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目的：研究膀胱移行细胞癌（BTCC）中E2F-1、CyclinD1的表达.方法：采用免疫组化技术对68例膀胱移行细胞癌组织中E2F-1和CyclinD1进行检测, 同时以18例正常膀胱组织做对照。结果：E2F-1和CyclinD1免疫阳性产物均为棕黄色或棕褐色，阳性着色均定位于细胞核。68例BTCC组织中，E2F-1和CyclinD1阳性率分别为69.12％，51.47％，均显著高于正常膀胱组织（P<0.01）。結论： E2F-1和CyclinD1均参与膀胱移行细胞癌的发生和发展，且E2F-1和CyclinD1的高表达可以作为膀胱移行细胞癌早期诊断的标志。
关键词：膀胱移行细胞癌E2F-1CyclinD1 免疫组织化学
Objectives: This study was to investigate the expression of E2F-1 and CyclinD1 in bladder transitional cell carcinoma (BTCC).
Methods: Expression of E2F-1 and CyclinD1 were evaluated by immunohistochemistry technique with 68 case of bladder transitional cell carcinoma and 18 normal bladder cases.
Results: Buffy color staining found in nucleus was recognized as positive. E2F-1 and CyclinD1 located in nucleus.The positive rate of E2F-1 and CyclinD1 in the 68 cases of bladder transitional cell carcinoma was 69.12％, 51.47％, respectively, which in the 18 cases of normal bladder tissue was 38.89％, 11.11％ respectively. E2F-1 and CyclinD1 were highly expressed in bladder transitional cell carcinoma. A statistically significant differences of E2F-1 and CyclinD1 staining were observed between normal bladder tissues and bladder transitional cell carcinoma(p<0.01). The expression of Rb in the 68 cases of bladder transitional cell carcinoma was 48.53％, which in the 18 cases of normal bladder tissue was 100％. A statistically significant differences of Rb staining was observed between normal bladder tissues and bladder transitional cell carcinoma(p<0.01).
Conclusion:
E2F-1 and CyclinD1 might be involved in development of bladder transitional cell cancer. Both overexpression of E2F-1 and CyclinD1 might be useful for early diagnosis.
Key Words: bladder tumor; .E2F-1; CyclinD1; Rb; immunohistochemistry
膀胱癌在世界范围内均是一种较常见的疾病,其在美国占恶性肿瘤中的第五位, 在我国是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。组织病理学类型以移行细胞癌为主(TCC)，约占90%。其次为鳞状细胞癌(SCC),约占5%。细胞生物学和肿瘤生物学的系列突破使人们认识到，几乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效应，最终都要会聚到细胞周期机制上来，以细胞失控性生长与分裂为最基本特征的肿瘤，不仅是基因疾病，也是一类细胞周期疾病。随着细胞周期调控机制的阐明，细胞周期调控紊乱与恶性肿瘤发生发展有密切关系。膀胱癌的发生发展受到细胞周期不同时相多个调控点的调节，其中G1/S点最为重要，直接决定细胞是否进人细胞增殖周期。E2F-1和CyclinD1是调节G1期细胞增殖信号的关键因子,表达失控可导致细胞过度增殖,最终形成肿瘤[1]。因此，干预肿瘤细胞G1期相关因子的调控可能是肿瘤免疫治疗新的靶点和策略。本研究采用免疫组化技术对68例膀胱移行细胞癌组织中E2F-1和CyclinD1进行检测，并设立18例正常膀胱组织作为同期对照组，观察膀胱移行细胞癌组织E2F-1和CyclinD1的表达情况。
一 研究对象
（一）肿瘤实验组
1、 标本:膀胱移行细胞癌标本68例.均为2003——2007年我院泌尿外科手术病例.都有完整的病理资料.术前患者均未接受化疗、放疗。其中男性44例.女性24例.年龄37 —— 75岁.平均年龄66. 5岁。
（二）正常膀胱组织：正常膀胱上皮组织18例.标木经HE染色证实无癌变等病理改变。
（三）阳性对照组：E2F-1,CyclinD1分别在扁桃体，乳腺癌，正常结肠上皮的表达为阳性对照
（四）阴性对照组：以0.01 mol/L PBS(PH7.4)代替一抗做对照。
三 实验步骤
（一）石蜡标本的制作
（二）采用免疫组织化学即用型二步法（SupervisionTM）对膀胱癌组织中E2F-1和CyclinD1的检测
四、结果判定
分别由两名经验丰富的病理医师在不知临床和病理资料的情况下独立观察切片（至少 5 个具有代表性的高倍视野，不少于1000 个细胞），对免疫组织化学结果进行评估。阳性结果判断：胞核出现黄色为阳性细胞。阳性表达标准参照Barnes等提出的基于3个参数的半定量计数方法，即染色强度、阳性细胞数和两者记分的乘积。A项（阳性细胞数）：光镜下观察10个高倍视野，记录1000个肿瘤细胞内阳性细胞数的百分比：无，记0分；阳性细胞数百分比1-10，记1分；11-50，记2分；51-80，记3分；〉80，记4分。B项（染色强度）：浅黄色记1分；棕黄色记2分；棕褐色记3分。每例标本最后得分为A×B：0分为阴性、1-2分为弱阳性、3-4分为阳性、〉4分为强阳性、≥3分为过度表达。凡达不到上述标准及显色强度与背景无明显差别者为阴性。
五、统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件包统计分析所有数据，当P<0.05为差异具有显著性。指标表达率与临床分期、病理分级的关系采用Wilcoxon秩和检验；三个指标在正常膀胱黏膜和膀胱癌组织中的表达率的比较及各指标与临床资料的相关性分析用四格表和R×C表资料χ2检验。
1. E2F-1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
E2F-1阳性表达位于细胞核，呈棕黄色或黄色细颗粒状。68例膀胱移行细胞癌中E2F-1表达阳性率为 69.12%（47/68）；而在18例正常膀胱黏膜中E2F-1表达阳性率则为38.89%（7/18），应用四格表资料χ2检验，χ2=5.566,p<0.05,差异具有显著性，可认为膀胱癌中E2F-1的表达高于正常膀胱黏膜中E2F-1的表达（见表1及图1）。应用Wilcoxon秩和检验提示E2F-1在膀胱癌组织中阳性表达的强度与正常膀胱黏膜相比，差异具有显著性（Z=-6.708，P<0.01，见表1）。
表1. E2F-1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
E2F-1表达强度（例数）阳性率Wilcoxon
组织标本 总例数 -++++++（%） Z P
正常膀胱黏膜1811 43 0 38.89-6.708P<0.01
膀胱癌组织6821 19 141469.12
注E2F-1阳性表达率：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（χ2=5.566,p<0.05）。E2F-1表达强度：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（Z=-6.708，P<0.01）。
2. Cyclin D1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
Cyclin D1阳性表达位于细胞核，呈棕黄色或黄色细颗粒状。68例膀胱移行细胞癌中Cyclin D1表达阳性率为 51.47%（35/68）；而在18例正常膀胱黏膜中Cyclin D1表达阳性率则为11.11%（2/18），应用四格表资料χ2检验，χ2=9.457,p<0.01,差异具有显著性，可认为正常膀胱黏膜中Cyclin D1的表达高于膀胱癌中Cyclin D1的表达（见表5及图1）。应用Wilcoxon秩和检验提示Cyclin D1在膀胱癌组织中阳性表达的强度与正常膀胱黏膜相比，差异具有显著性（Z=-3.572，P<0.01，见表5）。
表5. Cyclin D1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
Cyclin D1表达强度（例数）阳性率Wilcoxon
组织标本 总例数 -++++++（%） Z P
正常膀胱黏膜1816 20 011.11-3.572P<0.01
膀胱癌组织6833 17 10851.47
注Cyclin D1阳性表达率：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（χ2=9.457,p<0.01）。Cyclin D1表达强度：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（Z=-3.572，P<0.01）。
三．E2F-1的表达与Cyclin D1表达的相关性
E2F-1表达阳性和阴性的病例中，cyclin D1蛋白的阳性表达分别为53.20﹪（25/47）、47.62﹪（10/21），两者比较，差异无显著性（χ2=0.180，P>0.05）。Spearman相关分析示E2F-1的表达与cyclin D1的阳性表达没有显著相关性（r=0.052，P>0.05）。见表14
14.膀胱移行细胞癌中E2F-1表达与cyclin D1表达的相关性。
cyclin D1Spearman
-+ χ2 P rP
E2F-1
- 11 10 0.180>0.050.052 >0.05
+ 22 25
讨 论
随着细胞生物学和肿瘤生物学的迅速发展，人们认识到几乎所有的癌基因及抑癌基因的功能效应，最终都要会聚到细胞周期机制上来，膀胱移行细胞癌（BTCC）和其他恶性肿瘤一样，不仅是基因疾病，更是一类细胞周期疾病[2]。
细胞周期不同时相（G1、S、G2、M）间存在关键的检查点(check-point)[3]，人体细胞的正常生长依赖于各种调节因子对这些检查点的平衡调控,任何一种调控因子发生紊乱将导致细胞异常增殖,从而诱发肿瘤[4]。其中最主要的是G1/S期检查点的正确调控,而cyclin D1则是G1/S期检查点主要的正向调控因子[5]。视网膜母细胞瘤基因RB作为细胞周期的负性调节因子参与肿瘤细胞分化的凋节，其在G1期对细胞周期起重要的负调控作用[6]。E2F对细胞生长的正调控和负调控具有特异性，既能促进细胞由G1期向S期过渡，又能诱导某些细胞发生凋亡，E2F对细胞生长的作用取决于这两种作用的程度[7]。这些调节因子以pRb为中心[8]构成一个复杂的调控途径，即p16-CyclinD1-CDK4/6-Rb-E2F通路。近年来的研究发现E2F-1、CyclinD1在很多肿瘤中有表达，并且与肿瘤的生物学行为有关。本实验通过探讨E2F-1、CyclinD1蛋白在膀胱癌中的表达，研究其与膀胱癌生物学行为之间的相关性，以期为膀胱癌的早期诊断、治疗及预后提供新的途径。
E2F转录因子最初作为腺病毒E2启动子的活化剂被发现，是调节细胞周期的关键因子, 通过调节一系列与细胞DNA合成及细胞增生相关基因的表达来调控细胞周期的进展,是细胞周期调控中最重要的環节。E2F-1在膀胱癌的发生过程中发挥促癌作用还是抑癌作用仍不十分清楚。Rabbani等[9]研究报道了膀胱癌中E2F-1表达的阳性率达60.1％，推测E2F异常与膀胱癌的发病有一定的关系，国内刘卓等[10]对39例膀胱移行细胞癌标本进行免疫组化检查，发现膀胱癌组织的E2F-1呈高表达(82.1%),显著高于正常粘膜的41.7%,认为在膀胱癌的发生中E2F-1起癌基因作用。但E2F-1的表达程度在肿瘤的不同分级、分期、是否复发之间差异无显著性,提示E2F-1的超表达可能是膀胱癌发生演进中的早期关键步骤,一旦细胞的恶性转化完成,其表达再无明显变化。与谢庆祥等[11]的研究结果相似，这些结果提示膀胱癌中E2F过表达导致细胞周期运行紊乱．从而在膀胱癌发病过程中起着重要作用，说明在膀胱癌的发生中E2F-1起癌基因作用。但也有相反报道。Rabbani等研究却认为，膀胱癌中E2F-1低表达者容易转移且预后差。本研究结果显示，E2F-1在BTCC中的阳性率高达56.1％，明显高于正常膀胱粘膜的27.8%，说明E2F-1的异常表达在BTCC的发生过程中起癌基因的作用。
细胞周期蛋白(cyclins)是一组在细胞周期不同时相中具有重要生物学功能的蛋白质,在细胞周期的不同时期活性呈周期性改变。Cyclin D1是细胞周期素(Cyclins)家族中最重要的成员[12]，它是细胞周期G1期增殖信号的关键蛋白,主要作用于G1期和G1/S期的转换过程,是G1/S期检查点主要的正向调控因子[5]。随着对CyclinD1 研究的深入, 发现在多种与恶性肿瘤演进有关的细胞周期调节因子中, CyclinD1蛋白均过度表达[13]，是多种人类原发性肿瘤的特征,对肿瘤诊断和预后的判断有重要意义[14]。本实验中，Cyclin D1在BTCC中的阳性率高达63.23％，而在正常膀胱粘膜的表达率14.25%，说明Cyclin D1在膀胱移行细胞癌组织中高表达。同时E2F-1与CyclinD1蛋白在BTCC中均为高表达，但E2F-1与CyclinD1蛋白在BTCC中的表达无明显的相关性。提示cyclin D1和E2F的过表达有助于细胞转化和肿瘤形成[15]。
综上所述，我们对E2F-1、CyclinD1等多种细胞周期调控因子在BTCC表达情况的研究过程中发现：E2F-1和CyclinD1均参与膀胱移行细胞癌的发生和发展；
E2F-1和CyclinD1的高表达可以作为膀胱移行细胞癌早期诊断的标志。但它们参与BTCC发生发展的确切机制有待进一步研究。
参考文献
[1] Grover R, PacificoMD, Wilson GD,et al.Use of oncogene exp ression as an independent prognostic marker for primary melanoma[J].Ann Plast Surg,2003, 50(2):183-187.
[2] Nasmyth K.Viewpoint：putting the cell cycle in order.Science，1996，274：1643
[3] Nures P.Ordering S phase and M phase in the cell cycle.Cell,1994, 79:547
[4] Mckay JA,Douglas J,Ross VG,et al.Analysis of key cell-cycle checkpoint proteins in colorectal tumours[J].Pathol,2002;196(4):386-393.
[5] Sherr CJ, Roberts JM.Living with or without cyclins and Cyclin-dependent kinases[J].Genes Dev,2004,18(22):2699-2711.
[6] 王永传,卢洪凯,高佃军.膀胱移行细胞癌组织中hTERT和p16,cyclinD1,RB的表达及意义.潍坊医学院学报,2006,28（2）:103-106
[7] Black AR,Azizkhan Clifford J.Regulation of E2F:a family of transcription factors involved in proliferation contro1.Gene,1999,237(2):281-302.
[8] Weinberg RA.The retinoblastoma protein and cell cycle control.Cell, 1995,81(3):323
[9] Rabbani F,Richon VM,et a1.Prognostic significance of trans-cription factor E2F-1 in bladder cancer:genotypic and phenotypic characterization[J].J Natl Cancer Inst,1999,9l(10):874-881.
[10] 刘卓,杨为民,陈志强等.E2F-1、E2F-3在膀胱癌组织的表达及临床意义.临床泌尿外科杂志,2007,22(1):60-62.
[11] 谢庆祥,张闽峰,林福地等.膀胱癌中转录因子E2F的表达及其临床意义.诊断病理学杂志,2002,9(2):102-103.
[12] Motokura T,Bloom T,Kim HG,et al.A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene[J].Nature,1991,350(6318):512-515.
[13] Suzui M,Masuda M,Lim JT,et al.Growth inhibition of human hepatoma cells by a cyclic retinoid is associated with induction of p21CIP1 and inhibition of expression of cyclin D1.Cancer Res,2002,62:3997-4006.
[14] 胥健敏,步宏,杨光华,等.CyclinD1与人类肿瘤[J].中華病理学杂志,1999,28 (3):224.
[15] Suzui M,Masuda M,Lim JT,et al .Growth inhibition of human hepatoma cells by acyclic retinoid is associated with induction of p21CIP1 and inhibition of expression of cyclin D1.Cancer Res,2002,62:3997-4006.
关键词：膀胱移行细胞癌E2F-1CyclinD1 免疫组织化学
Objectives: This study was to investigate the expression of E2F-1 and CyclinD1 in bladder transitional cell carcinoma (BTCC).
Methods: Expression of E2F-1 and CyclinD1 were evaluated by immunohistochemistry technique with 68 case of bladder transitional cell carcinoma and 18 normal bladder cases.
Results: Buffy color staining found in nucleus was recognized as positive. E2F-1 and CyclinD1 located in nucleus.The positive rate of E2F-1 and CyclinD1 in the 68 cases of bladder transitional cell carcinoma was 69.12％, 51.47％, respectively, which in the 18 cases of normal bladder tissue was 38.89％, 11.11％ respectively. E2F-1 and CyclinD1 were highly expressed in bladder transitional cell carcinoma. A statistically significant differences of E2F-1 and CyclinD1 staining were observed between normal bladder tissues and bladder transitional cell carcinoma(p<0.01). The expression of Rb in the 68 cases of bladder transitional cell carcinoma was 48.53％, which in the 18 cases of normal bladder tissue was 100％. A statistically significant differences of Rb staining was observed between normal bladder tissues and bladder transitional cell carcinoma(p<0.01).
Conclusion:
E2F-1 and CyclinD1 might be involved in development of bladder transitional cell cancer. Both overexpression of E2F-1 and CyclinD1 might be useful for early diagnosis.
Key Words: bladder tumor; .E2F-1; CyclinD1; Rb; immunohistochemistry
膀胱癌在世界范围内均是一种较常见的疾病,其在美国占恶性肿瘤中的第五位, 在我国是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。组织病理学类型以移行细胞癌为主(TCC)，约占90%。其次为鳞状细胞癌(SCC),约占5%。细胞生物学和肿瘤生物学的系列突破使人们认识到，几乎所有的癌基因、抑癌基因的功能效应，最终都要会聚到细胞周期机制上来，以细胞失控性生长与分裂为最基本特征的肿瘤，不仅是基因疾病，也是一类细胞周期疾病。随着细胞周期调控机制的阐明，细胞周期调控紊乱与恶性肿瘤发生发展有密切关系。膀胱癌的发生发展受到细胞周期不同时相多个调控点的调节，其中G1/S点最为重要，直接决定细胞是否进人细胞增殖周期。E2F-1和CyclinD1是调节G1期细胞增殖信号的关键因子,表达失控可导致细胞过度增殖,最终形成肿瘤[1]。因此，干预肿瘤细胞G1期相关因子的调控可能是肿瘤免疫治疗新的靶点和策略。本研究采用免疫组化技术对68例膀胱移行细胞癌组织中E2F-1和CyclinD1进行检测，并设立18例正常膀胱组织作为同期对照组，观察膀胱移行细胞癌组织E2F-1和CyclinD1的表达情况。
一 研究对象
（一）肿瘤实验组
1、 标本:膀胱移行细胞癌标本68例.均为2003——2007年我院泌尿外科手术病例.都有完整的病理资料.术前患者均未接受化疗、放疗。其中男性44例.女性24例.年龄37 —— 75岁.平均年龄66. 5岁。
（二）正常膀胱组织：正常膀胱上皮组织18例.标木经HE染色证实无癌变等病理改变。
（三）阳性对照组：E2F-1,CyclinD1分别在扁桃体，乳腺癌，正常结肠上皮的表达为阳性对照
（四）阴性对照组：以0.01 mol/L PBS(PH7.4)代替一抗做对照。
三 实验步骤
（一）石蜡标本的制作
（二）采用免疫组织化学即用型二步法（SupervisionTM）对膀胱癌组织中E2F-1和CyclinD1的检测
四、结果判定
分别由两名经验丰富的病理医师在不知临床和病理资料的情况下独立观察切片（至少 5 个具有代表性的高倍视野，不少于1000 个细胞），对免疫组织化学结果进行评估。阳性结果判断：胞核出现黄色为阳性细胞。阳性表达标准参照Barnes等提出的基于3个参数的半定量计数方法，即染色强度、阳性细胞数和两者记分的乘积。A项（阳性细胞数）：光镜下观察10个高倍视野，记录1000个肿瘤细胞内阳性细胞数的百分比：无，记0分；阳性细胞数百分比1-10，记1分；11-50，记2分；51-80，记3分；〉80，记4分。B项（染色强度）：浅黄色记1分；棕黄色记2分；棕褐色记3分。每例标本最后得分为A×B：0分为阴性、1-2分为弱阳性、3-4分为阳性、〉4分为强阳性、≥3分为过度表达。凡达不到上述标准及显色强度与背景无明显差别者为阴性。
五、统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件包统计分析所有数据，当P<0.05为差异具有显著性。指标表达率与临床分期、病理分级的关系采用Wilcoxon秩和检验；三个指标在正常膀胱黏膜和膀胱癌组织中的表达率的比较及各指标与临床资料的相关性分析用四格表和R×C表资料χ2检验。
1. E2F-1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
E2F-1阳性表达位于细胞核，呈棕黄色或黄色细颗粒状。68例膀胱移行细胞癌中E2F-1表达阳性率为 69.12%（47/68）；而在18例正常膀胱黏膜中E2F-1表达阳性率则为38.89%（7/18），应用四格表资料χ2检验，χ2=5.566,p<0.05,差异具有显著性，可认为膀胱癌中E2F-1的表达高于正常膀胱黏膜中E2F-1的表达（见表1及图1）。应用Wilcoxon秩和检验提示E2F-1在膀胱癌组织中阳性表达的强度与正常膀胱黏膜相比，差异具有显著性（Z=-6.708，P<0.01，见表1）。
表1. E2F-1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
E2F-1表达强度（例数）阳性率Wilcoxon
组织标本 总例数 -++++++（%） Z P
正常膀胱黏膜1811 43 0 38.89-6.708P<0.01
膀胱癌组织6821 19 141469.12
注E2F-1阳性表达率：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（χ2=5.566,p<0.05）。E2F-1表达强度：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（Z=-6.708，P<0.01）。
2. Cyclin D1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
Cyclin D1阳性表达位于细胞核，呈棕黄色或黄色细颗粒状。68例膀胱移行细胞癌中Cyclin D1表达阳性率为 51.47%（35/68）；而在18例正常膀胱黏膜中Cyclin D1表达阳性率则为11.11%（2/18），应用四格表资料χ2检验，χ2=9.457,p<0.01,差异具有显著性，可认为正常膀胱黏膜中Cyclin D1的表达高于膀胱癌中Cyclin D1的表达（见表5及图1）。应用Wilcoxon秩和检验提示Cyclin D1在膀胱癌组织中阳性表达的强度与正常膀胱黏膜相比，差异具有显著性（Z=-3.572，P<0.01，见表5）。
表5. Cyclin D1在膀胱移行细胞癌和正常膀胱黏膜组织中的表达
Cyclin D1表达强度（例数）阳性率Wilcoxon
组织标本 总例数 -++++++（%） Z P
正常膀胱黏膜1816 20 011.11-3.572P<0.01
膀胱癌组织6833 17 10851.47
注Cyclin D1阳性表达率：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（χ2=9.457,p<0.01）。Cyclin D1表达强度：正常膀胱组织与膀胱癌组织相比较，差异具有显著性（Z=-3.572，P<0.01）。
三．E2F-1的表达与Cyclin D1表达的相关性
E2F-1表达阳性和阴性的病例中，cyclin D1蛋白的阳性表达分别为53.20﹪（25/47）、47.62﹪（10/21），两者比较，差异无显著性（χ2=0.180，P>0.05）。Spearman相关分析示E2F-1的表达与cyclin D1的阳性表达没有显著相关性（r=0.052，P>0.05）。见表14
14.膀胱移行细胞癌中E2F-1表达与cyclin D1表达的相关性。
cyclin D1Spearman
-+ χ2 P rP
E2F-1
- 11 10 0.180>0.050.052 >0.05
+ 22 25
讨 论
随着细胞生物学和肿瘤生物学的迅速发展，人们认识到几乎所有的癌基因及抑癌基因的功能效应，最终都要会聚到细胞周期机制上来，膀胱移行细胞癌（BTCC）和其他恶性肿瘤一样，不仅是基因疾病，更是一类细胞周期疾病[2]。
细胞周期不同时相（G1、S、G2、M）间存在关键的检查点(check-point)[3]，人体细胞的正常生长依赖于各种调节因子对这些检查点的平衡调控,任何一种调控因子发生紊乱将导致细胞异常增殖,从而诱发肿瘤[4]。其中最主要的是G1/S期检查点的正确调控,而cyclin D1则是G1/S期检查点主要的正向调控因子[5]。视网膜母细胞瘤基因RB作为细胞周期的负性调节因子参与肿瘤细胞分化的凋节，其在G1期对细胞周期起重要的负调控作用[6]。E2F对细胞生长的正调控和负调控具有特异性，既能促进细胞由G1期向S期过渡，又能诱导某些细胞发生凋亡，E2F对细胞生长的作用取决于这两种作用的程度[7]。这些调节因子以pRb为中心[8]构成一个复杂的调控途径，即p16-CyclinD1-CDK4/6-Rb-E2F通路。近年来的研究发现E2F-1、CyclinD1在很多肿瘤中有表达，并且与肿瘤的生物学行为有关。本实验通过探讨E2F-1、CyclinD1蛋白在膀胱癌中的表达，研究其与膀胱癌生物学行为之间的相关性，以期为膀胱癌的早期诊断、治疗及预后提供新的途径。
E2F转录因子最初作为腺病毒E2启动子的活化剂被发现，是调节细胞周期的关键因子, 通过调节一系列与细胞DNA合成及细胞增生相关基因的表达来调控细胞周期的进展,是细胞周期调控中最重要的環节。E2F-1在膀胱癌的发生过程中发挥促癌作用还是抑癌作用仍不十分清楚。Rabbani等[9]研究报道了膀胱癌中E2F-1表达的阳性率达60.1％，推测E2F异常与膀胱癌的发病有一定的关系，国内刘卓等[10]对39例膀胱移行细胞癌标本进行免疫组化检查，发现膀胱癌组织的E2F-1呈高表达(82.1%),显著高于正常粘膜的41.7%,认为在膀胱癌的发生中E2F-1起癌基因作用。但E2F-1的表达程度在肿瘤的不同分级、分期、是否复发之间差异无显著性,提示E2F-1的超表达可能是膀胱癌发生演进中的早期关键步骤,一旦细胞的恶性转化完成,其表达再无明显变化。与谢庆祥等[11]的研究结果相似，这些结果提示膀胱癌中E2F过表达导致细胞周期运行紊乱．从而在膀胱癌发病过程中起着重要作用，说明在膀胱癌的发生中E2F-1起癌基因作用。但也有相反报道。Rabbani等研究却认为，膀胱癌中E2F-1低表达者容易转移且预后差。本研究结果显示，E2F-1在BTCC中的阳性率高达56.1％，明显高于正常膀胱粘膜的27.8%，说明E2F-1的异常表达在BTCC的发生过程中起癌基因的作用。
细胞周期蛋白(cyclins)是一组在细胞周期不同时相中具有重要生物学功能的蛋白质,在细胞周期的不同时期活性呈周期性改变。Cyclin D1是细胞周期素(Cyclins)家族中最重要的成员[12]，它是细胞周期G1期增殖信号的关键蛋白,主要作用于G1期和G1/S期的转换过程,是G1/S期检查点主要的正向调控因子[5]。随着对CyclinD1 研究的深入, 发现在多种与恶性肿瘤演进有关的细胞周期调节因子中, CyclinD1蛋白均过度表达[13]，是多种人类原发性肿瘤的特征,对肿瘤诊断和预后的判断有重要意义[14]。本实验中，Cyclin D1在BTCC中的阳性率高达63.23％，而在正常膀胱粘膜的表达率14.25%，说明Cyclin D1在膀胱移行细胞癌组织中高表达。同时E2F-1与CyclinD1蛋白在BTCC中均为高表达，但E2F-1与CyclinD1蛋白在BTCC中的表达无明显的相关性。提示cyclin D1和E2F的过表达有助于细胞转化和肿瘤形成[15]。
综上所述，我们对E2F-1、CyclinD1等多种细胞周期调控因子在BTCC表达情况的研究过程中发现：E2F-1和CyclinD1均参与膀胱移行细胞癌的发生和发展；
E2F-1和CyclinD1的高表达可以作为膀胱移行细胞癌早期诊断的标志。但它们参与BTCC发生发展的确切机制有待进一步研究。
参考文献
[1] Grover R, PacificoMD, Wilson GD,et al.Use of oncogene exp ression as an independent prognostic marker for primary melanoma[J].Ann Plast Surg,2003, 50(2):183-187.
[2] Nasmyth K.Viewpoint：putting the cell cycle in order.Science，1996，274：1643
[3] Nures P.Ordering S phase and M phase in the cell cycle.Cell,1994, 79:547
[4] Mckay JA,Douglas J,Ross VG,et al.Analysis of key cell-cycle checkpoint proteins in colorectal tumours[J].Pathol,2002;196(4):386-393.
[5] Sherr CJ, Roberts JM.Living with or without cyclins and Cyclin-dependent kinases[J].Genes Dev,2004,18(22):2699-2711.
[6] 王永传,卢洪凯,高佃军.膀胱移行细胞癌组织中hTERT和p16,cyclinD1,RB的表达及意义.潍坊医学院学报,2006,28（2）:103-106
[7] Black AR,Azizkhan Clifford J.Regulation of E2F:a family of transcription factors involved in proliferation contro1.Gene,1999,237(2):281-302.
[8] Weinberg RA.The retinoblastoma protein and cell cycle control.Cell, 1995,81(3):323
[9] Rabbani F,Richon VM,et a1.Prognostic significance of trans-cription factor E2F-1 in bladder cancer:genotypic and phenotypic characterization[J].J Natl Cancer Inst,1999,9l(10):874-881.
[10] 刘卓,杨为民,陈志强等.E2F-1、E2F-3在膀胱癌组织的表达及临床意义.临床泌尿外科杂志,2007,22(1):60-62.
[11] 谢庆祥,张闽峰,林福地等.膀胱癌中转录因子E2F的表达及其临床意义.诊断病理学杂志,2002,9(2):102-103.
[12] Motokura T,Bloom T,Kim HG,et al.A novel cyclin encoded by a bcl1-linked candidate oncogene[J].Nature,1991,350(6318):512-515.
[13] Suzui M,Masuda M,Lim JT,et al.Growth inhibition of human hepatoma cells by a cyclic retinoid is associated with induction of p21CIP1 and inhibition of expression of cyclin D1.Cancer Res,2002,62:3997-4006.
[14] 胥健敏,步宏,杨光华,等.CyclinD1与人类肿瘤[J].中華病理学杂志,1999,28 (3):224.
[15] Suzui M,Masuda M,Lim JT,et al .Growth inhibition of human hepatoma cells by acyclic retinoid is associated with induction of p21CIP1 and inhibition of expression of cyclin D1.Cancer Res,2002,62:3997-4006.