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摘 要 目的：探讨肿瘤坏死因子TNFβG252A基因多态性与子宫内膜异位症的关系。方法：运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction- restriction fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP）技术检测子宫内膜异位症100例及正常100人肿瘤坏死因子TNFβG252A基因多态性。结果：TNFβG252A基因型频率和等位基因频率在两组之间分别为23.0和25.0，58.0和57.0，19.0和18.0，52.5和53.5，47.5和46.5，差异无显著性（P＞0.05）。结论：肿瘤坏死因子TNFβG252A基因多态性与子宫内膜异位症无差。
关键词 子宫内膜异位症 肿瘤坏死因子TNFβG252A 基因多态性
TNFβG252A Polymorphisnis in Patients with Endometriosis
ZENG Gai-hong1,HUANG Xiao-dong1,PENG lv-bing1,YU Zhi-hui1,CHE Kun-lan2,CHEN Sheng-qiang2.1.The Affiliated Baoan District Hospital,Southern Medical University,Shenzhen Guangdong 518101,China;2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou Guangdong 510260,China
AbstractObjective:To investigate the relationship between tumor necrosis factor（TNF）polymorphism and endometriosis.Methods:The polymorphism of TNFβG252A was screened by PCR-RELP in 100 patients with endometriosis compared with 100 normal controls.Results:There was no significant difference in the frequencies of TNFβG252A gene between the patients and control group（P＞0.05）.Conclusion:No evident association was found between TNFβG252A polymorphism and endometriosis.
Key wordsendometriosis;TNFβG252A;gene polymorphism
子宫内膜异位症（endometriosis，简称内异症）是育龄妇女的一种多发病，主要引起不孕、痛经及慢性盆腔痛等。目前研究较多是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）基因与内异症发病关系的研究上［1，2］。我们利用PCR-RFLP技術对子宫内膜异位症患者和正常对照者的TNFβG252A基因进行检测，探讨其与子宫内膜异位症遗传易感的关系。
资料与方法
一般资料：内异症组，2007年9月～2008年9月100例，Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期55例；年龄18～48岁，平均34岁。对照组，随机选择健康妇女，查体无遗传家族史，无肿瘤及子宫内膜异位等疾病100例，年龄23～51岁，平均34岁。两组妇女的年龄、职业等分布均衡，无遗传病家族史，具有可比性。
方法：取EDTA抗凝全血2ml于15ml的离心管中，加入RBC裂解液（自配，含pH7.6的Tris-HCl 0.01mol/L，NaCl 0.01mol/L，MgCl2 0.005mol/L）6ml，振荡混匀2500r/分离心15分钟，弃上清留约1ml，再加核裂解液（自配，含pH 7.6的Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 400nmol/L，Na2EDTA 2mmol/L）1ml，振荡混匀后2500转/分离心15分钟，弃上清用生理盐水洗涤沉淀2次，于沉淀中加入TE150μl，100g/L SDS 15μl以及10g/L蛋白酶K 20μl，37℃水浴消化过夜，消化液加入6mol/L NaCl 235μl，5000r/分离心10分钟得上清，于其中加入无水乙醇860μl，可见絮状DNA沉淀，5000r/分离心10分钟，弃上清，用700ml/L乙醇再洗涤1次，沉淀加入TE 100μL即成样本DNA溶液，抽样紫外分光光度法测定浓度。TNFβG252A扩增所用引物序列为TNF1：5′-CCGTGCTTGGTGCTTTGGACTA-3′和TNF2：5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′，引物由大连宝生物工程有限公司合成。PCR体系总体积为30μl，其中包括DNA模板5μl，2mmol/L dNTP 2μl，10×PCR缓冲液4μl，上、下游引物各0.2μmol/L，TaqDNA聚合酶。PCR反应条件为94℃预变性10分钟，然后于94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 45秒，共30个循环，再于72℃延伸5分钟。取PCR产物25μl，加NcoI内切酶1μl，10×酶切缓冲液3μl，加ddH2O补至总体积30μl，37℃酶切12小时。取酶切产物30μl加入30g/L琼脂糖凝胶的负极端加样孔中，以溴化乙锭（EB）为染色剂，于100V电泳30分钟后取出，在波长300nm紫外灯下观察带型。
统计学方法：用直接计数法计算各组等位基因和基因型频率分布；两组之间等位基因和基因型频率比较用X>/sup>2检验，（P＜0.05）为检验水准，有统计学意义。
结 果
标本经PCR/RFLP后可产生3种酶切格局：①TNFβG252*2纯合子的标本，其PCR产物经NcoI消化后不产生酶切，则电泳后只出现740bp 1根条带；②TNFβG252*1纯合子产生完全酶切，则出现555bp和185bp 2根条带；③TNFβG252*1/TNFβG252*2杂合子产生部分酶切，则出现740，555和185bp 3根条带（图1）。TNFβG252A各种基因型频率及等位基因频率在两组之间无统计学意义（P＞0.05）。见图1。
图1 TNFβG252A等位基因产物琼脂糖凝胶电泳
M：DL1000 DNA分子量标记，4：TNFβG252A 1/1纯合子基因型；1，2，3，5：TNFβG252A 1/2杂合子基因型；6：TNFβG252A2/2纯合子基因型。
子宫内膜异位症组与对照组TNFβG252A基因型频率与等位基因频率的分布，见表1。
讨 论
内异症发病机制迄今尚不明确，除子宫内膜种植学说、淋巴及静脉播散学说及体腔上皮化生学说外，目前研究的热点有诱导因素、遗传因素及免疫调控因子论等。有研究认为其可能是由多位点基因和环境因素相互作用导致的一种遗传性疾病，内异症的发病与患者个体存在遗传易感性相关［1，2］。近年来随着内异症发病与细胞因子相关性研究的深入，TNF与内异症的关系已日益受到重视。TNF基因具有多态性，这种多态性与自身免疫、肿瘤等疾病TNF水平特征性增高有密切关系。TNF基因位点位于6号染色体短臂（6p21.1～p22），TNF有较多的多态性位点。启动子区的一些SNPs可能影响到转录活性，体外研究显示TNF-α308A等位基因的细胞可以释放较高水平的TNF。TGFβ在多种疾病的发生发展中起了重要作用，是一种具有多功能生物学活性的细胞因子，在调节细胞外基质代谢，参与炎症反应、间质纤维化等方面起重要作用［3，4］。罗敏等［5］研究发现，TNF-β基因+252位点上等位基因A可以使患内异症的相对危险度明显提高。我们的研究结果表明，TNFβG252A基因位点突变在內异症患者组及正常对照组之间无差异，与Lu等［6］研究结果相同。
参考文献
1 CLAYTON R D,DUFFY S R,WILKINSON N,et al.Anti-proliferative effect of mycobacteria,IFN-gamma and TNF-alpha on primary cultures derived from endometrial stroma:possible relevance to endometriosis［J］.Reprod Immunol,2004,51（1）:63-70.
2 BIRNBAUM L S,CUMMINGS A M.Dioxins and endometriosis:a plausible hypothesis［J］.Environ Health Perspect,2002,110（1）:15-21.
3 张良,奚庆华,鞠少卿.肿瘤坏死因子β基因多态性与江苏子宫内膜异位症患者的相关性研究［J］.医学检验与临床,2008,19（6）:10.
4 WIESER F,FABJANI G,TEMPFER C,et al.Tumor necrosis factor- promotor polymorphisms and endometriosis［J］.J Soc Gynecol Invest,2002,9（5）:313-318.
5 罗敏,何援利,张宏斌,等.广东妇女子宫内膜异位症与肿瘤坏死因子-β基因多态性的相关性研究［J］.南方医科大学学报,2006,26（8）:163.
6 LU D H,LIN J,DENG L.Association between susceptibility of endometriosis and the gene polymorphism of tumor necrosis factor［J］.Zhonghua Yixue Za Zhi,2008,88（15）:1032-1035.
表1 两组TNFβG252A基因型频率与等位基因频率分布［n100，n（%）］
关键词 子宫内膜异位症 肿瘤坏死因子TNFβG252A 基因多态性
TNFβG252A Polymorphisnis in Patients with Endometriosis
ZENG Gai-hong1,HUANG Xiao-dong1,PENG lv-bing1,YU Zhi-hui1,CHE Kun-lan2,CHEN Sheng-qiang2.1.The Affiliated Baoan District Hospital,Southern Medical University,Shenzhen Guangdong 518101,China;2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou Guangdong 510260,China
AbstractObjective:To investigate the relationship between tumor necrosis factor（TNF）polymorphism and endometriosis.Methods:The polymorphism of TNFβG252A was screened by PCR-RELP in 100 patients with endometriosis compared with 100 normal controls.Results:There was no significant difference in the frequencies of TNFβG252A gene between the patients and control group（P＞0.05）.Conclusion:No evident association was found between TNFβG252A polymorphism and endometriosis.
Key wordsendometriosis;TNFβG252A;gene polymorphism
子宫内膜异位症（endometriosis，简称内异症）是育龄妇女的一种多发病，主要引起不孕、痛经及慢性盆腔痛等。目前研究较多是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）基因与内异症发病关系的研究上［1，2］。我们利用PCR-RFLP技術对子宫内膜异位症患者和正常对照者的TNFβG252A基因进行检测，探讨其与子宫内膜异位症遗传易感的关系。
资料与方法
一般资料：内异症组，2007年9月～2008年9月100例，Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期55例；年龄18～48岁，平均34岁。对照组，随机选择健康妇女，查体无遗传家族史，无肿瘤及子宫内膜异位等疾病100例，年龄23～51岁，平均34岁。两组妇女的年龄、职业等分布均衡，无遗传病家族史，具有可比性。
方法：取EDTA抗凝全血2ml于15ml的离心管中，加入RBC裂解液（自配，含pH7.6的Tris-HCl 0.01mol/L，NaCl 0.01mol/L，MgCl2 0.005mol/L）6ml，振荡混匀2500r/分离心15分钟，弃上清留约1ml，再加核裂解液（自配，含pH 7.6的Tris-HCl 10mmol/L，NaCl 400nmol/L，Na2EDTA 2mmol/L）1ml，振荡混匀后2500转/分离心15分钟，弃上清用生理盐水洗涤沉淀2次，于沉淀中加入TE150μl，100g/L SDS 15μl以及10g/L蛋白酶K 20μl，37℃水浴消化过夜，消化液加入6mol/L NaCl 235μl，5000r/分离心10分钟得上清，于其中加入无水乙醇860μl，可见絮状DNA沉淀，5000r/分离心10分钟，弃上清，用700ml/L乙醇再洗涤1次，沉淀加入TE 100μL即成样本DNA溶液，抽样紫外分光光度法测定浓度。TNFβG252A扩增所用引物序列为TNF1：5′-CCGTGCTTGGTGCTTTGGACTA-3′和TNF2：5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′，引物由大连宝生物工程有限公司合成。PCR体系总体积为30μl，其中包括DNA模板5μl，2mmol/L dNTP 2μl，10×PCR缓冲液4μl，上、下游引物各0.2μmol/L，TaqDNA聚合酶。PCR反应条件为94℃预变性10分钟，然后于94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 45秒，共30个循环，再于72℃延伸5分钟。取PCR产物25μl，加NcoI内切酶1μl，10×酶切缓冲液3μl，加ddH2O补至总体积30μl，37℃酶切12小时。取酶切产物30μl加入30g/L琼脂糖凝胶的负极端加样孔中，以溴化乙锭（EB）为染色剂，于100V电泳30分钟后取出，在波长300nm紫外灯下观察带型。
统计学方法：用直接计数法计算各组等位基因和基因型频率分布；两组之间等位基因和基因型频率比较用X>/sup>2检验，（P＜0.05）为检验水准，有统计学意义。
结 果
标本经PCR/RFLP后可产生3种酶切格局：①TNFβG252*2纯合子的标本，其PCR产物经NcoI消化后不产生酶切，则电泳后只出现740bp 1根条带；②TNFβG252*1纯合子产生完全酶切，则出现555bp和185bp 2根条带；③TNFβG252*1/TNFβG252*2杂合子产生部分酶切，则出现740，555和185bp 3根条带（图1）。TNFβG252A各种基因型频率及等位基因频率在两组之间无统计学意义（P＞0.05）。见图1。
图1 TNFβG252A等位基因产物琼脂糖凝胶电泳
M：DL1000 DNA分子量标记，4：TNFβG252A 1/1纯合子基因型；1，2，3，5：TNFβG252A 1/2杂合子基因型；6：TNFβG252A2/2纯合子基因型。
子宫内膜异位症组与对照组TNFβG252A基因型频率与等位基因频率的分布，见表1。
讨 论
内异症发病机制迄今尚不明确，除子宫内膜种植学说、淋巴及静脉播散学说及体腔上皮化生学说外，目前研究的热点有诱导因素、遗传因素及免疫调控因子论等。有研究认为其可能是由多位点基因和环境因素相互作用导致的一种遗传性疾病，内异症的发病与患者个体存在遗传易感性相关［1，2］。近年来随着内异症发病与细胞因子相关性研究的深入，TNF与内异症的关系已日益受到重视。TNF基因具有多态性，这种多态性与自身免疫、肿瘤等疾病TNF水平特征性增高有密切关系。TNF基因位点位于6号染色体短臂（6p21.1～p22），TNF有较多的多态性位点。启动子区的一些SNPs可能影响到转录活性，体外研究显示TNF-α308A等位基因的细胞可以释放较高水平的TNF。TGFβ在多种疾病的发生发展中起了重要作用，是一种具有多功能生物学活性的细胞因子，在调节细胞外基质代谢，参与炎症反应、间质纤维化等方面起重要作用［3，4］。罗敏等［5］研究发现，TNF-β基因+252位点上等位基因A可以使患内异症的相对危险度明显提高。我们的研究结果表明，TNFβG252A基因位点突变在內异症患者组及正常对照组之间无差异，与Lu等［6］研究结果相同。
参考文献
1 CLAYTON R D,DUFFY S R,WILKINSON N,et al.Anti-proliferative effect of mycobacteria,IFN-gamma and TNF-alpha on primary cultures derived from endometrial stroma:possible relevance to endometriosis［J］.Reprod Immunol,2004,51（1）:63-70.
2 BIRNBAUM L S,CUMMINGS A M.Dioxins and endometriosis:a plausible hypothesis［J］.Environ Health Perspect,2002,110（1）:15-21.
3 张良,奚庆华,鞠少卿.肿瘤坏死因子β基因多态性与江苏子宫内膜异位症患者的相关性研究［J］.医学检验与临床,2008,19（6）:10.
4 WIESER F,FABJANI G,TEMPFER C,et al.Tumor necrosis factor- promotor polymorphisms and endometriosis［J］.J Soc Gynecol Invest,2002,9（5）:313-318.
5 罗敏,何援利,张宏斌,等.广东妇女子宫内膜异位症与肿瘤坏死因子-β基因多态性的相关性研究［J］.南方医科大学学报,2006,26（8）:163.
6 LU D H,LIN J,DENG L.Association between susceptibility of endometriosis and the gene polymorphism of tumor necrosis factor［J］.Zhonghua Yixue Za Zhi,2008,88（15）:1032-1035.
表1 两组TNFβG252A基因型频率与等位基因频率分布［n100，n（%）］