【摘 要】
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目的 研究非编码单链RNA(micro RNA,miRNA) miR-370-3P是否通过调控JAK2/STAT5B信号通路调节人关节软骨细胞(human chondrocytes-articular,HC-a)的增殖,并探讨其潜在作用机
【机 构】
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400014 重庆,重庆医科大学附属儿童医院内分泌科,国家儿童健康与疾病临床医学研究中心,儿童发育疾病研究教育部重点实验室,儿科学重庆市重点实验室
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目的 研究非编码单链RNA(micro RNA,miRNA) miR-370-3P是否通过调控JAK2/STAT5B信号通路调节人关节软骨细胞(human chondrocytes-articular,HC-a)的增殖,并探讨其潜在作用机制.方法 ①通过脂质体转染HC-a细胞构建miR-370-3P过表达/低表达人关节软骨细胞模型,分为5组:miR-370-3P模拟物mimic组(miR-370-3P过表达组)、miR-370-3P遏制物inhibitor组(miR-370-3P低表达组)、正常对照组、mimic空载体对照组(mimic normal control,mNC)、inhibitor空载体对照组(inhibitor normal control,iNC).②miRNA实时荧光定量PCR检测各组HC-a细胞miR-370-3P的表达.③qRT-PCR检测各组HC-a细胞JAK2、STAT5B mRNA表达.④Western blot检测各组HC-a细胞中JAK2、STAT5B蛋白表达.⑤MTT比色法检测各组HC-a细胞相对增殖情况.⑥双荧光素酶实验:构建JAK2、STAT5B野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,分别与miR-370-3P模拟物和阴性对照序列共转染293T细胞,检测各组荧光素酶活性.结果 miRNA实时荧光定量PCR结果显示:与正常对照组相比,mimic组miR-370-3P表达上调(P＜0.05),inhibitor组miR-370-3P表达下调(P＜0.05),且空载体对照组和正常对照组之间的差异无统计学意义,表明miR-370-3P过表达/低表达软骨细胞模型构建成功.qRT-PCR结果显示:相比于正常对照组,JAK2和STAT5B在mimic组的mRNA相对表达量下调,在inhibitor组JAK2 mRNA和STAT5B mRNA相对表达量上调(P＜0.05).Western blot检测结果显示:JAK2和STAT5B蛋白表达在mimic组也有显著下调,在inhibitor组上调.MTT检测结果显示:miR-370-3P的过表达会降低HC-a的存活率(P＜0.05),提示miR-370-3P的过表达会抑制人关节软骨细胞(HC-a)的增殖.双荧光素酶实验结果显示:miR-370-3P和JAK2-WT(野生型)、STAT5B-WT(野生型)质粒共转染后,荧光表达较对照组有显著下调(P＜0.05),提示miR-370-3P可与JAK2-3\'UTR、STAT5B-3\'UTR直接结合发挥作用.结论 miR-370-3P可通过直接靶向调控JAK2/STAT5B信号通路进而抑制人关节软骨细胞(HC-a)的增殖.
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