增强人体免疫力，改善身体健康，与老龄化和一些慢性病的风险密切有关[16]。因此，基于端粒长度在衰老中的重要性以及与健身运动活动的关联性，本研究通过对比检测不同跑步运动强度下，小鼠端粒长度的变化，小鼠体内氧化抗氧化水平的变化，探讨运动后小鼠端粒长短的变化的可能的作用机制以及与中医理论的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 选取8周龄的ICR小鼠，雄性，21只，体质量20～22 g，购置斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2016-0002：适应性饲养7 d，自由饮水和进食。运动组小鼠每d运动1次，每周运动6 d，期间自由饮水和进食，运动8周。
1.1.2 试剂与仪器 血液细胞基因组提取试剂盒购自天根生物（货号：DP304-02），POWER SYBRGREEN（货号：4367659）购自Invitrogen公司，应用Primer5软件设计引物并交由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。GSH/GSSG检测试剂盒购自碧云天生物（货号：S0053），总超氧化物歧化酶（SOD）（货号：A001-3）、过氧化氢酶（CAT）（货号：A007-2）、丙二醛（MDA）（货号：A003-1）和蛋白质羰基含量测定试剂盒（货号：A087-2）购自南京建成生物制品研究所，8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA检测试剂盒为abcam（货号：ab201734）、Direct 8-iso-PGF2αELISA试剂盒购自ENZO公司（货号：ADI-900-091）、小鼠的运动在平板跑步机上进行，小鼠跑步机为众实迪创跑步机（型号：ZS-PT型）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 选取并将8周龄雄性ICR小鼠21只并随机分为3组，未施加运动组，运动1组，运动2组，每组7只。根据Hafstad等[17]及Kemi等[18]小鼠运动的耗氧量参数，制定中等强度持续训练（Moderate Intensity Continuous Training，MIT）及高强度间歇训练（High Intensity Interval Training，HIT），设计了运动1组及运动2组。
1.2.2 干预方法 1）运动1组：选取小鼠最大耗氧量的65% ～70%的速度中间值，即15 m/min，每天运动2 h，每周运动6 d。2）运动2组：选取小鼠最大耗氧量的85% ～90%的速度中间值，即21 m/min。由于小鼠难以维持此速度进行运动，因此选取了间歇运动法，即16 m/min运动5 min后升高速度至26 m/min，5 min后减速到16 m/min，循环进行，总运动时间为2 h，每周运动6 d。
小鼠跑步运动过程，经实验人员设置参数并监视下，在跑步机上完成。小鼠运动期间自由饮水和进食，运动8周。
1.2.3 检测指标與方法
1）标本的采集 运动8周后，采用小鼠摘眼球取血法，4 ℃静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，分离血清和血细胞;冰上打开腹腔、胸腔，分离小鼠肝脏、心脏组织置于冻存管中，保存于-80 ℃低温保存箱。
2）荧光定量PCR检测端粒长短 用DNA提取试剂盒提取全血细胞和肝组织中的DNA，测浓度后配平，用荧光染料POWER SYBRGREEN进行实时荧光定量PCR实验，PCR反应体系为20 μL：其中SYBRGREEN 10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA原液（2 μg）稀释10倍后加入2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR反应条件如下：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s（退火同时读取荧光数值），共40个循环。熔解曲线：扩增循环结束后，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min（读取荧光数值）;从60 ℃至95 ℃，每增加0.3 ℃，读取1次吸光值，最后95 ℃，15 s。读取Ct值，计算△Ct值（Ct目的基因-Ct内参ACTIN）、△△Ct值（△Ct处理-△Ct对照）、2-△△Ct值[相对表达量（Relative Qualification，RQ）]。荧光定量PCR引物如下：Tel，Forward Primer 5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3′，Reverse Primer 5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′;36B4，Forward Primer 5′-ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG-3′，Reverse Primer 5′-TCAATGGTGCCTCTGGAGATT-3′。 3）化学法测定肝组织中还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值变化、总超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的水平 10%肝组织匀浆的制备：用生理盐水制备10%肝组织匀浆，3 000 r/min，离心10 min，取上清。还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值的测定：取上清加入相关试剂在412 nm处检测吸光度值，与标准曲线比较，得到总谷胱甘肽含量，另一部分加入GSH清除试剂后，在412 nm处检测吸光度值，获得GSSG含量。SOD测定过程：取1 cm光径石英比色皿，紫外240 nm，双蒸水调零备用。取经过处理的肝组织匀浆（稀释10倍）20 μL加入比色皿底部，用移液器加入3 mL底物反应溶液，快速冲入比色皿中，240 nm处立即测定吸光度，记下OD1值，1 min后再次测一次吸光度，记下OD2数值，按照公式计算SOD浓度。CAT测定过程：按照南京建成研究所说明书测定孔和测定空白孔各加入20 μL待测肝组织上清，测定孔加入20 μL酶工作液，测定空白孔加入20 μL酶稀释液;然后每孔加入200 μL底物应用液，混匀，37 ℃孵育20 min，450 nm测定吸光度值并计算CAT的浓度。
4）化学法测定心肌组织中丙二醛（MDA）和蛋白质羰基水平 MDA测定过程：取40 mg心肌组织放入含有蛋白去除试剂的试管内，制备成10%的组织匀浆，经3 000 r/min，离心15 min后，取组织匀浆上清，按照南京建成丙二醛测试盒进行，在532 nm处测得吸光度值，计算丙二醛水平。蛋白质羰基水平检测：取40 mg心肌组织，按试剂盒中提供的试剂一制备10%的匀浆，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 r/ min，离心10 min，取上清进行测定。部分上清按照南京建成试剂盒步骤进行操作后，370 nm波长测定各管吸光度值，并计算蛋白质羰基水平。
5）用ELISA试剂盒检测心肌组织中异前列腺素（Direct 8-iso-PGF2α8）和羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）水平 异前列腺素的检测按照ENZO公司ELISA试剂盒的操作进行。制备10%的心肌组织匀浆，取上清100 μL加入50 μL 10N氢氧化钠，45 ℃温育2 h后加入50 μL 37%盐酸，调整pH值至6～8。样品稀释10倍后加入试剂盒内提供的96孔板中，放入抗体后室温孵育2 h。洗涤3次后加入显色剂，室温孵育45 min后立刻加入50 μL的终止液来终止反应，405 nm测得吸光度并计算心肌中异前列腺素水平。羟基脱氧鸟苷的检测按照Abcam的ELISA试剂盒操作进行。配置标准品，样品稀释100倍后加入试剂盒提供的96孔板中，加入抗体后室温孵育1 h后洗涤3次，加入显色剂避光孵育30 min后，立刻加入50 μL的终止液，450 nm测得吸光度值并计算心肌组织中8-OHdG水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ ±s ）表示，3组间比较采用方差分析，以 P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组小鼠全血细胞中端粒长短比较 血液细胞中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，均显著变长，差异有统计学意义（ P <0.05）。肝脏组织中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，虽有变长的趋势，但差异无统计学意义（ P >0.05）。见表1。小鼠的全血细胞和肝组织中DNA端粒（Tel）基因和36B4基因的qRT-PCR的扩增曲线和熔解曲线。见图1。
2.2 3组小鼠肝组织中氧化/抗氧化比较 3组小鼠肝组织中GSH/GSSG比值，运动1组与未施加运 动组比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。3组小鼠肝组织中SOD水平，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。3组小鼠肝组织中CAT水平，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。见表2。
2.3 3组小鼠心肌组织中8-OHdG含量、小鼠心肌组织中蛋白质羰基含量、小鼠心肌组织中异前列腺素F2α水平、小鼠心肌组织中丙二醛（MDA）水平比较 心肌组织中8-OHdG的表达，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，8-OHdG的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）。蛋白质羰基的表达量，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，蛋白质羰基的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）。异前列腺素F2α的表达，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，异前列腺素F2α的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）。丙二醛的表达，运动1组与未施加运动组比较，丙二醛的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）;运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。
3 讨论
体育锻炼影响端粒长度有几种可能的机制，包括氧化抗氧化失衡，炎性反应和骨骼肌卫星细胞含量的变化等[15]。由于端粒DNA富含极易受到氧化损伤的GGG片段，容易遭受损伤，出现双链断裂、长度縮短，因此，氧化抗氧化失衡是影响端粒长度最重要的因素之一。生物体在氧化代谢中会产生一些活性氧基团或分子（ROS，包括超氧化物O2-，氢氧游离基OH·等），这些化合物具有高度的化学反应性，可以破坏细胞中的脂质、蛋白质、DNA，长期积累，最终造成细胞结构和功能的改变。由于ROS是在氧化代谢中产生，生物的新陈代谢速率越高，ROS产生越多，则老化越快[19-20]。机体内同时存在抗氧化酶系统，可以还原ROS，减少其对机体的损伤。适当的体育运动可能通过高表达抗氧化酶，升高氧化损伤的阈值，起到保护作用。因此运动主要通过调节氧化-抗氧化水平来达到对端粒的保护作用。 機体内存在的抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶（SOD），可以将超氧化物变成过氧化氢（H2O2）和氧;过氧化氢酶（CAT），催化过氧化氢生成氧和水;以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等，这些酶降低细胞中ROS水平，减少其对DNA损伤。其中，SOD是生物体有效清除活性氧的重要酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线[21]。CAT存在于细胞的过氧化物体内，也是生物防御系统的关键酶之一，其研究可以追溯到19世纪初[22]。GSH是一种普遍存在的非酶类抗氧化物，它主要用于避免抗坏血酸和α-生育酚被氧化而失去功能，同时也是两类重要的抗氧化酶家族谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S-转移酶的辅酶。GSH结构中包含一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，可以还原被氧化的物质而自身被氧化成GSSG，因此GSH/GSSG可以体现机体氧化还原的平衡状态，比值的增加通常代表机体抗氧化水平相对氧化水平的升高[23]。
机体氧化损伤的情况通常测定细胞内DNA、蛋白质、脂质被氧化的程度。8-羟基脱氧鸟苷是活性氧自由基等攻击DNA分子中鸟嘌呤碱基中第8位碳原子而产生的一种氧化物，是国际上公认的评价机体DNA氧化损伤的生物标志物[24-25]。蛋白质羰基化是蛋白质氧化损伤中的一种，其本身是抗氧化过程中的一种不可逆的化学修饰，指的是氨基酸残基侧链受到氧自由基攻击最后转变成羰基产物[26]，氧化剂包括自由基和一些非自由基物质容易攻击含有碳-碳双键的脂质，特别是多不饱和脂肪酸，丙二醛是脂质过氧化过程中最易生成的产物[27]，异前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α）是自由基攻击细胞膜脂质花生四烯酸使其发生裂解所产生的小分子脂类，是一种前列腺素的衍生物[28]。因此，可以通过检测以上指标来确定体内氧化-抗氧化损伤的状态。
本研究中，我们用实时PCR检测肝组织和血液细胞中端粒的长度，统计分析显示，肝脏组织中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，虽有变长的趋势，但差异无统计学意义;血液细胞中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，均显著变长，差异有统计学意义。提示运动可以减缓端粒的缩短速度。然而运动2组相对于运动1组，强度增加，对端粒的保护作用却并无统计学意义上的升高。
机体氧化抗氧化指标中，小鼠肝组织中GSH/GSSG的比值，运动1组与未施加运动组比较显著升高，运动组2与未施加运动组比较有升高趋势。小鼠肝组织中过氧化氢酶（CAT）水平，运动1组和运动2组与未施加运动组比较均显著升高。GSH/GSSG的比值变大和过氧化氢酶水平升高，说明运动小鼠机体内抗氧化水平的提高。跑步运动组和未施加运动组比较，肝组织中总超氧化物歧化酶（SOD）水平呈减低趋势，差异无统计意义，提示SOD可能并不是运动调节的敏感指标，尚有待进一步研究。
心肌组织中8-OHdG的表达反映DNA氧化损伤程度、蛋白质羰基的表达反映蛋白质氧化损伤程度、异前列腺素F2α的表达反映脂质氧化损伤程，运动组1和运动组2与未施加运动组比较，此3项指标表达降低，说明适度运动对心肌具有保护作用。丙二醛的表达反映脂质氧化损伤程度，运动组1与未施加运动组比较，表达降低;运动2组与未施加运动组比较，虽差异无统计学意义，但呈下降趋势，同样说明适度运动对心肌具有保护作用。
本实验结果显示，跑步运动的小鼠与未施加运动组比较，端粒相对较长，其机制可能与运动升高体内抗氧化酶的表达、改变氧化-抗氧化平衡、降低氧化损伤有关。下一步本课题组将着眼于运动强度与端粒长度的关系、端粒长度与寿命的关系等开展研究，从而进一步深入探讨中医学“流水不腐，户枢不蠢”运动养生观的现代生物学机制。
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关键词 中医养生;跑步运动;端粒;氧化抗氧化水平;氧化损伤;小鼠;过氧化氢酶;氧化物歧化酶
Effects of Running on Telomere Length and Oxidative Antioxidant Level in Mice
Zhang Shujing，Wang Yue，Zhou Yumei，Chen Lin，Gao Yushan，Huang Xiang，Sun Yan，Zheng Fengjie，Li Yuhang
（School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）
Abstract Objective： To observe the effects of running exercise on telomere length and the oxidation and antioxidation level in mice，and to explore the modern biological mechanism of exercise in the traditional Chinese medicine. Methods： Eight-week-old male ICR mice were randomly divided into three groups （no exercise group，exercise group 1，and exercise group 2）.The two exercise groups were given different amount of daily running for 8 weeks.The quantitative real-time PCR method was used to detect the change of telomere length in blood cells and liver tissue.The chemical assay kit was used to detect the change of glutathione （GSH）/oxidized glutathione （GSSG） in liver tissue，and to detect the change in total superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT），protein carbonyl and malondialdehyde （MDA） content in myocardial tissue.The content of 8-isoprostaglandin F2α and 8-hydroxydeoxyguanosine （8-OHdG） in cardiac muscle tissue were detected using the ELISA kits. Results： Compared with the non-exercise group，the length of telomere in the blood cells of exercise group 1 and exercise group 2 was significantly longer than that of the no exercise group （ P <0.05 or P <0.01）.Although longer than the no exercise group，the length of telomeres in liver was not statistical significant.The ratio of GSH/GSSG in liver tissue of mice in exercise group 1 was higher than that in no exercise group，and there was no significant difference between exercise group 2 and non-exercise exercise group.Compared with the non-exercise group，the contents of catalase （CAT） in the liver tissue were significantly higher in exercise group 1 and exercise group 2，the difference was statistically significant （ P <0.05 or P <0.01）.No significant difference was found in the total superoxide dismutase （SOD） content in the tissues.Compared with no exercise group，the levels of 8-OHdG，protein carbonyl，and isoprostaglandin F2α in exercise group 1 and exercise 2 group were significantly decreased （ P <0.05 or P <0.01）.Compared with the no exercise group，the content of malondialdehyde in the exercise group 1 was decreased，and the difference was statistically significant （ P <0.05），while there was no significant difference between the exercise group 2 and the no exercise exercise group. Conclusion： A certain intensity of exercise can increase the antioxidant defenses，reduce oxidative damage，and slow down the telomere′s shortening. Key Words Traditional Chinese medicine regimen; Running; Telomere; Oxidation and antioxidant level; Oxidative damage; Mice; Catalase; Oxide dismutase
中图分类号：R228 文献标识码：A doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.016
后汉著名医家华陀曾创“五禽戏”防病治病，他说：“人体欲得劳动，但不当使极尔，动摇则谷气得消，血脉流通，病不得生，譬犹户枢不朽是也”[1]。《吕氏春秋》中亦有类似记载：“流水不腐，户枢不蠢，动也。形气亦然，形不动则精不流，精不流则气郁”[2]。均在强调运动与健康的关系，运动能促使经脉内气血通畅，使人体各个部位都得到气血津液的滋养。如果缺乏运动，就会像《素问·调经论篇》指出：“血气不和，百病乃变化而生”。由此可见，中医强调运动养生对于保持健康、延年益寿等具有重要意义。
端粒是真核生物染色体末端的一种保护性帽状结构，它是一段DNA重复序列，随着细胞分裂逐渐缩短。端粒长度在出生时最大，随着年龄的增长而逐渐减小，当端粒长度缩短到某一数值时，细胞会停止分裂、走向凋亡[3-4]，因此被认为是年龄老化的生物标志物。端粒长度的变化对于确定个体的寿命和年龄相关疾病的变化是非常重要的，最近有研究发现白细胞和骨骼肌细胞的端粒长度可能与健康运动生活正相关，并与包括癌症[5]，心血管疾病[6]，肥胖[7]，糖尿病[8-11]，慢性疼痛和压力在内的几种与年龄相关的疾病风险有一定的负相关[12-14]。流行病研究显示，运动员与经常参加体育锻炼者较其他人群拥有更长的端粒[15]，既往研究亦表明，适量的运动可以提高人体功能，增强人体免疫力，改善身体健康，与老龄化和一些慢性病的风险密切有关[16]。因此，基于端粒长度在衰老中的重要性以及与健身运动活动的关联性，本研究通过对比检测不同跑步运动强度下，小鼠端粒长度的变化，小鼠体内氧化抗氧化水平的变化，探讨运动后小鼠端粒长短的变化的可能的作用机制以及与中医理论的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 选取8周龄的ICR小鼠，雄性，21只，体质量20～22 g，购置斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2016-0002：适应性饲养7 d，自由饮水和进食。运动组小鼠每d运动1次，每周运动6 d，期间自由饮水和进食，运动8周。
1.1.2 试剂与仪器 血液细胞基因组提取试剂盒购自天根生物（货号：DP304-02），POWER SYBRGREEN（货号：4367659）购自Invitrogen公司，应用Primer5软件设计引物并交由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。GSH/GSSG检测试剂盒购自碧云天生物（货号：S0053），总超氧化物歧化酶（SOD）（货号：A001-3）、过氧化氢酶（CAT）（货号：A007-2）、丙二醛（MDA）（货号：A003-1）和蛋白质羰基含量测定试剂盒（货号：A087-2）购自南京建成生物制品研究所，8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）ELISA检测试剂盒为abcam（货号：ab201734）、Direct 8-iso-PGF2αELISA试剂盒购自ENZO公司（货号：ADI-900-091）、小鼠的运动在平板跑步机上进行，小鼠跑步机为众实迪创跑步机（型号：ZS-PT型）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 选取并将8周龄雄性ICR小鼠21只并随机分为3组，未施加运动组，运动1组，运动2组，每组7只。根据Hafstad等[17]及Kemi等[18]小鼠运动的耗氧量参数，制定中等强度持续训练（Moderate Intensity Continuous Training，MIT）及高强度间歇训练（High Intensity Interval Training，HIT），设计了运动1组及运动2组。
1.2.2 干预方法 1）运动1组：选取小鼠最大耗氧量的65% ～70%的速度中间值，即15 m/min，每天运动2 h，每周运动6 d。2）运动2组：选取小鼠最大耗氧量的85% ～90%的速度中间值，即21 m/min。由于小鼠难以维持此速度进行运动，因此选取了间歇运动法，即16 m/min运动5 min后升高速度至26 m/min，5 min后减速到16 m/min，循环进行，总运动时间为2 h，每周运动6 d。
小鼠跑步运动过程，经实验人员设置参数并监视下，在跑步机上完成。小鼠运动期间自由饮水和进食，运动8周。
1.2.3 检测指标與方法
1）标本的采集 运动8周后，采用小鼠摘眼球取血法，4 ℃静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，分离血清和血细胞;冰上打开腹腔、胸腔，分离小鼠肝脏、心脏组织置于冻存管中，保存于-80 ℃低温保存箱。
2）荧光定量PCR检测端粒长短 用DNA提取试剂盒提取全血细胞和肝组织中的DNA，测浓度后配平，用荧光染料POWER SYBRGREEN进行实时荧光定量PCR实验，PCR反应体系为20 μL：其中SYBRGREEN 10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，DNA原液（2 μg）稀释10倍后加入2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR反应条件如下：95 ℃预变性10 min;95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s（退火同时读取荧光数值），共40个循环。熔解曲线：扩增循环结束后，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min（读取荧光数值）;从60 ℃至95 ℃，每增加0.3 ℃，读取1次吸光值，最后95 ℃，15 s。读取Ct值，计算△Ct值（Ct目的基因-Ct内参ACTIN）、△△Ct值（△Ct处理-△Ct对照）、2-△△Ct值[相对表达量（Relative Qualification，RQ）]。荧光定量PCR引物如下：Tel，Forward Primer 5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3′，Reverse Primer 5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3′;36B4，Forward Primer 5′-ACTGGTCTAGGACCCGAGAAG-3′，Reverse Primer 5′-TCAATGGTGCCTCTGGAGATT-3′。 3）化学法测定肝组织中还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值变化、总超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的水平 10%肝组织匀浆的制备：用生理盐水制备10%肝组织匀浆，3 000 r/min，离心10 min，取上清。还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）比值的测定：取上清加入相关试剂在412 nm处检测吸光度值，与标准曲线比较，得到总谷胱甘肽含量，另一部分加入GSH清除试剂后，在412 nm处检测吸光度值，获得GSSG含量。SOD测定过程：取1 cm光径石英比色皿，紫外240 nm，双蒸水调零备用。取经过处理的肝组织匀浆（稀释10倍）20 μL加入比色皿底部，用移液器加入3 mL底物反应溶液，快速冲入比色皿中，240 nm处立即测定吸光度，记下OD1值，1 min后再次测一次吸光度，记下OD2数值，按照公式计算SOD浓度。CAT测定过程：按照南京建成研究所说明书测定孔和测定空白孔各加入20 μL待测肝组织上清，测定孔加入20 μL酶工作液，测定空白孔加入20 μL酶稀释液;然后每孔加入200 μL底物应用液，混匀，37 ℃孵育20 min，450 nm测定吸光度值并计算CAT的浓度。
4）化学法测定心肌组织中丙二醛（MDA）和蛋白质羰基水平 MDA测定过程：取40 mg心肌组织放入含有蛋白去除试剂的试管内，制备成10%的组织匀浆，经3 000 r/min，离心15 min后，取组织匀浆上清，按照南京建成丙二醛测试盒进行，在532 nm处测得吸光度值，计算丙二醛水平。蛋白质羰基水平检测：取40 mg心肌组织，按试剂盒中提供的试剂一制备10%的匀浆，冰水浴条件下机械匀浆，2 500 r/ min，离心10 min，取上清进行测定。部分上清按照南京建成试剂盒步骤进行操作后，370 nm波长测定各管吸光度值，并计算蛋白质羰基水平。
5）用ELISA试剂盒检测心肌组织中异前列腺素（Direct 8-iso-PGF2α8）和羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）水平 异前列腺素的检测按照ENZO公司ELISA试剂盒的操作进行。制备10%的心肌组织匀浆，取上清100 μL加入50 μL 10N氢氧化钠，45 ℃温育2 h后加入50 μL 37%盐酸，调整pH值至6～8。样品稀释10倍后加入试剂盒内提供的96孔板中，放入抗体后室温孵育2 h。洗涤3次后加入显色剂，室温孵育45 min后立刻加入50 μL的终止液来终止反应，405 nm测得吸光度并计算心肌中异前列腺素水平。羟基脱氧鸟苷的检测按照Abcam的ELISA试剂盒操作进行。配置标准品，样品稀释100倍后加入试剂盒提供的96孔板中，加入抗体后室温孵育1 h后洗涤3次，加入显色剂避光孵育30 min后，立刻加入50 μL的终止液，450 nm测得吸光度值并计算心肌组织中8-OHdG水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ ±s ）表示，3组间比较采用方差分析，以 P <0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组小鼠全血细胞中端粒长短比较 血液细胞中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，均显著变长，差异有统计学意义（ P <0.05）。肝脏组织中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，虽有变长的趋势，但差异无统计学意义（ P >0.05）。见表1。小鼠的全血细胞和肝组织中DNA端粒（Tel）基因和36B4基因的qRT-PCR的扩增曲线和熔解曲线。见图1。
2.2 3组小鼠肝组织中氧化/抗氧化比较 3组小鼠肝组织中GSH/GSSG比值，运动1组与未施加运 动组比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。3组小鼠肝组织中SOD水平，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。3组小鼠肝组织中CAT水平，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，差异有统计学意义（ P <0.05）。见表2。
2.3 3组小鼠心肌组织中8-OHdG含量、小鼠心肌组织中蛋白质羰基含量、小鼠心肌组织中异前列腺素F2α水平、小鼠心肌组织中丙二醛（MDA）水平比较 心肌组织中8-OHdG的表达，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，8-OHdG的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）。蛋白质羰基的表达量，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，蛋白质羰基的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）。异前列腺素F2α的表达，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，异前列腺素F2α的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）。丙二醛的表达，运动1组与未施加运动组比较，丙二醛的表达降低，差异有统计学意义（ P <0.05）;运动2组与未施加运动组比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。
3 讨论
体育锻炼影响端粒长度有几种可能的机制，包括氧化抗氧化失衡，炎性反应和骨骼肌卫星细胞含量的变化等[15]。由于端粒DNA富含极易受到氧化损伤的GGG片段，容易遭受损伤，出现双链断裂、长度縮短，因此，氧化抗氧化失衡是影响端粒长度最重要的因素之一。生物体在氧化代谢中会产生一些活性氧基团或分子（ROS，包括超氧化物O2-，氢氧游离基OH·等），这些化合物具有高度的化学反应性，可以破坏细胞中的脂质、蛋白质、DNA，长期积累，最终造成细胞结构和功能的改变。由于ROS是在氧化代谢中产生，生物的新陈代谢速率越高，ROS产生越多，则老化越快[19-20]。机体内同时存在抗氧化酶系统，可以还原ROS，减少其对机体的损伤。适当的体育运动可能通过高表达抗氧化酶，升高氧化损伤的阈值，起到保护作用。因此运动主要通过调节氧化-抗氧化水平来达到对端粒的保护作用。 機体内存在的抗氧化酶系统主要包括超氧化物歧化酶（SOD），可以将超氧化物变成过氧化氢（H2O2）和氧;过氧化氢酶（CAT），催化过氧化氢生成氧和水;以及谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等，这些酶降低细胞中ROS水平，减少其对DNA损伤。其中，SOD是生物体有效清除活性氧的重要酶类之一，被称为生物体抗氧化系统的第一道防线[21]。CAT存在于细胞的过氧化物体内，也是生物防御系统的关键酶之一，其研究可以追溯到19世纪初[22]。GSH是一种普遍存在的非酶类抗氧化物，它主要用于避免抗坏血酸和α-生育酚被氧化而失去功能，同时也是两类重要的抗氧化酶家族谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽S-转移酶的辅酶。GSH结构中包含一个活泼的巯基-SH，易被氧化脱氢，可以还原被氧化的物质而自身被氧化成GSSG，因此GSH/GSSG可以体现机体氧化还原的平衡状态，比值的增加通常代表机体抗氧化水平相对氧化水平的升高[23]。
机体氧化损伤的情况通常测定细胞内DNA、蛋白质、脂质被氧化的程度。8-羟基脱氧鸟苷是活性氧自由基等攻击DNA分子中鸟嘌呤碱基中第8位碳原子而产生的一种氧化物，是国际上公认的评价机体DNA氧化损伤的生物标志物[24-25]。蛋白质羰基化是蛋白质氧化损伤中的一种，其本身是抗氧化过程中的一种不可逆的化学修饰，指的是氨基酸残基侧链受到氧自由基攻击最后转变成羰基产物[26]，氧化剂包括自由基和一些非自由基物质容易攻击含有碳-碳双键的脂质，特别是多不饱和脂肪酸，丙二醛是脂质过氧化过程中最易生成的产物[27]，异前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α）是自由基攻击细胞膜脂质花生四烯酸使其发生裂解所产生的小分子脂类，是一种前列腺素的衍生物[28]。因此，可以通过检测以上指标来确定体内氧化-抗氧化损伤的状态。
本研究中，我们用实时PCR检测肝组织和血液细胞中端粒的长度，统计分析显示，肝脏组织中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，虽有变长的趋势，但差异无统计学意义;血液细胞中端粒的长度，运动1组和运动2组与未施加运动组比较，均显著变长，差异有统计学意义。提示运动可以减缓端粒的缩短速度。然而运动2组相对于运动1组，强度增加，对端粒的保护作用却并无统计学意义上的升高。
机体氧化抗氧化指标中，小鼠肝组织中GSH/GSSG的比值，运动1组与未施加运动组比较显著升高，运动组2与未施加运动组比较有升高趋势。小鼠肝组织中过氧化氢酶（CAT）水平，运动1组和运动2组与未施加运动组比较均显著升高。GSH/GSSG的比值变大和过氧化氢酶水平升高，说明运动小鼠机体内抗氧化水平的提高。跑步运动组和未施加运动组比较，肝组织中总超氧化物歧化酶（SOD）水平呈减低趋势，差异无统计意义，提示SOD可能并不是运动调节的敏感指标，尚有待进一步研究。
心肌组织中8-OHdG的表达反映DNA氧化损伤程度、蛋白质羰基的表达反映蛋白质氧化损伤程度、异前列腺素F2α的表达反映脂质氧化损伤程，运动组1和运动组2与未施加运动组比较，此3项指标表达降低，说明适度运动对心肌具有保护作用。丙二醛的表达反映脂质氧化损伤程度，运动组1与未施加运动组比较，表达降低;运动2组与未施加运动组比较，虽差异无统计学意义，但呈下降趋势，同样说明适度运动对心肌具有保护作用。
本实验结果显示，跑步运动的小鼠与未施加运动组比较，端粒相对较长，其机制可能与运动升高体内抗氧化酶的表达、改变氧化-抗氧化平衡、降低氧化损伤有关。下一步本课题组将着眼于运动强度与端粒长度的关系、端粒长度与寿命的关系等开展研究，从而进一步深入探讨中医学“流水不腐，户枢不蠢”运动养生观的现代生物学机制。
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