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摘要：目的研究茶叶中天然抗氧化剂—茶多酚的最佳提取条件。方法对不同茶叶采用加热回流、常温浸提、70℃温浸、超声、重复提取等方法。以提取物的量为评价标准，优选出提取粗茶多酚的最佳提取工艺，采用紫外-可见分光光度法测定其茶多酚含量。结果超声和多次重复提取对茶多酚的提取效率最佳。结论超声和多次重复提取法作为茶叶中茶多酚含量测定的前处理方法，方法简单、快速。
关键词：茶叶；提取；茶多酚溶出量；没食子酸；含量比较
中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）09-0066-03
茶是人们日常生活中一种常见的保健饮品，而我国是世界上主要产茶国之一，也是最先发现和利用茶叶的国家[1]。茶叶（Camellia sinensis.L）的药用价值历史悠久，历代药书中均有茶叶入药的记载，中国茶书和中医古籍，对茶的医疗保健作用，都是高度重视和推崇，现存最早的药物经典《神农本草经》记载：“神农尝百草，日遇七十二毒，得茶乃解”。唐代陈藏器在《本草拾遗》中说：“诸药为各病之药，茶为万病之药”。明朝李时珍在《本草纲目》中记载说：“茶苦而寒，最能降火，火为百病之因，火降则百病清也”，顾元庆《茶谱》记载：“饮茶能止渴、消食、除痰、少睡、利尿道、明目益思、除烦、去腻，人固不可一日无茶”[2]。近年来，国内外的大量研究表明，茶叶具有抗癌[3]、抗突变[4]、抗衰老、消除自由基[5]、抗氧化[6～7]、降血压、降血脂[8～9]、降血糖乃至抗艾滋病等多种功效[10]。说明茶具有独特的药理作用，该作用是由茶叶中特定的化学成分决定的。研究表明，在这些物质中起主导作用的是一种多羟基酚类物质，即茶多酚（Tea-Polyphenols，简称TP）。
茶多酚是一类存在于茶树中的多羟基酚类化合物的混合物，简称茶多酚，俗名茶单宁、茶鞣质。茶多酚纯品为白色无定形粉末，易溶于热水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，微溶于油脂。难溶于苯、氯仿、石油醚。儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，也是茶叶的特有成分[11～12]。茶多酚中几种含量较高的儿茶素分别是：左旋-表没食子儿茶素没食子酸酯（L-EGCG），左旋–表儿茶素没食子酸酯（L-ECG），左旋-表没食子儿茶素（L-EGC），左旋-表儿茶素（L-EC）。茶多酚是一类具有2-连（或邻）苯酚基苯并吡喃衍生物。
本文从不同溶剂、不同提取方法等多重影响因素下提取茶多酚，茶多酚的检测原理是依据《GB/T 8313-2008 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，福林酚试剂氧化茶多酚中-OH基团并显蓝色在波长λ=765nm处有最大吸收峰，用没食子酸作校正标准定量茶多酚。用紫外-见分光光度法分析测定茶多酚的溶出量，对茶多酚的溶出量进行对比，以期能为茶叶中茶多酚的提取、分析测定有一定帮助。
1实验材料与仪器
1.1主要实验材料与试剂市售绿茶与发酵茶样品；福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂（Sigma-Aldrich公司 F9252）；无水碳酸钠；没食子酸对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110931-200302）；水为实验室自制重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
1.2主要仪器和设备岛津UV-160A型紫外可见光分光光度计；XMT-DA数显恒温水浴锅；岛津AEL-200型电子分析天平；TGL-10B型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；HU10300F超声波清洗器（天津恒奥）。
2实验方法
2.1溶液的配制10%福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂（现配）将20 mL福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂转移至200 mL容量瓶中，用水定容并摇匀即得。7.5%Na2CO3溶液配制 称取（37.50±0.01）g Na2CO3，加水适量使溶解，转移至500 mL容量瓶中，定容至刻度并摇匀即得。没食子酸标准储备溶液（1000 ug/mL现配）称取（0.025±0.001）g没食子酸（GA，相对分子质量188.14），于25 mL容量瓶中加水适量使溶解，并定容至刻度，摇匀即得。没食子酸工作液 用移液管分别移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的没食子酸标准储备溶液于100 mL容量瓶中，分别用水定容至刻度，摇匀，10，20，30，40，50 ug/mL。
2.2供试液的制备
2.2.1粗茶多酚的提取精密称取粉碎后绿茶、发酵茶样品3.0 g（精确到0.0001 g），分别加入20 mL溶剂（H2O、70%乙醇、30%乙醇）分别以超声30 min、加热回流30 min、温浸30 min、70℃温浸24 h、常温浸提48 h（重复提取3次）提取茶多酚，提取结束后在70℃下蒸干提取剂，即得茶多酚粗提物。
2.2.2母液的制备称取0.2 g（精确到0.0001 g）茶多酚粗提物于10 mL离心管中，加入在70℃中预热过的70%甲醇溶液5 mL，用玻璃棒充分搅拌均匀润湿，立即移入70℃水浴中，浸提10 min（隔5 min搅拌1次），浸提后冷却至室温，转入离心机在3500 r/min转速下离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶。残渣再用70%甲醇溶液提取1次，重复以上操作。合并提取液定容至10 mL，摇匀，用0.45 um膜，待用。
2.2.3测试液的制备移取母液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，待测。
2.3测定
2.3.1方法步骤用移液管分别移取没食子酸工作液、水（作空白对照用）及测试液各1.0 mL于刻度试管内，在每个试管内分别加入5.0 mL的10%福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂，摇匀。反应4 min后，加入4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，加水定容至刻度、摇匀。室温下放置60 min。用10 mm比色皿、在765 nm波长条件下用分光光度计测定吸光度（A）。 2.3.2没食子酸含量标准曲线的绘制按测定方法“4.3.1”根据没食子酸工作液的吸光度（A）与各工作液的没食子酸浓度，制作标准曲线，结果如图2。回归方程为：y=0.1086x+0.0093（R2=0.9987）。
4分析与讨论
植物有效成分溶剂提取的原理是：根据植物中各种成分在溶剂中的溶解性质，用对有效成分溶解度大，对无效成分溶解度小的溶剂将有效成分从植物组织中溶出，当溶剂加到植物原料中时，溶剂扩散渗透通过细胞壁进入细胞内，可溶性物质溶解，造成细胞内外的浓度差，以此为推动力使细胞内可溶性物质向溶液主体扩散，至细胞内外有效成分浓度达到动态平衡滤出溶液。
4.1加大茶多酚的溶出量的措施
4.1.1增加主体溶液与相界面之间有效成分的浓度差有效成分浓度差是推动提取进行的主要因素，根据Fick第一扩散定律，浓度差越大，提取的传质推动力就越大，提取速率就越快，实验中表现为采用多次重复浸提。
4.1.2加大材料颗粒与溶剂固液两相的相对运动加强两相间的相对运动，可以减少固相边界上液膜的厚度降低边界层阻力，并使液膜不断更新，从而提高浓度差，增大提取推动力提高传质速率，实验中表现为采用超声波提取。
4.1.3适当提高提取温度对大多数物质而言，升高温度可以加大物质的溶解度，而且根据Stokes—Einstein 公式可知温度升高，溶液黏度下降，扩散系数就增大，可提高有效成分的扩散速率，从而提高提取速率，温度升高，扩散系数增大，但是温度太高又会使过多的杂质同时提出，或者对热敏性有效成分有破坏作用，实验中表现为加热回流提取和70℃温浸浸提。
4.2实验中涉及提取方法的优缺点
4.2.1浸渍法提取该法是将物料粉碎后装入容器中加入溶剂浸渍物料以溶出有效成分的方法，在常温下进行，尤其适用于有效成分遇热易破坏及易挥发的物料，但整个过程处于静止状态，提取温度低，有效成分溶解度和传质速率小，存在着提取率低，提取周期长，提取液易发霉变质等缺点。
4.2.2回流提取法该法是在进行加热提取时采用循环冷却装置，使溶剂连续回流，使植物有效成分充分提出的方法，该法溶剂用量少提取率高，但对于受热易破坏的成分提取不适用[21]。
4.2.3超声波浸提超声波浸提是利用超声波的机械破碎和空化作用，物料周围空穴形成、增大和闭合回产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎，增加有效成分的溶出速度和数量，加速茶多酚等浸提物从茶叶向溶剂的扩散速度，从而提高了有效成分的浸提率，缩短浸提时间，超声波浸提的最大优点就是浸提所需的时间短，因此避免了长时间处于高温下茶多酚的氧化，收率和产品质量都较传统方法高[11]。
在实验结果表明，绿茶中提取出的茶多酚要高于在发酵茶中提出的茶多酚，这是由于发酵茶在加工过程中有着一定程度的儿茶素损失。以超声和加热回流提取出茶多酚的溶出量比较，二者同样加大材料颗粒与溶剂固液两相的相对运动，但加热回流提取出的茶多酚反而不如超声提取出的茶多酚，这可能存在的原因是加热回流过程中的温度过高，茶多酚受热氧化损失。又以70℃多次重复提取与70℃温浸两种提取方式所得茶多酚比较，多次重复提取所得要高于70℃温浸，这是多次重复提取法通过多次添加溶剂增加了主体溶液与相界面之间有效成分的浓度差使得茶多酚能通过浓度差尽快的溶于提取溶剂中，加大了提取效率，而70℃温浸在茶多酚溶出一定量后主体溶液与相界面之间有效成分的浓度差变得极小，茶多酚溶出速度变缓或不继续溶出，两种方法比较，多次重复提取耗时短、易操作、提取率高优于70℃温浸，两种方法优选多次重复提取。
参考文献：
[1]刘家红.茶叶有效成分提取分离技术研究进展[J].南方农业，2010（9）：99-101.
[2]李 睿，帅建军.茶多酚的分离提取及其性质研究[J].江苏教育学院学报（自然科学版），2005，25（4）：26-29.
[3]山根哲郎.医学漫步[M].东京：日本医齿药出版株式会社，2000.194-197.
[4]Oguni I，Nasu K，Kanaya S，et al.Epidemiological and experimental studies on the antitumor activity by green tea Extracts[J].Jpn.J.Nutr，1989，47：93-02.
[5]贾之慎.茶多酚抗氧化作用的研究及应用[J].食品科学，1990，11：1-5.
[6]Okuda T，Mori K，Hayatus H.Inhibitory effect of tannines on direct-acting mutagens[J].Chem Pharm Bull，1984，32：3755-3758.
[7]YoshinoK，TomitaI，SanoM，etal.Effects of long-term dietary supplement of tea polyphenols on lipid peroxide levels in Rats[J].Age，1992，17：79-85.
[8]Khan S G，Katiyar S K，Agarwal R，et al.En-Hancement of antioxidant and phase II enzymes by oralfeeding of green tea[J].CancerRes，1992，52：4050-4052.
[9]Muramatsu K，Fukuyo M，Hara Y.Effect of green tea catechins on plasma cholesterol level in cholesterol-fed rats[J].J.Nutr Sci Vitaminol，1986，32：613-622.
[10]HaraY，HondaM，The in hibition of-amylase by tea polyphenols[J].Agric Biol Chem，1990，54（8）：1939-1945.
[11]赵卫星，姜红波，王艳，等.天然抗氧化剂—茶多酚提取、分离和纯化方法[J].广东化工，2010，37（8）：7-8.
[12]李咏梅，王学松，于艳春.茶叶中茶多酚提取方法研究[J].广州化学，2003，25（1）：59-63.
（收稿日期：2014-07-03）
关键词：茶叶；提取；茶多酚溶出量；没食子酸；含量比较
中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）09-0066-03
茶是人们日常生活中一种常见的保健饮品，而我国是世界上主要产茶国之一，也是最先发现和利用茶叶的国家[1]。茶叶（Camellia sinensis.L）的药用价值历史悠久，历代药书中均有茶叶入药的记载，中国茶书和中医古籍，对茶的医疗保健作用，都是高度重视和推崇，现存最早的药物经典《神农本草经》记载：“神农尝百草，日遇七十二毒，得茶乃解”。唐代陈藏器在《本草拾遗》中说：“诸药为各病之药，茶为万病之药”。明朝李时珍在《本草纲目》中记载说：“茶苦而寒，最能降火，火为百病之因，火降则百病清也”，顾元庆《茶谱》记载：“饮茶能止渴、消食、除痰、少睡、利尿道、明目益思、除烦、去腻，人固不可一日无茶”[2]。近年来，国内外的大量研究表明，茶叶具有抗癌[3]、抗突变[4]、抗衰老、消除自由基[5]、抗氧化[6～7]、降血压、降血脂[8～9]、降血糖乃至抗艾滋病等多种功效[10]。说明茶具有独特的药理作用，该作用是由茶叶中特定的化学成分决定的。研究表明，在这些物质中起主导作用的是一种多羟基酚类物质，即茶多酚（Tea-Polyphenols，简称TP）。
茶多酚是一类存在于茶树中的多羟基酚类化合物的混合物，简称茶多酚，俗名茶单宁、茶鞣质。茶多酚纯品为白色无定形粉末，易溶于热水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂，微溶于油脂。难溶于苯、氯仿、石油醚。儿茶素类化合物是茶多酚的主要成分，也是茶叶的特有成分[11～12]。茶多酚中几种含量较高的儿茶素分别是：左旋-表没食子儿茶素没食子酸酯（L-EGCG），左旋–表儿茶素没食子酸酯（L-ECG），左旋-表没食子儿茶素（L-EGC），左旋-表儿茶素（L-EC）。茶多酚是一类具有2-连（或邻）苯酚基苯并吡喃衍生物。
本文从不同溶剂、不同提取方法等多重影响因素下提取茶多酚，茶多酚的检测原理是依据《GB/T 8313-2008 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，福林酚试剂氧化茶多酚中-OH基团并显蓝色在波长λ=765nm处有最大吸收峰，用没食子酸作校正标准定量茶多酚。用紫外-见分光光度法分析测定茶多酚的溶出量，对茶多酚的溶出量进行对比，以期能为茶叶中茶多酚的提取、分析测定有一定帮助。
1实验材料与仪器
1.1主要实验材料与试剂市售绿茶与发酵茶样品；福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂（Sigma-Aldrich公司 F9252）；无水碳酸钠；没食子酸对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：110931-200302）；水为实验室自制重蒸馏水；其余试剂均为分析纯。
1.2主要仪器和设备岛津UV-160A型紫外可见光分光光度计；XMT-DA数显恒温水浴锅；岛津AEL-200型电子分析天平；TGL-10B型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；HU10300F超声波清洗器（天津恒奥）。
2实验方法
2.1溶液的配制10%福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂（现配）将20 mL福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂转移至200 mL容量瓶中，用水定容并摇匀即得。7.5%Na2CO3溶液配制 称取（37.50±0.01）g Na2CO3，加水适量使溶解，转移至500 mL容量瓶中，定容至刻度并摇匀即得。没食子酸标准储备溶液（1000 ug/mL现配）称取（0.025±0.001）g没食子酸（GA，相对分子质量188.14），于25 mL容量瓶中加水适量使溶解，并定容至刻度，摇匀即得。没食子酸工作液 用移液管分别移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的没食子酸标准储备溶液于100 mL容量瓶中，分别用水定容至刻度，摇匀，10，20，30，40，50 ug/mL。
2.2供试液的制备
2.2.1粗茶多酚的提取精密称取粉碎后绿茶、发酵茶样品3.0 g（精确到0.0001 g），分别加入20 mL溶剂（H2O、70%乙醇、30%乙醇）分别以超声30 min、加热回流30 min、温浸30 min、70℃温浸24 h、常温浸提48 h（重复提取3次）提取茶多酚，提取结束后在70℃下蒸干提取剂，即得茶多酚粗提物。
2.2.2母液的制备称取0.2 g（精确到0.0001 g）茶多酚粗提物于10 mL离心管中，加入在70℃中预热过的70%甲醇溶液5 mL，用玻璃棒充分搅拌均匀润湿，立即移入70℃水浴中，浸提10 min（隔5 min搅拌1次），浸提后冷却至室温，转入离心机在3500 r/min转速下离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶。残渣再用70%甲醇溶液提取1次，重复以上操作。合并提取液定容至10 mL，摇匀，用0.45 um膜，待用。
2.2.3测试液的制备移取母液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，待测。
2.3测定
2.3.1方法步骤用移液管分别移取没食子酸工作液、水（作空白对照用）及测试液各1.0 mL于刻度试管内，在每个试管内分别加入5.0 mL的10%福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂，摇匀。反应4 min后，加入4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，加水定容至刻度、摇匀。室温下放置60 min。用10 mm比色皿、在765 nm波长条件下用分光光度计测定吸光度（A）。 2.3.2没食子酸含量标准曲线的绘制按测定方法“4.3.1”根据没食子酸工作液的吸光度（A）与各工作液的没食子酸浓度，制作标准曲线，结果如图2。回归方程为：y=0.1086x+0.0093（R2=0.9987）。
4分析与讨论
植物有效成分溶剂提取的原理是：根据植物中各种成分在溶剂中的溶解性质，用对有效成分溶解度大，对无效成分溶解度小的溶剂将有效成分从植物组织中溶出，当溶剂加到植物原料中时，溶剂扩散渗透通过细胞壁进入细胞内，可溶性物质溶解，造成细胞内外的浓度差，以此为推动力使细胞内可溶性物质向溶液主体扩散，至细胞内外有效成分浓度达到动态平衡滤出溶液。
4.1加大茶多酚的溶出量的措施
4.1.1增加主体溶液与相界面之间有效成分的浓度差有效成分浓度差是推动提取进行的主要因素，根据Fick第一扩散定律，浓度差越大，提取的传质推动力就越大，提取速率就越快，实验中表现为采用多次重复浸提。
4.1.2加大材料颗粒与溶剂固液两相的相对运动加强两相间的相对运动，可以减少固相边界上液膜的厚度降低边界层阻力，并使液膜不断更新，从而提高浓度差，增大提取推动力提高传质速率，实验中表现为采用超声波提取。
4.1.3适当提高提取温度对大多数物质而言，升高温度可以加大物质的溶解度，而且根据Stokes—Einstein 公式可知温度升高，溶液黏度下降，扩散系数就增大，可提高有效成分的扩散速率，从而提高提取速率，温度升高，扩散系数增大，但是温度太高又会使过多的杂质同时提出，或者对热敏性有效成分有破坏作用，实验中表现为加热回流提取和70℃温浸浸提。
4.2实验中涉及提取方法的优缺点
4.2.1浸渍法提取该法是将物料粉碎后装入容器中加入溶剂浸渍物料以溶出有效成分的方法，在常温下进行，尤其适用于有效成分遇热易破坏及易挥发的物料，但整个过程处于静止状态，提取温度低，有效成分溶解度和传质速率小，存在着提取率低，提取周期长，提取液易发霉变质等缺点。
4.2.2回流提取法该法是在进行加热提取时采用循环冷却装置，使溶剂连续回流，使植物有效成分充分提出的方法，该法溶剂用量少提取率高，但对于受热易破坏的成分提取不适用[21]。
4.2.3超声波浸提超声波浸提是利用超声波的机械破碎和空化作用，物料周围空穴形成、增大和闭合回产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎，增加有效成分的溶出速度和数量，加速茶多酚等浸提物从茶叶向溶剂的扩散速度，从而提高了有效成分的浸提率，缩短浸提时间，超声波浸提的最大优点就是浸提所需的时间短，因此避免了长时间处于高温下茶多酚的氧化，收率和产品质量都较传统方法高[11]。
在实验结果表明，绿茶中提取出的茶多酚要高于在发酵茶中提出的茶多酚，这是由于发酵茶在加工过程中有着一定程度的儿茶素损失。以超声和加热回流提取出茶多酚的溶出量比较，二者同样加大材料颗粒与溶剂固液两相的相对运动，但加热回流提取出的茶多酚反而不如超声提取出的茶多酚，这可能存在的原因是加热回流过程中的温度过高，茶多酚受热氧化损失。又以70℃多次重复提取与70℃温浸两种提取方式所得茶多酚比较，多次重复提取所得要高于70℃温浸，这是多次重复提取法通过多次添加溶剂增加了主体溶液与相界面之间有效成分的浓度差使得茶多酚能通过浓度差尽快的溶于提取溶剂中，加大了提取效率，而70℃温浸在茶多酚溶出一定量后主体溶液与相界面之间有效成分的浓度差变得极小，茶多酚溶出速度变缓或不继续溶出，两种方法比较，多次重复提取耗时短、易操作、提取率高优于70℃温浸，两种方法优选多次重复提取。
参考文献：
[1]刘家红.茶叶有效成分提取分离技术研究进展[J].南方农业，2010（9）：99-101.
[2]李 睿，帅建军.茶多酚的分离提取及其性质研究[J].江苏教育学院学报（自然科学版），2005，25（4）：26-29.
[3]山根哲郎.医学漫步[M].东京：日本医齿药出版株式会社，2000.194-197.
[4]Oguni I，Nasu K，Kanaya S，et al.Epidemiological and experimental studies on the antitumor activity by green tea Extracts[J].Jpn.J.Nutr，1989，47：93-02.
[5]贾之慎.茶多酚抗氧化作用的研究及应用[J].食品科学，1990，11：1-5.
[6]Okuda T，Mori K，Hayatus H.Inhibitory effect of tannines on direct-acting mutagens[J].Chem Pharm Bull，1984，32：3755-3758.
[7]YoshinoK，TomitaI，SanoM，etal.Effects of long-term dietary supplement of tea polyphenols on lipid peroxide levels in Rats[J].Age，1992，17：79-85.
[8]Khan S G，Katiyar S K，Agarwal R，et al.En-Hancement of antioxidant and phase II enzymes by oralfeeding of green tea[J].CancerRes，1992，52：4050-4052.
[9]Muramatsu K，Fukuyo M，Hara Y.Effect of green tea catechins on plasma cholesterol level in cholesterol-fed rats[J].J.Nutr Sci Vitaminol，1986，32：613-622.
[10]HaraY，HondaM，The in hibition of-amylase by tea polyphenols[J].Agric Biol Chem，1990，54（8）：1939-1945.
[11]赵卫星，姜红波，王艳，等.天然抗氧化剂—茶多酚提取、分离和纯化方法[J].广东化工，2010，37（8）：7-8.
[12]李咏梅，王学松，于艳春.茶叶中茶多酚提取方法研究[J].广州化学，2003，25（1）：59-63.
（收稿日期：2014-07-03）