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摘 要：采用固相萃取-高效液相色谱质谱联用法（SPE-HPLC/MS），建立牛奶中9种性激素（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、诺龙、甲睾酮、丙酸睾酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮）残留的检测方法。样品经甲醇提取，过固相萃取柱净化，氮气吹干，残留物甲醇溶解后测定。其中雌激素（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇）采用负模式；其余性激素为正模式，进行多反应监测（MRM）模式定性定量分析。雌激素检出限（LODs）为1.1～1.2 μg/L，定量限（LOQs）为3.63～3.96 μg/L；其余性激素检出限（LODs）为0.1～0.5 μg/L，定量限（LOQs）为0.33～1.65 μg/L；分别在20.0～500.0 μg/L及2.5～100.0 μg/L范围内线性关系良好（r2>0.994 4）。在50.0～100.0 μg/L的添加水平上，9种性激素的平均回收率在82.7%～98.2%之间，变异系数（CV）为4.2%～11.2%。该法操作简单、灵敏度高，可用于牛奶中9种性激素的测定。
关键词：性激素；牛奶；固相萃取；高效液相色谱-质谱法
文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）05-0046-04
Abstract： A sensitive solid-phase extration/high-performance liquid chromatography-mass spectrometry method was established to determine 9 hormones residues（E1， E3， αE2， NT， MTS， PTS， CMA， MA， MPA） in milk. Milk samples were extracted first and then further purified on a solid-phase extraction column. After that， the purified solution was dried through nitrogen and the residues were dissolved in the mixture of methanol before LC-MS/MS analysis. Negative ion modes were adopted for 3 estrogens（E1， E3， αE2） while positive ion modes for all the other sex hormones. A multiple-reaction monitoring （MRM） mode was used for analysis. For the estrogens， the limits of detection （LODs） ranged from 1.1 μg/L to 1.2 μg/L whereas the limits of quantification （LOQs） were between 3.63 μg/L and 3.96 μg/L. For the other sex hormones， the LODs ranged from 0.1 μg/L to 0.5 μg/L whilst the LOQs were between 0.33 μg/L and 1.65 μg/L. Regression equations of these hormones had a good linear relationship（r2 greater than 0.994 4） within 20.0-500.0 μg/L and 2.5-100.0 μg/L. The average recoveries of 9 hormones were from 82.7% to 98.2% with the coefficients of variation（CV） between 4.2% and 11.2%（n=6） at the spiked levels of 50.0-100.0 μg/L. The method is simple， sensitive and therefore can be used to determine the residues of all the 9 hormones in cow milk.
Keywords： sex hormone； milk； solid-phase extraction（SPE）； high-performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC/MS）
0 引 言
性激素（sex hormones）是一类由动物体性腺所产生或人工合成的低分子量、亲脂性、具有生物活性的类固醇类物质[1]。它是甾体同化激素中最主要组成部分，这些物质具有蛋白质同化作用，通过增强食欲、抑制发情和提高饲料转化率，达到大幅度提高动物养殖经济效益的目的[2]。畜牧业滥用这些类固醇类激素，导致这些激素残留最终通过食物链进入人体，已成为全球性的食品安全问题[3]。有研究指出激素残留人体有“三致”作用，主要是导致体内脂肪堆积、儿童性早熟以及自身激素分泌失调，长期摄入可造成内分泌系统相关肿瘤、生长发育障碍、出生缺陷、生育缺陷及不孕不育等，给人体健康带来不良影响[4-5]。
关于牛奶中的性激素残留测定方法有很多，目前国内外最普遍的检测方法为仪器法和免疫法。仪器分析法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱-质谱法（LC/MS）[6]、超高效液相-质谱法（UPLC/MS）[7-8]和气相色谱-质谱法（GC/MS）[9]，随着酶联免疫技术的迅速推广，被企业等普遍采用。样品前处理方式也较多，如固相萃取、分散固相萃取[9]、中空纤维棒液液萃取[10]等。要達到高灵敏度和检出限，就需要采用液质联用的方法；因此，近年来采用液质联用法测定牛奶中激素含量成为了研究热点。调查表明牛乳和初乳中有大量类固醇激素[11]，但目前关于牛奶奶源的激素情况普查较少。本文在这些研究基础上，选取了固相萃取柱净化的方法，建立了高效液相色谱-质谱法（HPLC/MS）测定牛奶中常见的9种性激素残留的方法，并从奶源入手，应用所建立的方法检测了四川某牧场的原料奶检测了其性激素残留状况。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
标准品（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、诺龙、甲睾酮、丙酸睾酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮）均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均大于97.5%。甲酸（色谱级），天津市科密欧化学试剂有限公司；氨水（优级纯），成都市科龙化工试剂厂；甲醇、乙腈（色谱级），美国Tedia公司；超纯水；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
液相色谱仪（Agilent 1260）-三重四极杆串联质谱仪（Agilent 6410）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（500 mg 6 mL）；DIKMA ProElut C18固相萃取柱（500 mg 6 mL）；Agilent Bond Elut PLEXA固相萃取柱（500 mg 6 mL）；离心机（蜀科LG10-2.4A）；旋涡混匀器（Ika MS3）；电子天平（龙腾ESJ-200-4B）；12位水浴型氮吹仪（华盛谱信QF-3800）；超声波清洗器（昆山市超声仪器KQ-5200E）；旋转蒸发器（亚荣生化仪器RE-52AA）。
1.3 标准液配制
分别称取每种性激素标准品10.0 mg，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶，配制成质量浓度为1 000 mg/L的母液，于-20 ℃冰箱避光保存，放置时间不宜超过半年。再用甲醇将其稀释成质量浓度为1 mg/L的中间储备液。使用时，根据实际操作要求，用甲醇稀释上述标准储备溶液，配制成不同浓度的标准工作液。
1.4 仪器参数
1.4.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm），柱温：40 ℃，进样体积：10 μL，流量：0.3 mL/min。按表1和表2进行梯度洗脱。
1.4.2 质谱条件
多反应监测（MRM）模式，电喷雾离子源（ESI）；干燥气流量：10 mL/min；干燥气温度：350 ℃；雾化器压力：35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛细管电压：正模式4 000 V，负模式3 500 V；其余质谱参数见表3。
1.5 样品处理
1.5.1 提 取
称取5.0 g的牛奶试样，置于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇，旋涡混匀1 min，超声振荡15 min，于7 000 r/min条件下离心15 min，将上清液置于鸡心瓶中，加入20 mL正己烷萃取两次，去掉正己烷层后于45 ℃水浴上旋转蒸干，残渣用5 mL甲醇和20 mL水充分溶解，溶液用于固相萃取。
1.5.2 净 化
Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化后，将试样溶液过柱，再用5 mL水淋洗，用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，加入1 mL甲醇，旋涡振荡1 min，过0.22 μm滤膜，滤液置于进样瓶中，待上机进行LC/MS分析。
2 结果与分析
2.1 提取液的选择
常用提取剂有水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等[12-13]，近年来研究以甲醇和乙腈为提取剂效果显著[14]。本实验分别对比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯提取后乳化现象比较严重，7 000 r/min离心15 min后仍无明显效果；乙腈和甲醇提取的峰面积无显著差异，综合考虑到试剂毒性等因素，最终选择甲醇作为提取液。
2.2 流动相的选择
质谱测定性激素常用流动相为甲醇和水或者乙腈和水，本文中除雌激素外的其他性激素的流动相为甲醇和水，由于甲醇为流动相各激素的响应信号要高于乙腈，故选择甲醇和水。其中添加甲酸的目的是有利于目标物质的离子化，本文对比了不同体积分数的甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%和0.3%），从各激素的响应值得出最适的甲酸溶液的体积分数。实验发现，从0.05%～0.1%时，各激素的响应值逐渐增加，从0.1%～0.3%时，各激素的响应值不断降低，所以当体积分数为0.1%时，目标化合物的响应值最适。检测雌激素的流动相为乙腈和水（0.1%的氨水），实验表明，0.1%氨水有效地提高了雌激素的质谱响应。
2.3 固相萃取柱的选择
本实验选用固相萃取（SPE）方式净化样品，实验中选择了Waters Oasis HLB、DIKMA ProElut C18及Agilent Bond Elut PLEXA 3种SPE小柱，通过加标回收率来选择合适的小柱，加标浓度为100 μg/L，结果3种固相萃取柱对于9种性激素的加标回收率范围分别为70.4%～96%，30%～60.2%和34.5%～71.8%。因此，最终选择Waters Oasis HLB小柱。
2.4 加标回收率和检出限（LODs）线性关系、方法回收率与精密度
按上述处理方法，配制各激素系列的混标溶液，质量浓度为2.5～500 μg/L，以定量离子的峰面积为纵坐标，以相对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程，相关系数均大于0.994 4，表明各激素在质量浓度为2.5～500 μg/L范围内呈现良好的线性关系，如表4所示。
取牛奶样品做回收率实验，在5.0 g牛奶中添加不同浓度的混合标准溶液，性激素添加水平为50，
100 μg/kg，每个添加水平平行检测6次（n=6）。按上述实验過程处理后，得出各激素的回收率和变异系数（CV），结果如表5所示。
2.5 样品分析
用建立的方法对四川某牧场随机采集的牛奶样品进行检测，随机选取健康无抗生素使用、无激素类药物使用且处在不同泌乳时期的荷斯坦奶牛90头，每头牛分别采集50 mL，跟踪采集10头牛分娩后1～7 d的初乳。采集到的牛奶样品-20 ℃密封保存，检测时，解冻即可。检测结果如表6所示。 由表6可以看出，牛初乳中激素种类较多，且随天数的增加有下降趋势，其中3种内源性激素：17α-雌二醇、雌酮、雌三醇到第3天以后均未检出，丙酸睾酮第4天后也未检出。初乳中激素种类较多且含量较高，这主要来源于奶牛的人工授精以及自身妊娠期的分泌。
检测发现常乳（共90头：牛只胎次以1次为主，涵盖1～4胎次；其中牛只泌乳期涵盖1～10个月）中含有3种性激素，3种激素分别为醋酸甲羟孕酮、甲睾酮和诺龙。醋酸甲羟孕酮主要集中在泌乳初期的第1个月，其中该激素含量的变化范围为0.25～1.55 μg/kg。甲睾酮主要集中在泌乳初期第1～2月，该激素含量的变化范围为0.22～3.43 μg/kg。诺龙集中在泌乳初期第1个月，该激素含量变化范围是0.56～3.74 μg/kg。由此可见，牛奶中这3种激素的降解速度较慢。
初乳测定结果与范志影等[15]关于内源性激素的报道一致，雌酮：3220 ng/kg，17α-雌二醇：727 ng/kg，雌三醇：167 ng/kg。对常乳的报道较少，曹劲松等[16]研究表明常乳中存在一定含量的雌激素，其中雌三醇为9～31 pg/mL。目前测定均为市售牛奶样品，张艳等[17]研究检测出孕酮及17α-雌二醇，本研究中常乳经检测并未检出此类激素。
3 结束语
本实验建立了固相萃取-液相色谱串联质谱法测定牛奶中9 种性激素多残留的方法。其中3种雌激素和其余性激素分别采用不同离子模式均得到较好分离。应用建立的方法对四川某牧场牛初乳以及常乳进行检测，检测到3种性激素，并主要存在于泌乳期前2个月，结果表明并未检测出常见的内源性雌激素，可能是方法检出限略高的原因[18]。由于牛奶是激素摄入的主要来源之一，因此加强对牛奶中激素的检测十分必要。经验证该方法操作简单、准确度高，可作为牛奶中性激素测定的检测方法，也可为其他乳制品中性激素的检测提供方法参考。
参考文献
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（编辑：徐柳）
关键词：性激素；牛奶；固相萃取；高效液相色谱-质谱法
文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2016）05-0046-04
Abstract： A sensitive solid-phase extration/high-performance liquid chromatography-mass spectrometry method was established to determine 9 hormones residues（E1， E3， αE2， NT， MTS， PTS， CMA， MA， MPA） in milk. Milk samples were extracted first and then further purified on a solid-phase extraction column. After that， the purified solution was dried through nitrogen and the residues were dissolved in the mixture of methanol before LC-MS/MS analysis. Negative ion modes were adopted for 3 estrogens（E1， E3， αE2） while positive ion modes for all the other sex hormones. A multiple-reaction monitoring （MRM） mode was used for analysis. For the estrogens， the limits of detection （LODs） ranged from 1.1 μg/L to 1.2 μg/L whereas the limits of quantification （LOQs） were between 3.63 μg/L and 3.96 μg/L. For the other sex hormones， the LODs ranged from 0.1 μg/L to 0.5 μg/L whilst the LOQs were between 0.33 μg/L and 1.65 μg/L. Regression equations of these hormones had a good linear relationship（r2 greater than 0.994 4） within 20.0-500.0 μg/L and 2.5-100.0 μg/L. The average recoveries of 9 hormones were from 82.7% to 98.2% with the coefficients of variation（CV） between 4.2% and 11.2%（n=6） at the spiked levels of 50.0-100.0 μg/L. The method is simple， sensitive and therefore can be used to determine the residues of all the 9 hormones in cow milk.
Keywords： sex hormone； milk； solid-phase extraction（SPE）； high-performance liquid chromatography-mass spectrometry（HPLC/MS）
0 引 言
性激素（sex hormones）是一类由动物体性腺所产生或人工合成的低分子量、亲脂性、具有生物活性的类固醇类物质[1]。它是甾体同化激素中最主要组成部分，这些物质具有蛋白质同化作用，通过增强食欲、抑制发情和提高饲料转化率，达到大幅度提高动物养殖经济效益的目的[2]。畜牧业滥用这些类固醇类激素，导致这些激素残留最终通过食物链进入人体，已成为全球性的食品安全问题[3]。有研究指出激素残留人体有“三致”作用，主要是导致体内脂肪堆积、儿童性早熟以及自身激素分泌失调，长期摄入可造成内分泌系统相关肿瘤、生长发育障碍、出生缺陷、生育缺陷及不孕不育等，给人体健康带来不良影响[4-5]。
关于牛奶中的性激素残留测定方法有很多，目前国内外最普遍的检测方法为仪器法和免疫法。仪器分析法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱-质谱法（LC/MS）[6]、超高效液相-质谱法（UPLC/MS）[7-8]和气相色谱-质谱法（GC/MS）[9]，随着酶联免疫技术的迅速推广，被企业等普遍采用。样品前处理方式也较多，如固相萃取、分散固相萃取[9]、中空纤维棒液液萃取[10]等。要達到高灵敏度和检出限，就需要采用液质联用的方法；因此，近年来采用液质联用法测定牛奶中激素含量成为了研究热点。调查表明牛乳和初乳中有大量类固醇激素[11]，但目前关于牛奶奶源的激素情况普查较少。本文在这些研究基础上，选取了固相萃取柱净化的方法，建立了高效液相色谱-质谱法（HPLC/MS）测定牛奶中常见的9种性激素残留的方法，并从奶源入手，应用所建立的方法检测了四川某牧场的原料奶检测了其性激素残留状况。 1 材料与方法
1.1 材料与试剂
标准品（雌酮、雌三醇、17α-雌二醇、诺龙、甲睾酮、丙酸睾酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮）均购于德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度均大于97.5%。甲酸（色谱级），天津市科密欧化学试剂有限公司；氨水（优级纯），成都市科龙化工试剂厂；甲醇、乙腈（色谱级），美国Tedia公司；超纯水；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
液相色谱仪（Agilent 1260）-三重四极杆串联质谱仪（Agilent 6410）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（500 mg 6 mL）；DIKMA ProElut C18固相萃取柱（500 mg 6 mL）；Agilent Bond Elut PLEXA固相萃取柱（500 mg 6 mL）；离心机（蜀科LG10-2.4A）；旋涡混匀器（Ika MS3）；电子天平（龙腾ESJ-200-4B）；12位水浴型氮吹仪（华盛谱信QF-3800）；超声波清洗器（昆山市超声仪器KQ-5200E）；旋转蒸发器（亚荣生化仪器RE-52AA）。
1.3 标准液配制
分别称取每种性激素标准品10.0 mg，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶，配制成质量浓度为1 000 mg/L的母液，于-20 ℃冰箱避光保存，放置时间不宜超过半年。再用甲醇将其稀释成质量浓度为1 mg/L的中间储备液。使用时，根据实际操作要求，用甲醇稀释上述标准储备溶液，配制成不同浓度的标准工作液。
1.4 仪器参数
1.4.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm），柱温：40 ℃，进样体积：10 μL，流量：0.3 mL/min。按表1和表2进行梯度洗脱。
1.4.2 质谱条件
多反应监测（MRM）模式，电喷雾离子源（ESI）；干燥气流量：10 mL/min；干燥气温度：350 ℃；雾化器压力：35 psi（1 psi=6.895 kPa）；毛细管电压：正模式4 000 V，负模式3 500 V；其余质谱参数见表3。
1.5 样品处理
1.5.1 提 取
称取5.0 g的牛奶试样，置于50 mL离心管中，加入25 mL甲醇，旋涡混匀1 min，超声振荡15 min，于7 000 r/min条件下离心15 min，将上清液置于鸡心瓶中，加入20 mL正己烷萃取两次，去掉正己烷层后于45 ℃水浴上旋转蒸干，残渣用5 mL甲醇和20 mL水充分溶解，溶液用于固相萃取。
1.5.2 净 化
Oasis HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化后，将试样溶液过柱，再用5 mL水淋洗，用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，加入1 mL甲醇，旋涡振荡1 min，过0.22 μm滤膜，滤液置于进样瓶中，待上机进行LC/MS分析。
2 结果与分析
2.1 提取液的选择
常用提取剂有水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等[12-13]，近年来研究以甲醇和乙腈为提取剂效果显著[14]。本实验分别对比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯。其中，乙酸乙酯提取后乳化现象比较严重，7 000 r/min离心15 min后仍无明显效果；乙腈和甲醇提取的峰面积无显著差异，综合考虑到试剂毒性等因素，最终选择甲醇作为提取液。
2.2 流动相的选择
质谱测定性激素常用流动相为甲醇和水或者乙腈和水，本文中除雌激素外的其他性激素的流动相为甲醇和水，由于甲醇为流动相各激素的响应信号要高于乙腈，故选择甲醇和水。其中添加甲酸的目的是有利于目标物质的离子化，本文对比了不同体积分数的甲酸溶液（0.05%、0.1%、0.2%和0.3%），从各激素的响应值得出最适的甲酸溶液的体积分数。实验发现，从0.05%～0.1%时，各激素的响应值逐渐增加，从0.1%～0.3%时，各激素的响应值不断降低，所以当体积分数为0.1%时，目标化合物的响应值最适。检测雌激素的流动相为乙腈和水（0.1%的氨水），实验表明，0.1%氨水有效地提高了雌激素的质谱响应。
2.3 固相萃取柱的选择
本实验选用固相萃取（SPE）方式净化样品，实验中选择了Waters Oasis HLB、DIKMA ProElut C18及Agilent Bond Elut PLEXA 3种SPE小柱，通过加标回收率来选择合适的小柱，加标浓度为100 μg/L，结果3种固相萃取柱对于9种性激素的加标回收率范围分别为70.4%～96%，30%～60.2%和34.5%～71.8%。因此，最终选择Waters Oasis HLB小柱。
2.4 加标回收率和检出限（LODs）线性关系、方法回收率与精密度
按上述处理方法，配制各激素系列的混标溶液，质量浓度为2.5～500 μg/L，以定量离子的峰面积为纵坐标，以相对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，得出线性回归方程，相关系数均大于0.994 4，表明各激素在质量浓度为2.5～500 μg/L范围内呈现良好的线性关系，如表4所示。
取牛奶样品做回收率实验，在5.0 g牛奶中添加不同浓度的混合标准溶液，性激素添加水平为50，
100 μg/kg，每个添加水平平行检测6次（n=6）。按上述实验過程处理后，得出各激素的回收率和变异系数（CV），结果如表5所示。
2.5 样品分析
用建立的方法对四川某牧场随机采集的牛奶样品进行检测，随机选取健康无抗生素使用、无激素类药物使用且处在不同泌乳时期的荷斯坦奶牛90头，每头牛分别采集50 mL，跟踪采集10头牛分娩后1～7 d的初乳。采集到的牛奶样品-20 ℃密封保存，检测时，解冻即可。检测结果如表6所示。 由表6可以看出，牛初乳中激素种类较多，且随天数的增加有下降趋势，其中3种内源性激素：17α-雌二醇、雌酮、雌三醇到第3天以后均未检出，丙酸睾酮第4天后也未检出。初乳中激素种类较多且含量较高，这主要来源于奶牛的人工授精以及自身妊娠期的分泌。
检测发现常乳（共90头：牛只胎次以1次为主，涵盖1～4胎次；其中牛只泌乳期涵盖1～10个月）中含有3种性激素，3种激素分别为醋酸甲羟孕酮、甲睾酮和诺龙。醋酸甲羟孕酮主要集中在泌乳初期的第1个月，其中该激素含量的变化范围为0.25～1.55 μg/kg。甲睾酮主要集中在泌乳初期第1～2月，该激素含量的变化范围为0.22～3.43 μg/kg。诺龙集中在泌乳初期第1个月，该激素含量变化范围是0.56～3.74 μg/kg。由此可见，牛奶中这3种激素的降解速度较慢。
初乳测定结果与范志影等[15]关于内源性激素的报道一致，雌酮：3220 ng/kg，17α-雌二醇：727 ng/kg，雌三醇：167 ng/kg。对常乳的报道较少，曹劲松等[16]研究表明常乳中存在一定含量的雌激素，其中雌三醇为9～31 pg/mL。目前测定均为市售牛奶样品，张艳等[17]研究检测出孕酮及17α-雌二醇，本研究中常乳经检测并未检出此类激素。
3 结束语
本实验建立了固相萃取-液相色谱串联质谱法测定牛奶中9 种性激素多残留的方法。其中3种雌激素和其余性激素分别采用不同离子模式均得到较好分离。应用建立的方法对四川某牧场牛初乳以及常乳进行检测，检测到3种性激素，并主要存在于泌乳期前2个月，结果表明并未检测出常见的内源性雌激素，可能是方法检出限略高的原因[18]。由于牛奶是激素摄入的主要来源之一，因此加强对牛奶中激素的检测十分必要。经验证该方法操作简单、准确度高，可作为牛奶中性激素测定的检测方法，也可为其他乳制品中性激素的检测提供方法参考。
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（编辑：徐柳）