采用CTAB法对硬叶兜兰叶片总DNA进行提取,通过正交实验设计,用SRAP正向引物me1(5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’)和反向引物em2(5’-ACACACACACACACACT-3’)对反应体系进行优化;并应用其进行种群遗传差异分析。结果表明:优化的20μL的PCR反应体系中DNA模板为90 ng,Taq DNA聚合酶1.6 U,dNTPs 0.30 mmol/L,MgCl22.0 mmol/L和引物各0.50μmol/L,经重复电泳验证适合进行硬叶兜兰的SRAP分析;利用该体系对7个不同种源的167份硬叶兜兰进行SRAP-PCR扩增,对筛选的10个引物扩增,共得到288条条带,其中多样性条带234条,多态位点百分率(PPB)为81.25%;种群的遗传距离值在0.065 9~0.191 6,UPGMA聚类结果显示供试种群在遗传相似度为0.863时,可以分为2支,即第一分支由马固、斗咀和杨柳井居群组成,第二支由古林箐、夹寒箐、小坝子和田坝居群组成。SRAP标记可较好地适用于硬叶兜兰种群遗传差异的鉴定。