HPLC法测定银杏叶中黄酮的含量

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  摘 要:用高效液相色谱仪测定阆中市银杏叶中黄酮的含量,黄酮甙由70%乙醇一水提取,并用盐酸溶液水解。采用VP-ODSC8柱(150mm×4.6mm,5?m),流动相为甲醇:水(0.3%磷酸)=55:45体系,流速为1mL·min-1,检验波长为360nm,以槲皮素为标准品,在0.0050~0.1000g·L-1范围内,成很好的线形关系,相关系数为0.9995,RSD为1.1%,结果表明:银杏叶中总黄酮平均含量为0.1356%。
  关键词:高效液相色谱;黄酮;银杏叶;水解
  1前言
  目前,银杏叶中黄酮的提取方法有以下几种:(1)水提取法(2)有机溶剂提取法(3)有机溶剂提取---树脂净化法(4)超临界CO2提取法。由于除水提取法外其余几种提取方法不是耗用大量的有机溶剂,操作复杂就是设备昂贵,不利推广。因此,在本课题中,选用设备简单,操作简捷的水提取法。
  2实验部分
  2.1主要仪器与试剂
  主要材料:乐山市中区的银杏叶
  主要仪器:日本岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪;VP-ODS色谱柱(150mm×4.6mm,5?m)
  提取装置:带回流管的圆底烧瓶
  提取试剂:7O%(V/V)乙醇一水溶液250mL;取95%乙醇184mL加入66mL蒸馏水来配制
  槲皮素标准溶液:0.2000g·L-1;称取槲皮素对照品0.02000g于100mL容量瓶中,用甲醇溶解定容至刻度
  二次亚沸蒸馏水无水乙醇甲醇均分析醇
  2.2试验方法
  2.2.1标准工作曲线制作
  移取槲皮素标准储备液1.25,2.5,5.0,10.0,20.0mL,用无水甲醇定容至50mL容量瓶,进样5μL,测定其峰面积。试验结果表明,在0.0050~0.1000g·L-1范围内,槲皮素的峰面积A与浓度C呈线性关系,回归方程A=4X107×C-32642,相关系数为0.9995。
  2.2.2样品溶液的制备
  将干燥(空气湿度大时,可在80℃烘干0.5h)的银杏叶研磨成粉末,称取银杏叶粉末5.0000g于圆底烧瓶中,加入70%乙醇一水溶液250mL浸泡12h以上,于50—550C的水浴中回流加热5h提取黄酮甙,加HCl(25+75)20mL继续在85℃下回流加热1h,趁热在铺滤纸的瓷漏斗中抽滤,滤渣用乙醇冲洗,滤液及冲洗水转移至500mL烧杯中缓慢浓缩,当浓缩到25mL时将其降温,用无水甲醇定容于50mL容量瓶中。取适量于离心管中,离心10min,取其上清液,供分析用。
  2.2.3色谱条件
  VP-ODS色谱柱(150mmx4.6mm,5μm);流动相为V(甲醇:V(0.3%磷酸)=55:45;流速为1mL·min-1;检测器波长为360nm;进样量为5μL;柱温为3O0C。
  2.2.4银杏总黄酮含量计算
  提取液经HPLC分析,测得样品中主要成分为槲皮素、异鼠李素、山萘酚的峰面积A1,A2,A3。再根据槲皮素标准曲线、平均换算系数(2.51)及回归方程,可得黄酮甙含量,计算公式如下:CT%=[(A1+A2+A3)×a+b]×2.51×50/mS×100%
  a为槲皮素浓度与峰面积标准曲线斜率;b为槲皮素浓度与峰面积标准曲线截距;50为样品溶液体积(mL);ms为样品质量(mg)。
  3结果与讨论
  3.1流动相的选择
  从银杏叶中提出的黄酮甙经水解后,含有槲皮素、山奈酚、异鼠素三种主要黄酮甙元以甲醇—磷酸水溶液(55:45)为流动相,三种成分可获得满意分离,加磷酸的原因可能是黄酮甙元中部分酚羟基电离成甙元阴离子造成,进而使组成的峰形拖尾,但在加入少量磷酸,则峰形明显有所好转。有些文献中流动相中加入少量甲酸也取得很好的效果,但乙腈或四氢呋喃有机改性剂,不能改善山奈酚和异鼠李素的分离效果。
  3.2检测波长的选择
  在选定的流动相条件下,槲皮素、山奈酚、异鼠李素三种黄酮甙元的最大吸收波长略有差异,但在360nm处均有较强的吸收,为兼顾三者的灵敏度,选择360nm为检测波长。根据槲皮素的色谱图1和文献[1]以及所做的色谱图可知三种黄酮甙元分离见图2。
  3.3实验结果
  根据2.2.4的计算方法计算出乐山市中区银杏叶中总黄酮的含量为:
  CT%=[(A1+A2+A3)×a+b]×2.51×50/mS×100%
  将表1中的三种黄酮甙元的峰面积代入上面公式中得:
  CT%=0.1356%(a为3×10-8b为0.001)
  3.4分析方法检验
  3.4.1精密度
  在本实验中,称取干燥的银杏叶粉末2g于四个圆底烧瓶中,用70的乙醇-水液进行提取,方法与2.2.2一样,在加盐酸时按比例加入8mI,最后浓缩,定容,分析。经HPLC分析得四次0.1605%,0.1543%,0.1572%,0.1557%,平均值为0.1569%相对标准偏差为1.1%。由此可见分析方法的重现性是比较好的。精密度主要由提取操作的重现性控制,尤其是抽滤和滤液与洗涤液转移,操作时定量、熟练。
  3.4.2重现性
  按试验方法平行测定试样银杏叶5次,测定总黄酮含量分别为0.1354%,0.1387%,0.1381%,0.1376%,0.1395%,由此可见分析方法的重现性是比较好的。
  3.4.3提取效率
  槲皮素是一种黄酮甙元,向样品中加入槲皮素标准时不能使其与葡萄糖结合成黄酮甙,即加入的槲皮素仍以游离形式存在,因此,采用向样品中加槲皮素的方法测定回收率,不能保证黄酮甙都是以能被所用提取体系提取出的形式存在,所测回收率不能保证其可靠性,只能检验在提取和水解过程中黄酮甙元的稳定性和方法的重现性。
  参考文献:
  [1]张春秀,胡小玲,等,银杏叶黄酮类化合物的提取分离[J].化学研究与运用,2001,13(4):454
  [2]程亚青,陶月良,張峰,等.双波长吸光光度法测定植物中黄酮的含量[J].理化检验一化学分册,2002,38
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