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摘 要：以陰生桫椤（Alsophila latebrosa）、大叶黑桫椤（Alsophila gigantea）为研究对象，利用绿色球状体（Green Globular Bodies，GGB）途径，展开快繁体系的研究，以筛选最优的繁殖体系。结果表明：（1）阴生桫椤的快繁体系中，1/10 MS是孢子萌发最优培养配方;1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L是诱导配子体产生GGB的最优培养配方;1/2 MS+KT 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L是其诱导GGB分化的最优培养配方;孢子体幼苗在泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1的基质中成活率最高。（2）在大叶黑桫椤的快繁体系中，1/10 MS为相对较好的培养基;1/2 MS+0.3 mg/L IBA是诱导产生GGB的最优培养配方;1/2 MS+0.3 mg/L NAA对GGB分化的促进作用最显著;1/2 MS+0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA的组合可有效促进孢子体幼苗生根。（3）通过配子体诱导GGB途径，2种桫椤属植物从孢子萌发到幼苗移栽的整个培养过程为6～8个月。可见，GGB途径不仅能提高繁殖系数，也能大大缩短桫椤属植物的繁殖时间，为实现桫椤属植物的工厂化育苗奠定了基础。
关键词：阴生桫椤;大叶黑桫椤;GGB;组织培养
中图分类号：Q813.1 文献标识码：A
Technology for Rapid Propagation in Vitro of Two Alsophila Species
LANG Yueting1，2， MA Changwang1，2*， YU Jing1，2， GUO Rui1，2， YAN Yuehong3， YANG Dongmei1，2*
1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Plants of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Shanghai Chenshan Botanical Garden / Shanghai Chenshan Plant Science Research Center， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201602， China
Abstract： Alsophila latebrosa and A. gigantea both have high scientific value and ornamental value. The construction of the rapid propagation system of them by gametophy-induced Green Globular Bodies （GGB） pathway was studied. In the rapid propagation system of A. latebrosa， the most optimal culture formula for spore germination was 1/10MS， the best culture medium for inducing gametophytes to produce GGB was 1/2MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L， sucrose 30 g/L and agar 6.5 g/L， the most suitable formula for GGB differentiation factor was 1/2MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L， and the survival rate of sporophyte seedlings was the highest in the substrate （peat∶garden soil∶perlite = 3∶3∶1）. In the fast propagation system of A. gigantea， the relatively suitable medium was 1/10MS， the most optimal formula for GGB induction was 1/2MS+0.3 mg/L IBA， NAA of 0.3 mg/L had the most significant effect on GGB differentiation， the combination of 0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA could promote the rooting the sporophyte seedlings. It only took 6-8 months by gametophy-induced GGB pathway for the culture of the two Alsophila species， from spore germination to seeding transplanting. Therefore， this pathway not only increased the propagation coefficiency， but also greatly reduced the propagation time of Alsophila species， which could enhance the industrial seeding of Alsophila species. Keywords： Alsophila latebrosa; Alsophila gigantea; green globular bodies; tissue culture
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.010
桫欏科（Cyatheaceae）隶属于蕨类植物门（Pteridophyta）薄囊蕨纲（Leptosporangiopsida）桫椤目（Cyatheales），全世界有3属600多种，其中中国有2属14种2变种，分别是桫椤属（Alsophila）和白桫椤属（Sphaeropteris），主要分布在云南、广西、广东、海南、台湾等地[1-3]。桫椤科植物古老而特别，是现存的唯一的树蕨类植物，对物种起源、进化和植物地理区系等研究具有重要价值，在古地质学、古生物学及古气候学等学科，常被当做理想的研究材料。另外，桫椤科植物形态优美，观赏性高，在广州、深州等地区已经被广泛应用[4-5]。可见，桫椤科植物既有科学价值，又有很高的观赏价值。但由于生境破坏、过度采挖，桫椤科植物的生存现状不容乐观。因此，有必要对其展开繁殖技术研究，利用组织培养的方法构建快繁体系，一方面保护野生的桫椤科植物资源，另一方面促进桫椤科植物在园林上的应用。
前人对桫椤科植物繁殖生物学的研究，主要集中在孢子形态、配子体发育等基础研究，而有关桫椤科植物快繁体系构建方面的研究较少，主要有莫新寿等[6]、陈封政等[7]、张祖荣等[8]利用无菌播种的途径，培育桫椤科植物幼苗。目前尚未见到通过绿色球状体（Green Globular Bodies，GGB）途径培养桫椤科植物幼苗的报道。GGB是一种类似于兰科原球茎的组织[9]。跟其他组培途径相比，通过GGB途径能大大提高蕨类植物的增殖率[10]。Haruzo等[9]发现通过GGB生长的速率比通过丛生芽阶段繁殖更高。因此后来GGB组培繁殖途径在多种蕨类植物中得到应用，如鸟巢蕨（Neottopteris nidus）、乌毛蕨（Blechnum orientale）、凤尾蕨（Pteris cretica）等[11-14]。由于前人研究结果显示不同的培养基和植物生长调节剂对组培苗的生长发育有显著性影响[15]，故本研究对其进行单因子试验、双因子交叉试验及多因子正交试验设计。
本研究以桫椤属植物作为研究对象，选取了阴生桫椤（Alsophila latebrosa）、大叶黑桫椤（Alsophila gigantea），利用GGB途径展开快繁体系的研究，以筛选最优的繁殖体系，为桫椤属植物的大规模生产和应用提供可靠依据。由于先采集到阴生桫椤的孢子叶，后采集到大叶黑桫椤的孢子叶，因此在进行阴生桫椤的组织培养实验基础上，另行设计了大叶黑桫椤组织培养的实验方案。
1 材料与方法
1.1 材料
2种桫椤属植物的孢子均采集于海南岛的五指山、吊罗山（琼中太平乡段）、黎母山。将采集的孢子叶放到纸袋中并通风晾干，然后将自然散落的孢子收集于离心管内，放置于4 ℃冰箱中储存备用。
1.2 方法
1.2.1 阴生桫椤快繁体系 （1）孢子的消毒及赤霉素预处理。在离心管中加入阴生桫椤孢子与无菌水，充分震荡后静置12 h;以4 000 r/min离心1 min，吸走上层无菌水，重复3次;加入75%酒精并充分震荡，无菌水清洗3次;再加入4%～5% NaClO溶液，充分震荡后，离心4 min，用蒸馏水清洗4次;分别把不同浓度的GA3（表1）加入离心管中，处理3 min，再用无菌水清洗3次，最后每个处理制成3管孢子悬浊液，3个处理共9管。
（2）不同赤霉素预处理、蔗糖浓度和无机盐浓度对孢子萌发的影响。把经过不同浓度GA3预处理的孢子悬浊液，接种在不同蔗糖浓度和无机盐浓度的培养基上（表1）。采用L9（34）正交设计实验，共9个处理，每个处理3皿，共27皿，每皿接种0.2 mL孢子悬浊液。琼脂6.5 g/L，pH 5.8。将培养皿放入培养室中进行培养，培养室温度（232）℃，光强15～20 μmol/（m2·s），光照周期12 h/d。接种后每周观察1次，孢子萌发后采用光学显微镜观察，统计孢子的萌发率。孢子萌发率计算方法：随机取10个显微视野，统计孢子总数和萌发的孢子数，计算平均孢子萌发率。
（3）NAA、6-BA对GGB诱导的影响。本实验设置0、0.1、0.3、0.5 mg/L 4个水平的NAA浓度和0、0.2、0.5、1.0 mg/L 4个水平的6-BA浓度进行双因子交叉实验，共16个处理，每个处理接种10皿，重复3次。基本培养基为1/2 MS，蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH 5.8。接种后每周观察1次，3～4周后继代1次，观察并记录GGB大小、数量，计算GGB诱导率和增殖倍数。
（4）KT、IAA对GGB分化的影响。本实验选择2种植物生长调节剂KT（0、0.1、0.5、1.0 mg/L，4个浓度水平）、IAA（0、0.1、0.5、1.0 mg/L，4个浓度水平）设计双因子交叉实验。将GGB团切分，接种到不同植物生长调节剂及浓度组合的培养基中，共16个处理，每个处理接种5瓶，重复3次。接种后每周观察1次，统计GGB分化率。
（5）不同培养基质对无根苗生根的影响。将GGB分化得到的无根孢子体幼苗接种到以下5种培养基中：（1）1/2 MS;（2）1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L;（3）1/2 MS+BA 0.05 g/L+IBA 0.05 g/L;（4）1/2 MS+IBA 0.2 mg/L;（5）1/2 MS+NAA 0.2 mg/L。蔗糖30.0 g/L，琼脂6.5 g/L，pH 5.8。每个处理接种5瓶，每瓶接种3株幼孢子体。接种后每周观察1次，观察记录生根数，测量根长、株高，统计生根率。 （6）不同培养基质对孢子体幼苗移栽成活率的影响。当孢子体幼苗长到株高3～4 cm、根长2～3 cm时，打开培养瓶并在培养室炼苗3 d，再放在自然光照下炼苗7 d，然后移栽至4种培养基质中（蛭石∶石沙=2∶1;菜园土∶泥炭土=2∶1;菜园土∶珍珠岩=2∶1;泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1）。每种基质移栽3盆，每盆10株，每周观察记录存活情况。
1.2.2 大叶黑桫椤快繁体系 （1）孢子悬浊液的制备。制备方法同1.2.1（1），但不进行赤霉素预处理。
（2）不同无机盐浓度对孢子萌发的影响。接种方法与培养条件同1.2.1（2），但大叶黑桫椤仅接种在不同无机盐浓度的培养基上，无机盐浓度为MS、1/2 MS、1/5 MS、1/8 MS、1/10 MS，共5个水平。
（3）NAA、IBA、KT、6-BA对GGB诱导的影响。通过前期预实验，筛选出1/2 MS为GGB诱导的基本培养基，选择2种细胞生长素NAA、IBA和2种细胞分裂素KT、6-BA，其浓度均设置为0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4个浓度水平，共16个处理。每个处理接种5瓶，每瓶接种5个配子体。蔗糖为30 g/L，琼脂7 g/L，pH 5.8。接种后，每10 d观察1次，把产生GGB的配子體移植到新的培养瓶里，完成继代增殖，记录GGB大小、数量，计算GGB诱导率。
（4）NAA、IBA、KT、6-BA对GGB分化的影响。植物生长调节剂为NAA、IBA、KT、6-BA，浓度均设置为0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4个浓度水平，共16个处理。每个处理接种5瓶，每瓶接种5个GGB团。基本培养基设置为MS，蔗糖为30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH 5.8。接种后每周观察1次，3周后统计GGB分化率。
（5）IAA、NAA对无根苗生根的影响。通过预实验，选择2种植物生长调节剂IAA、NAA，利用双因子交叉分组设计实验。这2种植物生长调节剂浓度水平都设置为0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4个浓度水平，共16个处理。将无根的孢子体幼苗接种到不同浓度植物生长调节剂组合的培养基里，基本培养基为MS，蔗糖30.0 g/L，琼脂6.0 g/L，pH 5.8。每个处理接种5瓶，每瓶接种5个孢子体幼苗。接种后每周观察1次，3周后观察、记录生根数，测量根长、株高，统计生根率。
（6）炼苗和移栽。方法同1.2.1（6），但仅移栽到泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1的培养基质中。
1.3 数据处理
采用Excel 2016软件进行数据记录和统计，使用SPSS 22.0软件对结果进行分析，显著性水平设置为α=0.05。
2 结果与分析
2.1 阴生桫椤快繁体系
2.1.1 不同浓度的赤霉素、蔗糖、无机盐对孢子萌发的影响 表2显示，蔗糖、无机盐和赤霉素3因素的P值均大于显著性水平，即3个因素均对孢子萌发无显著性影响，因此，进行直观分析。表3显示，3个因素中，无机盐因素的极差R值最大，说明无机盐浓度对孢子萌发的影响最大，而且无机盐浓度为1水平（1/10 MS）时，其对应的K1值最大，为41.22，说明低浓度无机盐条件利于孢子萌发。其次是蔗糖因素，其极差R值仅次于无机盐，而且蔗糖浓度为1水平（0 g/L）时，对应的K1值最大，为42.67，显示孢子在低糖条件下萌发效果较好。赤霉素因素的极差R值最小，说明赤霉素对阴生桫椤孢子的萌发的影响最小，而且赤霉素为1水平（0 mg/L）时，对应的K1值最大，说明不用赤霉素处理有利于孢子萌发，加入赤霉素反而抑制孢子萌发。3个因素的K1值都最大，这说明赤霉素、蔗糖、无机盐分别在1水平时，对孢子萌发的促进效果最优。萌发率结合萌发时间来看，1/10 MS培养基是阴生桫椤孢子萌发的最优培养基，萌发率可达62.33%，2周后开始萌发（图1A、图1B）。
2.1.2 NAA、6-BA对诱导配子体产生GGB的影响 在诱导率方面，方差分析结果显示，NAA、6-BA不同浓度组合对配子体诱导GGB具有显著影响;进行多重比较结果显示，处理10的诱导率最高为46.67%，与其他处理之间有显著差异（处理5～7除外）。在增殖倍数方面，方差分析结果显示，各处理之间GGB增殖倍数具有显著差异，说明2种植物生长调节剂不同浓度的组合对GGB的增殖有显著影响;多重比较结果显示，处理10的增殖倍数最高为3.67，与其他处理有显著差异（处理2、5～7及14除外）。从GGB生长情况来看，随着植物生长调节剂浓度的增加，GGB会褐化或配子体会变黄，但浓度过低时，GGB呈团松散且生长缓慢。大部分GGB集中在4周～6周之间被诱导出来，极少数在9周之后才诱导出来（表4）。综上所述，配子体诱导产生GGB的最适植物生长调节剂组合为处理10，即NAA 0.3 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L，诱导率可达46.67%，增殖倍数可达3.67，6周左右诱导出GGB，且GGB团长势良好，呈绿色球状（图1C～图1F）。
2.1.3 KT、IAA对诱导GGB分化的影响 方差分析结果表明，各处理之间GGB分化率具有显著差异。处理1、4、8、11、13的分化率都为0，说明高浓度的KT和IAA都对GGB的分化有抑制作用;KT浓度超过0.5 mg/L或者小于0.1 mg/L都不利于GGB的分化，IAA浓度超过0.5 mg/L或者小于0.1 mg/L也不利于GGB的分化，只有2种植物生长调节剂在0.1～0.5 mg/L之间时对GGB 的分化有促进作用。从多重比较结果来看，处理6与其他处理之间具有显著性差异，促进GGB分化的效果最理想（表5）。分化率结合分化时间来看，诱导GGB分化的最适植物生长调节剂组合为处理6，即KT 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L，其诱导分化率为38.90%，GGB分化产生幼孢子体芽苗的时间为7周（图1G～图1H）。 2.1.4 不同培养基对无根孢子体幼苗生根的影响 方差分析结果显示，各处理间具有显著差异。多重比较结果显示，处理2与其他处理差异显著，平均生根率最高，为77.80%。所有处理的大部分幼苗在株高长到3～4 cm的时候，根有2～3 cm长，每株有2～4根。生根时间为3～4周，其中处理2的生根时间为3周（表6）。因此，阴生桫椤孢子体幼苗最适的生根植物生长调节剂配方为处理2，即1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L（图1 I）。实验还发现，在不加入外源植物生长调节剂的处理1具有较高的生根率，与添加了植物生长素和细胞分裂素的处理3、4、5的生根率相当。这说明植物生长调节剂需要控制适当的浓度，才能促进孢子体幼苗的生根，否则会起抑制作用。
2.1.5 不同培养基质对孢子体幼苗移栽成活率的影响 方差分析结果显示，基质对幼苗的成活率具有显著性影响。幼孢子体苗在处理4（泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1）的成活率最高，4周后最高成活率可达67.73%（表7）（图1J～图1L）。
2.2 大叶黑桫椤快繁体系
2.2.1 无机盐浓度对孢子萌发的影响 方差分析结果显示，无机盐浓度对大叶黑桫椤的孢子萌发没有显著性影响（表8）。不同盐浓度下，孢子都能萌发，萌发率为24.53%～40.66%，萌发时间为14～28 d。其中1/10 MS处理下的孢子萌发率最高，为40.66%，萌发时间也较早，2周开始萌发（图2A、图2B）。
2.2.2 不同植物生长调节剂对诱导GGB的影响 结果显示，IBA、NAA、KT、6-BA这4种植物生长调节剂对诱导大叶黑桫椤的配子体产生GGB都有促进作用;在不添加植物生长调节剂时，GGB诱导率为0。方差分析结果显示，处理之间GGB诱导率和增殖倍数差异显著。从表9可见，2种细胞生长素中，IBA诱导产生GGB的效果强于NAA;2种细胞分裂素中6-BA的诱导效果比KT更好，但6-BA随着浓度的提高，诱导率大幅下降，说明低浓度的6-BA对诱导GGB有良好效果。多重比较结果显示，处理E2（IBA，浓度为0.3 mg/L）与其他处理（E14除外）均有显著差异，诱导率最高，达52.00%，其次为E14（6-BA，浓度为0.5 mg/L），诱导率为46.47%。而处理E5（NAA，浓度为0.1 mg/L）、E8（NAA，浓度为1.0 mg/L）、E15（6-BA，浓度为1.0 mg/L）的诱导率为0。从增殖倍数来看，最大增殖倍数为E2处理，增殖倍数为4.67，与其他处理（E4、E13、E14除外）有显著差异，其次为E14（6-BA，浓度0.5 mg/L），增殖倍数为4.44。从GGB出现的时间来看，大量产生GGB的时间集中在28～ 35 d，其中E2处理28 d出现GGB。因此，IBA和6-BA这2种植物生长调节剂对GGB增殖的促进作用较好。0.3 mg/L IBA是诱导大叶黑桫椤GGB分化和增殖的最优植物生长调节剂配方，诱导率可达52.00%，增殖倍数为4.67（图2C～图2I）。
2.2.3 植物生长调节剂对GGB分化的影响 结果显示，2种细胞生长素中NNA对GGB分化的诱导效果要强于IBA，2种细胞分裂素中6-BA诱导GGB分化的效果要强于KT，4种植物生长调节剂中NAA对GGB分化的刺激作用最明显。方差分析结果显示，不同植物生长调节剂及浓度处理对GGB分化率具有显著影响（表10）。多重比较结果显示，处理F6（NAA 0.3 mg/L）对大叶黑桫椤GGB分化的促进作用最显著，与其他处理（F14除外）之间有显著差异。但是，随着4种植物生长调节剂浓度的增加，GGB的分化率降低，甚至出现抑制分化的情况。如处理F4（IBA 1.0 mg/L）、F11（KT 1.0 mg/L）、F12（KT 2 mg/L）等分化率为0，出现了明显的抑制分化作用。这说明高浓度的植物生长调节剂对GGB的分化具有抑制作用。综上所述，0.3 mg/L NAA对大叶黑桫椤GGB分化的促进作用最显著，分化率最高可达45.33%（图2J）。
2.2.4 不同浓度IAA、NAA对无根苗生根的影响 方差分析结果显示，不同浓度的IAA和NAA组合对生根率具有显著影响。多重比较结果显示，处理G10（0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA）的生根率最高，达52.00%，与其他处理有显著的差异;处理G13（0 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA）的生根率最低，为21.33%（表11）。可见，0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA的组合对刺激大叶黑桫椤的孢子体幼苗生根的作用最优，生根率可达52.00%。
2.2.5 炼苗和移栽 炼苗和移栽的方法与阴生桫椤一样，但是大叶黑桫椤幼苗移栽15 d后，大部分幼苗枯萎（图2K～图2L）。
3 讨论
本研究结果显示，赤霉素对阴生桫椤的孢子萌发没有显著影响，这与前人的研究结果不同。前人的研究结果显示，桫椤科植物有休眠期，需要用赤霉素打破休眠期[16]，但是本研究发现，未经过赤霉素处理的阴生桫椤的孢子反而具有更高的萌发率。由于在阴生桫椤的实验中，发现赤霉素对孢子的萌发没有积极效应。因此，在大叶黑桫椤的实验中仅考虑不同无机盐浓度对孢子萌发率的影响。
本研究发现阴生桫椤的孢子在低糖、低鹽浓度的培养基中萌发率较高。在蔗糖浓度方面，与前人的研究结果一致，刘保东等[17]、孙晓丹[18]的研究表明，低浓度蔗糖有利于肾蕨（Nephrolepis auriculata）、桂皮紫萁（Osmunda cinnamomea var. asiatica）的孢子萌发;在无机盐浓度方面，本研究结果与前人的相反，前人的研究表明，粗梗水蕨（Ceratopteris pteridoides）[19]、球子蕨（Onoclea sensibilis）[20]等在高盐浓度的培养基中孢子萌发情况比在低盐浓度中好。本研究中不同浓度的无机盐对大叶黑桫椤孢子萌发的影响效果不显著，1/10MS培养基相对效果较好，这与徐艳等[21]的实验结果相似，这可能是因为大叶黑桫椤孢子内含有足够的氮源，或者在孢子萌发过程中会分解产生部分氮，所以在组织培养时不需要外加太多氮源。 本研究中在阴生桫椤的GGB分化阶段，分化率偏低。这可能与分化阶段所用的植物生长调节剂种类、浓度有关。前人研究表明，植物生长调节剂对蕨类植物诱导GGB和GGB分化起着关键性的作用，不同种类和浓度对植物诱导GGB和GGB分化的影响不同[22]。本研究通过前期大量预实验，筛选了2种诱导GGB效果较好的植物生长调节剂NAA、6-BA和2种对GGB分化有良好促进作用的植物生长调节剂KT、IAA，进行双因子交叉实验，结果表明不同浓度的植物生长调节剂组合对诱导GGB和GGB分化有促进作用，但诱导率最高不逾50%，增殖位数不及4，分化率最高不逾40%。因此，日后还应进行浓度梯度更小的双因子实验，甚至多因子实验，以筛选最合适的植物生长调节剂组合和浓度，进一步提高阴生桫椤的GGB诱导率和GGB分化率。与阴生桫椤不同的是，在探究不同植物生长调节剂对大叶黑桫椤诱导GGB的影响实验中，采用单因子设计实验。结果显示，IBA对诱导GGB的效果最优，诱导率为52.00%，增殖倍数为4.67，分化率达45.33%，均高于阴生桫椤。可见，植物生长调节剂对桫椤属植物诱导GGB、GGB分化的作用，具有种间差异。另外，在大叶黑桫椤GGB分化实验中，GGB在没有植物生长调节剂处理的情况下分化率极低，为8.0%。但加入高浓度的KT和IBA却明显抑制GGB分化，这说明GGB分化需要有低浓度的外源植物生长调节剂刺激，但高浓度植物生长调节剂反而抑制分化。
不管是单因子实验，还是双因子实验，本研究所用的2种桫椤属植物GGB诱导率和分化率都在50%左右，明显高于水鳖蕨（Asplenium delavayi）、日本肾蕨（Nephrolepis cordfolia）。在水鳖蕨、日本肾蕨的组织培养过程中，前人往细胞分裂素BA中添加NAA、IBA等细胞生长素，诱导GGB的效果最理想，但诱导率只有30%左右[23-24]，这说明利用GGB途径繁殖桫椤属植物可行，但是日后还需要设置双因子交叉实验，或者多因子实验，以筛选高效的GGB诱导配方。
在阴生桫椤幼苗移栽实验中，基质为泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1时，幼苗成活率最高，达60%以上。而在大叶黑桫椤幼苗移栽时，采用这个基质配方，其移栽后成活率远远低于阴生桫椤，这可能是由于阴生桫椤于12月进行移栽，移栽时气温适宜;而大叶黑桫椤于9月份进行移栽，移栽时气温过高。移栽成活率低的具体原因还需要进一步研究。
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责任编辑：沈德发
关键词：阴生桫椤;大叶黑桫椤;GGB;组织培养
中图分类号：Q813.1 文献标识码：A
Technology for Rapid Propagation in Vitro of Two Alsophila Species
LANG Yueting1，2， MA Changwang1，2*， YU Jing1，2， GUO Rui1，2， YAN Yuehong3， YANG Dongmei1，2*
1. College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Plants of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Shanghai Chenshan Botanical Garden / Shanghai Chenshan Plant Science Research Center， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201602， China
Abstract： Alsophila latebrosa and A. gigantea both have high scientific value and ornamental value. The construction of the rapid propagation system of them by gametophy-induced Green Globular Bodies （GGB） pathway was studied. In the rapid propagation system of A. latebrosa， the most optimal culture formula for spore germination was 1/10MS， the best culture medium for inducing gametophytes to produce GGB was 1/2MS+NAA 0.3 mg/L+6-BA 0.5 mg/L， sucrose 30 g/L and agar 6.5 g/L， the most suitable formula for GGB differentiation factor was 1/2MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L， and the survival rate of sporophyte seedlings was the highest in the substrate （peat∶garden soil∶perlite = 3∶3∶1）. In the fast propagation system of A. gigantea， the relatively suitable medium was 1/10MS， the most optimal formula for GGB induction was 1/2MS+0.3 mg/L IBA， NAA of 0.3 mg/L had the most significant effect on GGB differentiation， the combination of 0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA could promote the rooting the sporophyte seedlings. It only took 6-8 months by gametophy-induced GGB pathway for the culture of the two Alsophila species， from spore germination to seeding transplanting. Therefore， this pathway not only increased the propagation coefficiency， but also greatly reduced the propagation time of Alsophila species， which could enhance the industrial seeding of Alsophila species. Keywords： Alsophila latebrosa; Alsophila gigantea; green globular bodies; tissue culture
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.010
桫欏科（Cyatheaceae）隶属于蕨类植物门（Pteridophyta）薄囊蕨纲（Leptosporangiopsida）桫椤目（Cyatheales），全世界有3属600多种，其中中国有2属14种2变种，分别是桫椤属（Alsophila）和白桫椤属（Sphaeropteris），主要分布在云南、广西、广东、海南、台湾等地[1-3]。桫椤科植物古老而特别，是现存的唯一的树蕨类植物，对物种起源、进化和植物地理区系等研究具有重要价值，在古地质学、古生物学及古气候学等学科，常被当做理想的研究材料。另外，桫椤科植物形态优美，观赏性高，在广州、深州等地区已经被广泛应用[4-5]。可见，桫椤科植物既有科学价值，又有很高的观赏价值。但由于生境破坏、过度采挖，桫椤科植物的生存现状不容乐观。因此，有必要对其展开繁殖技术研究，利用组织培养的方法构建快繁体系，一方面保护野生的桫椤科植物资源，另一方面促进桫椤科植物在园林上的应用。
前人对桫椤科植物繁殖生物学的研究，主要集中在孢子形态、配子体发育等基础研究，而有关桫椤科植物快繁体系构建方面的研究较少，主要有莫新寿等[6]、陈封政等[7]、张祖荣等[8]利用无菌播种的途径，培育桫椤科植物幼苗。目前尚未见到通过绿色球状体（Green Globular Bodies，GGB）途径培养桫椤科植物幼苗的报道。GGB是一种类似于兰科原球茎的组织[9]。跟其他组培途径相比，通过GGB途径能大大提高蕨类植物的增殖率[10]。Haruzo等[9]发现通过GGB生长的速率比通过丛生芽阶段繁殖更高。因此后来GGB组培繁殖途径在多种蕨类植物中得到应用，如鸟巢蕨（Neottopteris nidus）、乌毛蕨（Blechnum orientale）、凤尾蕨（Pteris cretica）等[11-14]。由于前人研究结果显示不同的培养基和植物生长调节剂对组培苗的生长发育有显著性影响[15]，故本研究对其进行单因子试验、双因子交叉试验及多因子正交试验设计。
本研究以桫椤属植物作为研究对象，选取了阴生桫椤（Alsophila latebrosa）、大叶黑桫椤（Alsophila gigantea），利用GGB途径展开快繁体系的研究，以筛选最优的繁殖体系，为桫椤属植物的大规模生产和应用提供可靠依据。由于先采集到阴生桫椤的孢子叶，后采集到大叶黑桫椤的孢子叶，因此在进行阴生桫椤的组织培养实验基础上，另行设计了大叶黑桫椤组织培养的实验方案。
1 材料与方法
1.1 材料
2种桫椤属植物的孢子均采集于海南岛的五指山、吊罗山（琼中太平乡段）、黎母山。将采集的孢子叶放到纸袋中并通风晾干，然后将自然散落的孢子收集于离心管内，放置于4 ℃冰箱中储存备用。
1.2 方法
1.2.1 阴生桫椤快繁体系 （1）孢子的消毒及赤霉素预处理。在离心管中加入阴生桫椤孢子与无菌水，充分震荡后静置12 h;以4 000 r/min离心1 min，吸走上层无菌水，重复3次;加入75%酒精并充分震荡，无菌水清洗3次;再加入4%～5% NaClO溶液，充分震荡后，离心4 min，用蒸馏水清洗4次;分别把不同浓度的GA3（表1）加入离心管中，处理3 min，再用无菌水清洗3次，最后每个处理制成3管孢子悬浊液，3个处理共9管。
（2）不同赤霉素预处理、蔗糖浓度和无机盐浓度对孢子萌发的影响。把经过不同浓度GA3预处理的孢子悬浊液，接种在不同蔗糖浓度和无机盐浓度的培养基上（表1）。采用L9（34）正交设计实验，共9个处理，每个处理3皿，共27皿，每皿接种0.2 mL孢子悬浊液。琼脂6.5 g/L，pH 5.8。将培养皿放入培养室中进行培养，培养室温度（232）℃，光强15～20 μmol/（m2·s），光照周期12 h/d。接种后每周观察1次，孢子萌发后采用光学显微镜观察，统计孢子的萌发率。孢子萌发率计算方法：随机取10个显微视野，统计孢子总数和萌发的孢子数，计算平均孢子萌发率。
（3）NAA、6-BA对GGB诱导的影响。本实验设置0、0.1、0.3、0.5 mg/L 4个水平的NAA浓度和0、0.2、0.5、1.0 mg/L 4个水平的6-BA浓度进行双因子交叉实验，共16个处理，每个处理接种10皿，重复3次。基本培养基为1/2 MS，蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH 5.8。接种后每周观察1次，3～4周后继代1次，观察并记录GGB大小、数量，计算GGB诱导率和增殖倍数。
（4）KT、IAA对GGB分化的影响。本实验选择2种植物生长调节剂KT（0、0.1、0.5、1.0 mg/L，4个浓度水平）、IAA（0、0.1、0.5、1.0 mg/L，4个浓度水平）设计双因子交叉实验。将GGB团切分，接种到不同植物生长调节剂及浓度组合的培养基中，共16个处理，每个处理接种5瓶，重复3次。接种后每周观察1次，统计GGB分化率。
（5）不同培养基质对无根苗生根的影响。将GGB分化得到的无根孢子体幼苗接种到以下5种培养基中：（1）1/2 MS;（2）1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+ NAA 0.2 mg/L;（3）1/2 MS+BA 0.05 g/L+IBA 0.05 g/L;（4）1/2 MS+IBA 0.2 mg/L;（5）1/2 MS+NAA 0.2 mg/L。蔗糖30.0 g/L，琼脂6.5 g/L，pH 5.8。每个处理接种5瓶，每瓶接种3株幼孢子体。接种后每周观察1次，观察记录生根数，测量根长、株高，统计生根率。 （6）不同培养基质对孢子体幼苗移栽成活率的影响。当孢子体幼苗长到株高3～4 cm、根长2～3 cm时，打开培养瓶并在培养室炼苗3 d，再放在自然光照下炼苗7 d，然后移栽至4种培养基质中（蛭石∶石沙=2∶1;菜园土∶泥炭土=2∶1;菜园土∶珍珠岩=2∶1;泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1）。每种基质移栽3盆，每盆10株，每周观察记录存活情况。
1.2.2 大叶黑桫椤快繁体系 （1）孢子悬浊液的制备。制备方法同1.2.1（1），但不进行赤霉素预处理。
（2）不同无机盐浓度对孢子萌发的影响。接种方法与培养条件同1.2.1（2），但大叶黑桫椤仅接种在不同无机盐浓度的培养基上，无机盐浓度为MS、1/2 MS、1/5 MS、1/8 MS、1/10 MS，共5个水平。
（3）NAA、IBA、KT、6-BA对GGB诱导的影响。通过前期预实验，筛选出1/2 MS为GGB诱导的基本培养基，选择2种细胞生长素NAA、IBA和2种细胞分裂素KT、6-BA，其浓度均设置为0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4个浓度水平，共16个处理。每个处理接种5瓶，每瓶接种5个配子体。蔗糖为30 g/L，琼脂7 g/L，pH 5.8。接种后，每10 d观察1次，把产生GGB的配子體移植到新的培养瓶里，完成继代增殖，记录GGB大小、数量，计算GGB诱导率。
（4）NAA、IBA、KT、6-BA对GGB分化的影响。植物生长调节剂为NAA、IBA、KT、6-BA，浓度均设置为0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4个浓度水平，共16个处理。每个处理接种5瓶，每瓶接种5个GGB团。基本培养基设置为MS，蔗糖为30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH 5.8。接种后每周观察1次，3周后统计GGB分化率。
（5）IAA、NAA对无根苗生根的影响。通过预实验，选择2种植物生长调节剂IAA、NAA，利用双因子交叉分组设计实验。这2种植物生长调节剂浓度水平都设置为0、0.1、0.3、0.5 mg/L，4个浓度水平，共16个处理。将无根的孢子体幼苗接种到不同浓度植物生长调节剂组合的培养基里，基本培养基为MS，蔗糖30.0 g/L，琼脂6.0 g/L，pH 5.8。每个处理接种5瓶，每瓶接种5个孢子体幼苗。接种后每周观察1次，3周后观察、记录生根数，测量根长、株高，统计生根率。
（6）炼苗和移栽。方法同1.2.1（6），但仅移栽到泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1的培养基质中。
1.3 数据处理
采用Excel 2016软件进行数据记录和统计，使用SPSS 22.0软件对结果进行分析，显著性水平设置为α=0.05。
2 结果与分析
2.1 阴生桫椤快繁体系
2.1.1 不同浓度的赤霉素、蔗糖、无机盐对孢子萌发的影响 表2显示，蔗糖、无机盐和赤霉素3因素的P值均大于显著性水平，即3个因素均对孢子萌发无显著性影响，因此，进行直观分析。表3显示，3个因素中，无机盐因素的极差R值最大，说明无机盐浓度对孢子萌发的影响最大，而且无机盐浓度为1水平（1/10 MS）时，其对应的K1值最大，为41.22，说明低浓度无机盐条件利于孢子萌发。其次是蔗糖因素，其极差R值仅次于无机盐，而且蔗糖浓度为1水平（0 g/L）时，对应的K1值最大，为42.67，显示孢子在低糖条件下萌发效果较好。赤霉素因素的极差R值最小，说明赤霉素对阴生桫椤孢子的萌发的影响最小，而且赤霉素为1水平（0 mg/L）时，对应的K1值最大，说明不用赤霉素处理有利于孢子萌发，加入赤霉素反而抑制孢子萌发。3个因素的K1值都最大，这说明赤霉素、蔗糖、无机盐分别在1水平时，对孢子萌发的促进效果最优。萌发率结合萌发时间来看，1/10 MS培养基是阴生桫椤孢子萌发的最优培养基，萌发率可达62.33%，2周后开始萌发（图1A、图1B）。
2.1.2 NAA、6-BA对诱导配子体产生GGB的影响 在诱导率方面，方差分析结果显示，NAA、6-BA不同浓度组合对配子体诱导GGB具有显著影响;进行多重比较结果显示，处理10的诱导率最高为46.67%，与其他处理之间有显著差异（处理5～7除外）。在增殖倍数方面，方差分析结果显示，各处理之间GGB增殖倍数具有显著差异，说明2种植物生长调节剂不同浓度的组合对GGB的增殖有显著影响;多重比较结果显示，处理10的增殖倍数最高为3.67，与其他处理有显著差异（处理2、5～7及14除外）。从GGB生长情况来看，随着植物生长调节剂浓度的增加，GGB会褐化或配子体会变黄，但浓度过低时，GGB呈团松散且生长缓慢。大部分GGB集中在4周～6周之间被诱导出来，极少数在9周之后才诱导出来（表4）。综上所述，配子体诱导产生GGB的最适植物生长调节剂组合为处理10，即NAA 0.3 mg/L+ 6-BA 0.5 mg/L，诱导率可达46.67%，增殖倍数可达3.67，6周左右诱导出GGB，且GGB团长势良好，呈绿色球状（图1C～图1F）。
2.1.3 KT、IAA对诱导GGB分化的影响 方差分析结果表明，各处理之间GGB分化率具有显著差异。处理1、4、8、11、13的分化率都为0，说明高浓度的KT和IAA都对GGB的分化有抑制作用;KT浓度超过0.5 mg/L或者小于0.1 mg/L都不利于GGB的分化，IAA浓度超过0.5 mg/L或者小于0.1 mg/L也不利于GGB的分化，只有2种植物生长调节剂在0.1～0.5 mg/L之间时对GGB 的分化有促进作用。从多重比较结果来看，处理6与其他处理之间具有显著性差异，促进GGB分化的效果最理想（表5）。分化率结合分化时间来看，诱导GGB分化的最适植物生长调节剂组合为处理6，即KT 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L，其诱导分化率为38.90%，GGB分化产生幼孢子体芽苗的时间为7周（图1G～图1H）。 2.1.4 不同培养基对无根孢子体幼苗生根的影响 方差分析结果显示，各处理间具有显著差异。多重比较结果显示，处理2与其他处理差异显著，平均生根率最高，为77.80%。所有处理的大部分幼苗在株高长到3～4 cm的时候，根有2～3 cm长，每株有2～4根。生根时间为3～4周，其中处理2的生根时间为3周（表6）。因此，阴生桫椤孢子体幼苗最适的生根植物生长调节剂配方为处理2，即1/2 MS+IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L（图1 I）。实验还发现，在不加入外源植物生长调节剂的处理1具有较高的生根率，与添加了植物生长素和细胞分裂素的处理3、4、5的生根率相当。这说明植物生长调节剂需要控制适当的浓度，才能促进孢子体幼苗的生根，否则会起抑制作用。
2.1.5 不同培养基质对孢子体幼苗移栽成活率的影响 方差分析结果显示，基质对幼苗的成活率具有显著性影响。幼孢子体苗在处理4（泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1）的成活率最高，4周后最高成活率可达67.73%（表7）（图1J～图1L）。
2.2 大叶黑桫椤快繁体系
2.2.1 无机盐浓度对孢子萌发的影响 方差分析结果显示，无机盐浓度对大叶黑桫椤的孢子萌发没有显著性影响（表8）。不同盐浓度下，孢子都能萌发，萌发率为24.53%～40.66%，萌发时间为14～28 d。其中1/10 MS处理下的孢子萌发率最高，为40.66%，萌发时间也较早，2周开始萌发（图2A、图2B）。
2.2.2 不同植物生长调节剂对诱导GGB的影响 结果显示，IBA、NAA、KT、6-BA这4种植物生长调节剂对诱导大叶黑桫椤的配子体产生GGB都有促进作用;在不添加植物生长调节剂时，GGB诱导率为0。方差分析结果显示，处理之间GGB诱导率和增殖倍数差异显著。从表9可见，2种细胞生长素中，IBA诱导产生GGB的效果强于NAA;2种细胞分裂素中6-BA的诱导效果比KT更好，但6-BA随着浓度的提高，诱导率大幅下降，说明低浓度的6-BA对诱导GGB有良好效果。多重比较结果显示，处理E2（IBA，浓度为0.3 mg/L）与其他处理（E14除外）均有显著差异，诱导率最高，达52.00%，其次为E14（6-BA，浓度为0.5 mg/L），诱导率为46.47%。而处理E5（NAA，浓度为0.1 mg/L）、E8（NAA，浓度为1.0 mg/L）、E15（6-BA，浓度为1.0 mg/L）的诱导率为0。从增殖倍数来看，最大增殖倍数为E2处理，增殖倍数为4.67，与其他处理（E4、E13、E14除外）有显著差异，其次为E14（6-BA，浓度0.5 mg/L），增殖倍数为4.44。从GGB出现的时间来看，大量产生GGB的时间集中在28～ 35 d，其中E2处理28 d出现GGB。因此，IBA和6-BA这2种植物生长调节剂对GGB增殖的促进作用较好。0.3 mg/L IBA是诱导大叶黑桫椤GGB分化和增殖的最优植物生长调节剂配方，诱导率可达52.00%，增殖倍数为4.67（图2C～图2I）。
2.2.3 植物生长调节剂对GGB分化的影响 结果显示，2种细胞生长素中NNA对GGB分化的诱导效果要强于IBA，2种细胞分裂素中6-BA诱导GGB分化的效果要强于KT，4种植物生长调节剂中NAA对GGB分化的刺激作用最明显。方差分析结果显示，不同植物生长调节剂及浓度处理对GGB分化率具有显著影响（表10）。多重比较结果显示，处理F6（NAA 0.3 mg/L）对大叶黑桫椤GGB分化的促进作用最显著，与其他处理（F14除外）之间有显著差异。但是，随着4种植物生长调节剂浓度的增加，GGB的分化率降低，甚至出现抑制分化的情况。如处理F4（IBA 1.0 mg/L）、F11（KT 1.0 mg/L）、F12（KT 2 mg/L）等分化率为0，出现了明显的抑制分化作用。这说明高浓度的植物生长调节剂对GGB的分化具有抑制作用。综上所述，0.3 mg/L NAA对大叶黑桫椤GGB分化的促进作用最显著，分化率最高可达45.33%（图2J）。
2.2.4 不同浓度IAA、NAA对无根苗生根的影响 方差分析结果显示，不同浓度的IAA和NAA组合对生根率具有显著影响。多重比较结果显示，处理G10（0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA）的生根率最高，达52.00%，与其他处理有显著的差异;处理G13（0 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA）的生根率最低，为21.33%（表11）。可见，0.1 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA的组合对刺激大叶黑桫椤的孢子体幼苗生根的作用最优，生根率可达52.00%。
2.2.5 炼苗和移栽 炼苗和移栽的方法与阴生桫椤一样，但是大叶黑桫椤幼苗移栽15 d后，大部分幼苗枯萎（图2K～图2L）。
3 讨论
本研究结果显示，赤霉素对阴生桫椤的孢子萌发没有显著影响，这与前人的研究结果不同。前人的研究结果显示，桫椤科植物有休眠期，需要用赤霉素打破休眠期[16]，但是本研究发现，未经过赤霉素处理的阴生桫椤的孢子反而具有更高的萌发率。由于在阴生桫椤的实验中，发现赤霉素对孢子的萌发没有积极效应。因此，在大叶黑桫椤的实验中仅考虑不同无机盐浓度对孢子萌发率的影响。
本研究发现阴生桫椤的孢子在低糖、低鹽浓度的培养基中萌发率较高。在蔗糖浓度方面，与前人的研究结果一致，刘保东等[17]、孙晓丹[18]的研究表明，低浓度蔗糖有利于肾蕨（Nephrolepis auriculata）、桂皮紫萁（Osmunda cinnamomea var. asiatica）的孢子萌发;在无机盐浓度方面，本研究结果与前人的相反，前人的研究表明，粗梗水蕨（Ceratopteris pteridoides）[19]、球子蕨（Onoclea sensibilis）[20]等在高盐浓度的培养基中孢子萌发情况比在低盐浓度中好。本研究中不同浓度的无机盐对大叶黑桫椤孢子萌发的影响效果不显著，1/10MS培养基相对效果较好，这与徐艳等[21]的实验结果相似，这可能是因为大叶黑桫椤孢子内含有足够的氮源，或者在孢子萌发过程中会分解产生部分氮，所以在组织培养时不需要外加太多氮源。 本研究中在阴生桫椤的GGB分化阶段，分化率偏低。这可能与分化阶段所用的植物生长调节剂种类、浓度有关。前人研究表明，植物生长调节剂对蕨类植物诱导GGB和GGB分化起着关键性的作用，不同种类和浓度对植物诱导GGB和GGB分化的影响不同[22]。本研究通过前期大量预实验，筛选了2种诱导GGB效果较好的植物生长调节剂NAA、6-BA和2种对GGB分化有良好促进作用的植物生长调节剂KT、IAA，进行双因子交叉实验，结果表明不同浓度的植物生长调节剂组合对诱导GGB和GGB分化有促进作用，但诱导率最高不逾50%，增殖位数不及4，分化率最高不逾40%。因此，日后还应进行浓度梯度更小的双因子实验，甚至多因子实验，以筛选最合适的植物生长调节剂组合和浓度，进一步提高阴生桫椤的GGB诱导率和GGB分化率。与阴生桫椤不同的是，在探究不同植物生长调节剂对大叶黑桫椤诱导GGB的影响实验中，采用单因子设计实验。结果显示，IBA对诱导GGB的效果最优，诱导率为52.00%，增殖倍数为4.67，分化率达45.33%，均高于阴生桫椤。可见，植物生长调节剂对桫椤属植物诱导GGB、GGB分化的作用，具有种间差异。另外，在大叶黑桫椤GGB分化实验中，GGB在没有植物生长调节剂处理的情况下分化率极低，为8.0%。但加入高浓度的KT和IBA却明显抑制GGB分化，这说明GGB分化需要有低浓度的外源植物生长调节剂刺激，但高浓度植物生长调节剂反而抑制分化。
不管是单因子实验，还是双因子实验，本研究所用的2种桫椤属植物GGB诱导率和分化率都在50%左右，明显高于水鳖蕨（Asplenium delavayi）、日本肾蕨（Nephrolepis cordfolia）。在水鳖蕨、日本肾蕨的组织培养过程中，前人往细胞分裂素BA中添加NAA、IBA等细胞生长素，诱导GGB的效果最理想，但诱导率只有30%左右[23-24]，这说明利用GGB途径繁殖桫椤属植物可行，但是日后还需要设置双因子交叉实验，或者多因子实验，以筛选高效的GGB诱导配方。
在阴生桫椤幼苗移栽实验中，基质为泥炭土∶菜园土∶珍珠岩=3∶3∶1时，幼苗成活率最高，达60%以上。而在大叶黑桫椤幼苗移栽时，采用这个基质配方，其移栽后成活率远远低于阴生桫椤，这可能是由于阴生桫椤于12月进行移栽，移栽时气温适宜;而大叶黑桫椤于9月份进行移栽，移栽时气温过高。移栽成活率低的具体原因还需要进一步研究。
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责任编辑：沈德发