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摘要
本文在平板对峙法测定桑氏链霉菌突变株MV2和MV4拮抗活性的基础上，用不同有机溶剂对其发酵液和菌丝体进行萃取，采用孔洞法测定发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌活性，并分析活性物质的热、酸碱、光稳定性，耐储藏性和对福美双的耐受性；通过盆栽试验，探索突变株抑菌物质和福美双对杨树紫纹羽病的防治效果。结果表明，两株突变株和原始菌株KJ40对除终极腐霉外的7种植物病原真菌均有拮抗作用，对紫纹羽丝核菌作用最强。乙酸乙酯的发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌效果最明显；突变株MV2的抑菌效果略好于MV4和KJ40。在稳定性检测中，突变株比原始菌株具有更好的热、酸碱、光、储藏稳定性，对福美双耐受性更强。说明突变株更适宜于生产，具有较大的开发潜力。在盆栽防效试验中，抑菌物质和福美双混合施用比单独施用效果更好，其中MV2和福美双混合施用预防杨树紫纹羽病的效果最好，防治效果超过80%；原始菌株的抑菌物质无论和福美双混合还是单独施用，效果都不如突变株。
关键词
桑氏链霉菌；突变菌株；抑真菌作用；防治效果
中图分类号：
S 763.15
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.010
Abstract
On the basis of antagonistic activity of Streptomyces sampsonii mutant strains tested with dual culture method， the fermentation liquid was extracted by different organic solvents. The antifungal activities of fermentation liquid extract and mycelium extract were studied by hole method， and the thermal， pH， ultraviolet light， storage stability， and tolerance to thiram of the active antifungal substances were analyzed. The control effect of the active substances of mutant strain and thiram was explored in potted experiments. The results showed that two mutant strains （MV2 and MV4） and original strain KJ40 had antagonistic effects on seven species of pathogens except Pythium ultimum， and the effect was strongest on Rhizoctonia crocorum. The antifungal effects of liquid extract and mycelium extract were also most obvious by ethyl acetate extraction. The effect of mutant strain MV2 was slightly better than MV4 and the original strain. In the stability testing， the mutant strain had better thermal， pH， ultraviolet light and storage stability than the original strain， and the tolerance against thiram was stronger. In the potted experiment， the effect of mixed application of antifungal substances and thiram was better than separate application， of which the incidence was lowest and control effect was more than 80% in the mixed application of MV2 and thiram. The antifungal effect of original strain was not as good as that of the two mutant strains whether mixed with thiram or separate application.
Key words
Streptomyces sampsonii；mutant strain；antifungal effect；control effect
随着对环境健康、食品安全的重视，逐步降低化学农药用量是控制植物病害的趋势。由此，开发高效低毒、环境兼容性好的替代化学杀菌剂的新型生物农药是目前国内外植物保护领域研究的热点之一[12]。尽管如此，由于生防微生物种群的繁殖易受到环境温度、湿度、土壤pH等诸多因素的影响，药效反应慢，作用效果大多不明显甚至无效[34]。有报道指出[5]，生防微生物和化学农药混合使用，不仅可以降低化学农药的使用量，减轻对环境的污染，还因为化学杀菌剂削弱了病原菌的生长，使其对生防菌更加敏感，从而提高了生防微生物的防治效果。因此，生物农药的研究和开发要根据现有的基础和优势有针对性地发展。紫纹羽病又称紫色根腐病，是由紫纹羽丝核菌（ Rhizoctonia crocorum Fr.）引起的一种苗木病害。该菌寄主范围广泛，达45科，76属，100多种，包括松、柏、杉、刺槐、杨、榆、桑、柳、苹果等，是一种重要的土传病原菌。利用生防微生物防治紫纹羽丝核菌的研究，在国内外还未见报道。 链霉菌属（Streptomyces）是放线菌中分布最广、种类最多的一个属，也是用于植物病虫害生物防治最重要的一个属[67]。现已筛选出许多种具有生防价值的链霉菌，例如灰黄链霉菌（S.flavogriseus）、哥斯达黎加链霉菌（S.costaricanus）、灰色链霉菌（S.griseus）、利迪链霉菌（S.lydicus）、波赛链霉菌（S.peucetius）等，这些链霉菌在植物病害的防治中起到了重要作用[8]，生防链霉菌的研究主要集中在作物病害生物防治方面，如水稻纹枯病[9]、香蕉黑星病[10]、马铃薯土传病害[11]、烟草细菌性枯萎病[12]等，在林木植物上报道较少。链霉菌所产生的抗生素[13]、酶类[1416]等一系列次生代谢产物在医疗、农业与食品领域已被广泛开发利用。桑氏链霉菌（S.sampsonii）KJ40是本实验室从杨树根系中分离到的一株对紫纹羽丝核菌有较强抑制作用的放线菌[17]，还能够产生几丁质酶。国内外对该菌研究较少，Jain等[18]从花园的土壤中分离得到S.sampsonii GS1322菌株，发现其对指示真菌白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum）和毛癣菌属（Trichophyton sp.）均具有抑制作用。由于野生链霉菌对农药抗药性差，农药对具生防作用的菌株也有杀灭效果。福美双是一种广泛应用的植物杀菌剂，对多种疫病、立枯病、猝倒病、根腐病等有较好的防治作用[19]。本研究测定了对福美双具有抗性的2株桑氏链霉菌突变株MV2、MV4[20]对8种重要林木真菌的抑制作用，并探索了其发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌活性，研究了抑菌物质在不同温度、pH、光照、储藏温度条件下的稳定性及对福美双耐受性，将抑菌物质与福美双用于杨树紫纹羽病的盆栽防治试验，旨在为将其制作成生物农药投放生产提供实践依据。
1材料与方法
1.1供试拮抗菌和病原菌
桑氏链霉菌（S.sampsonii）原始菌株KJ40和抗福美双突变株MV2、MV4[20]，由四川农业大学林学院森林保护省级重点实验室分离、鉴定、诱变和保存。病原菌：红豆杉根腐病病菌（终极腐霉 Pythium ultimum Trow）、板栗疫病病菌[寄生隐丛赤壳菌Cryphonectria parasitica（Murr.）Barr.]、松落针病病菌[松针散斑壳菌 Lophodermium pinastri （Schrad.） Chevall.]、杨树紫纹羽病病菌[紫纹羽丝核菌R.crocorum （Pers.） DC.]、杂交竹梢枯病病菌[暗孢节菱孢菌Arthrinium phaeospermum （Corda） M.B.Ellis]、桉树焦枯病病菌（帚梗柱枝孢霉 Cylindrocladium scoparium Morgan）、山茶灰斑病病菌[茶褐斑拟盘多毛孢Pestalotiopsis guepinii （Desm.） Stey.]、油橄榄孔雀斑病病菌[橄榄环黑星霉Spilocaea oleaginea （Cast.） Hughes = Cycloconium oleaginum Cast.]， 由四川农业大学林学院森林保护省级重点实验室提供。
1.2供试植株
1年生欧美杂交杨（Populus deltoides×P.nigra）由四川省崇州市桤泉镇杨树苗圃提供。
1.3培养基及试剂
牛肉膏蛋白胨（NA）培养基（葡萄糖10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂粉20 g、NaCl 15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2）用于放线菌的培养；PDA 培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH自然）用于拮抗性测定；发酵培养基（葡萄糖10 g、黄豆饼粉10 g、蛋白胨3 g、NaCl 2.5 g、CaCO3 2 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0）；所用试剂均为国产AR级试剂。乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、甲苯、丙酮、甲醇，购自成都市科龙化工试剂厂；40%福美双可湿性粉剂，购自山东潍坊万盛生物农药有限公司。
1.4KJ40及其突变株MV2和MV4的平板抑菌效果测定
采用平板对峙法[21]：将活化的直径5 mm的各病原菌菌碟分别与拮抗菌株KJ40、MV2、MV4在PDA平板距中心25 mm对称的两点接种。26 ℃培养5 d后，观察记录抑菌情况，测定病原菌的菌落直径，计算抑制率，以只接病原菌为对照，每处理重复3次。菌落直径（mm）=测量菌落直径-5.0；菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径× 100。
1.5KJ40及其突变株MV2和MV4的发酵液制备
分别将106 cfu/mL的KJ40和MV2、MV4的孢子悬浮液按1%（v/v）的接种量接种至盛有200 mL发酵培养基的300 mL三角瓶中，26 ℃、140 r/min 振荡培养3 d，发酵液于12 000 r/min离心20 min，收集上清液和菌丝体于4 ℃冷藏备用。
1.6KJ40及其突变株MV2和MV4的发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌作用
萃取液的制备[22]：取MV2、MV4，以及原始菌株KJ40的发酵液，分别用2倍体积的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、甲苯溶液萃取，经RE2000E旋转蒸发器（上海科升仪器有限公司）浓缩至完全干燥，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4 ℃下冷藏备用。
菌丝体浸出物的制备[22]：取MV2、MV4，以及原始菌株KJ40的菌丝体，分别用乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇各50 mL超声处理15 min，常温下浸出48 h后过滤，滤液经RE2000E旋转蒸发器浓缩至完全干燥，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4 ℃下冷藏备用。 抑菌作用测定：采用孔洞法[23]。将供试病原菌菌饼（d=5 mm）置于PDA培养基中央，距菌饼3 cm处用打孔器（d=5 mm）打孔，每孔加入100 μL发酵液萃取物或菌丝体浸出物，每种病原菌做3次重复，以只接病原菌为对照，置于26 ℃下培养，待对照菌落长满平板为止，观察并测量抑菌圈直径。
1.7KJ40及其突变株MV2和MV4抑菌活性物质的稳定性测定
将KJ40、MV2和MV4中抑菌作用最强的有机溶剂萃取液和菌丝体浸出物合并，旋转蒸发器浓缩至完全干燥，甲醇溶解，即为含抑菌物质的混合液，以紫纹羽丝核菌为指示菌，测定抑菌活性物质的稳定性。热稳定性：将混合液分别置于40、60、80、100和121 ℃下处理30 min，冷却至室温；酸碱稳定性：将混合液分别用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl调至pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11，4 ℃过夜，然后再将各pH调回至中性；紫外光稳定性：将混合液置于28 W紫外灯下，距离10 cm处分别照射2、4、8、12、24 h；耐储藏性：将混合液置于2 mL封口离心管中，分别在-20、4、20、40、60 ℃的恒温条件下保存30 d后，恢复至室温；对福美双的耐受性：将混合液与200 μg/mL的福美双按体积比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合；以上各处理均采用1.6中孔洞法测定其抑菌活性，观察并测量抑菌圈直径，每处理设3次重复，以未经处理的混合液为对照。
1.8KJ40及其突变株MV2和MV4对紫纹羽丝核菌的盆栽防效
盆栽试验在四川农业大学林学院苗圃中进行。病原菌孢子悬浮液制备：将紫纹羽丝核菌接种于PDA平板上，25～28 ℃培养，产孢后用无菌水配成104cfu/mL的孢子悬浮液备用。将杨树苗扦插于经高温灭菌的土壤里，经14 d，杨树苗生根后，分别用（1）MV2活性物质混合液；（2）MV4活性物质混合液；（3）KJ40活性物质混合液；（4）200 μg/mL的福美双；（5）200 μg/mL的福美双 MV2活性物质混合液（1∶1）；（6）200 μg/mL的福美双 MV4活性物质混合液（1∶1）；（7）200 μg/mL的福美双 KJ40活性物质混合液（1∶1）；（8）CK（无菌水）对杨树苗进行灌根[24]处理，每隔7 d灌根1次，每次20 mL，共3次，1个月后用制备的紫纹羽丝核菌孢子悬液60 mL进行灌根，每处理10株，重复3次。接种紫纹羽丝核菌30 d后，按下列方法进行病害调查统计，计算发病率、病情指数和防治效果。
病害分级标准[24]：0级，根部健康；1级，侧根腐烂<1/5；2级，1/5≤侧根腐烂<1/3；3级，1/3≤侧根腐烂≤2/3；4级，侧根腐烂>2/3甚至整株死亡。发病率（%）=（发病株数/总接种株数）×100；病情指数=[∑（各病级株数×代表级值）/（总株数×最高病级数）]×100；防治效果（%）=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100。
1.9数据分析
试验数据采用Excel和SPSS 19.0软件分析处理，LSD法进行多重比较（P<0.05）。
2结果与分析
2.1KJ40及其突变株MV2和MV4对病原菌的平板抑制效果
平板对峙法测定结果（表1）显示，KJ40及MV2、MV4对鞭毛菌亚门藻状菌纲的终极腐霉（P.ultimum）无抑制作用；对子囊菌亚门子囊菌纲的寄生隐丛赤壳菌（C.parasitica）和松针散斑壳（L.pinastri）抑制率达到70%以上；对半知菌亚门丝孢纲的暗孢节菱孢菌（A.phaeospermum）、帚梗柱枝孢霉（C.scoparium）、茶褐斑拟盘多毛孢（P.guepinii）、橄榄环黑星霉（S.oleaginea）抑制率均超过60%；对担子菌亚门层菌纲的紫纹羽丝核菌（R.crocorum）的抑制作用最强，菌落直径均低于15 mm，抑菌率高于90%，显著高于其余供试病原菌。从3种供试拮抗菌抑菌效果上看，MV2对病原菌抑制作用最强，但在病原菌菌落直径上除寄生隐丛赤壳菌和松针散斑壳外均与MV4、KJ40差异不显著；从抑菌率上看，MV2对寄生隐丛赤壳菌、松针散斑壳、暗孢节菱孢菌的抑菌率与MV4、KJ40差异显著；MV2对紫纹羽丝核菌的抑菌率与MV4差异显著，但与KJ40差异不显著。
2.2KJ40及其突变株发酵液萃取物及菌丝体浸出物的抑菌作用
KJ40、MV2和MV4发酵液的不同溶剂萃取物对供试病原菌的抑制作用结果（表2）显示，4种有机溶剂萃取物对终极腐霉、茶褐斑拟盘多毛孢、橄榄环黑星霉无抑制作用，对其余5种病原菌有不同程度的抑制作用，说明发酵液萃取物含有某些抗菌物质。在4种溶剂中，乙酸乙酯萃取物的抑菌效果高于其余3种，其中对紫纹羽丝核菌产生的抑菌圈直径最大，显著大于其余病原菌，孔洞周围出现明显的透明圈（图1）。在3种供试拮抗菌株中，MV2和MV4抑菌效果大部分略好于原始菌株KJ40，但除乙酸乙酯萃取物对紫纹羽丝核菌和帚梗柱枝孢霉的抑制作用与KJ40差异显著外，其余均不显著。MV2抑菌效果略好于MV4，但差异均不显著。
菌丝体浸出物对供试病原菌的抑制作用结果（表3）显示，4种有机溶剂浸出物对终极腐霉、寄生隐丛赤壳菌、帚梗柱枝孢霉无抑制作用，对其余5种病原菌有不同程度的作用，说明拮抗菌株胞内存在抑菌活性物质；结合表2结果，3种拮抗菌对寄生隐丛赤壳菌、帚梗柱枝孢霉有抑菌活性的物质只存在于发酵液萃取物中，而菌丝体浸出物中存在对茶褐斑拟盘多毛孢、油橄榄环黑星霉有抑菌作用的物质。同样，乙酸乙酯浸出物的抑菌效果显著优于其余3种溶剂，其中对紫纹羽丝核菌产生的抑菌圈直径最大，显著大于其余病原菌（P<0.05）。在3种供试拮抗菌株中，MV2和MV4抑菌效果稍好于原始菌株KJ40，但差异不显著。综合以上结果，乙酸乙酯萃取所得到发酵液萃取物和菌丝体浸出物抑菌效果最强。 2.3KJ40及其突变株MV2和MV4抑菌物质的稳定性
MV2、MV4和KJ40活性物质经不同温度处理30 min后，抑菌活性随温度升高而下降（图2a）。MV2和MV4的抑菌物质经40～80 ℃处理30 min，其抑菌活性下降不显著；100和121 ℃处理后，其抑菌活性虽显著低于对照和前3个温度处理，但抑菌圈直径仍在11 mm以上；KJ40中的抑菌物质经不同温度处理后，其抑菌活性降幅显著，121 ℃处理仅有5.5 mm抑菌圈，说明突变株所产生的活性物质比原始菌株的热稳定性更强。
酸碱稳定性结果（图2b）表明，随pH提高，3个拮抗菌株的抑菌活性增强，当pH为7时，抑菌活性达到最大，抑菌圈与对照差异不显著；但随pH继续增大，活性显著下降。对比突变株和原始菌株，可以看出不管pH高低，MV2、MV4的活性物质对病原菌产生的抑菌圈仍较大，均大于10 mm，说明突变株对酸碱的耐受性较强。
在紫外光下经不同时间照射后（图2c），随时间延长，KJ40及其突变株抑菌物质活性均降低。处理2 h，MV2和MV4的抑菌活性与未经照射的处理差异不显著，并且其降幅低于KJ40；处理24 h，KJ40活性物质的抑菌圈很小，说明其不耐紫外光照射，而MV2和MV4对紫外光有一定的耐受性。
KJ40及其突变株在不同温度中储藏30 d后（图2d），各处理的抑菌活性存在差异，-20 ℃和4 ℃储藏后3个菌株活性物质的抑菌活性变化不大，特别是2株突变株，其抑菌圈直径均大于14 mm。但20 ℃储藏后3个菌株的抑菌活性均有一定程度的降低，KJ40降幅最大；40和60 ℃储藏后，抑菌物质活性与-20 ℃和4 ℃比均显著下降。可见活性物质在4 ℃以下低温储藏更好。
在按不同比例与福美双混合后（图2e），从9∶1到5∶5之间，两株突变株抑菌物质活性差异不显著；当福美双含量继续增大，其活性降低。而KJ40抑菌物质加入福美双后其活性呈显著下降趋势，当与福美双的体积比达到1∶9时，其活性丧失，可见未经诱变的菌株对福美双耐受性较差。
综合来看， MV2抑菌物质的稳定性强于MV4，两者的活性物质比KJ40的活性物质更稳定。
2.4KJ40及其突变株MV2和MV4对杨树紫纹羽病的盆栽防效
KJ40、MV2、MV4单独施用及与福美双混合施用后，杨树紫纹羽病的发病率、病情指数和防治效果见表4。结果显示，单独接种抑菌物质，MV2和MV4的防效显著优于KJ40；MV2的防效略高于MV4，但差异不显著。与单独施用福美双相比，MV4的防效显著低于福美双，MV2的防效虽亦低于福美双，但差异不显著。抑菌物质和福美双混合施用均比单独施用效果更好，其中MV2和福美双混合施用杨树发病率显著降低，病情指数在10以下，防效最佳，超过80%。KJ40的抑菌物质无论单独施用还是和福美双混合施用，效果都不如MV2和MV4。以上结果说明，MV2和MV4产生的抑菌物质和福美双混用对杨树紫纹羽病有协同防治作用，且比KJ40更适宜在生产实践中用于病害的防治。
3讨论
由于传统农药以及新型生物农药的局限性，研究者更期望将具有抗药性的生物农药与化学农药相结合用于植物病害的防治，最大限度地发掘其生防潜力。本文以前期筛选到的具有抗药性、拮抗性稳定持久的桑氏链霉菌KJ40突变株MV2、MV4[20]为基础，研究其抑菌谱。平板对峙试验结果显示，2个突变株除对鞭毛菌亚门藻状菌纲的终极腐霉无抑制作用外，对其余7株分属于子囊菌亚门、半知菌亚门和担子菌亚门的林木病原真菌抑制作用较强。通过4种有机溶剂对KJ40及其突变株发酵液和菌丝体进行萃取，得到的发酵液萃取物和菌丝体浸出物活性物质抑菌谱较广，但仍对终极腐霉无作用，其中乙酸乙酯萃取的物质活性最强。汪鹰[25]报道灰藤黄链霉菌（Streptomyces griseoluteus）产生的多种吩嗪类活性代谢产物对终极腐霉有强烈抑制作用，与本试验结果不同，但链霉菌所产生的代谢产物多种多样，进一步的研究将集中在KJ40发酵产物中活性物质的分离纯化及结构鉴定，并对抑菌机理进行探索。结果中突变株和原始菌株及其活性物质均对杨树紫纹羽病病原菌紫纹羽丝核菌抑制作用最强，这可能与桑氏链霉菌本身就来自杨树根系有关。突变株MV2及其活性物质抑菌作用最强，可能与诱变前后菌株产生的抑菌物质种类有所不同使得抑菌效果不同有关。本文只选择几种代表性林木病原真菌，为将桑氏链霉菌发展成为广谱性生防菌，下一步试验应扩大测试病原菌范围。
在稳定性检测中，MV2和MV4产生的抑菌物质具有较好的热稳定性、较宽的pH作用范围，抗紫外线辐射能力也较强，而原始菌株各种稳定性均较差，因此，突变株的特性使其在生产实践中比原始菌株更能适应环境，具有更大的开发潜力。但在高温中储藏后抑菌物质的活性显著下降，结合隋勤等[2]的报道，可合理选择相应的稳定剂等助剂，对将实际投入应用的生防制剂剂型进行深加工，以增加其货架期和田间防治效果。另外， MV2、MV4和KJ40对福美双的耐受性也表明，突变株抑菌混合物在与福美双不同配比下其活性仍较强，而原始菌株抑菌活性则显著降低甚至丧失。
虽然笔者曾将桑氏链霉菌发酵液直接用于杨树紫纹羽病的防治[17]，但由于链霉菌在自然条件下定殖及繁殖能力还不够稳定[26]，如果直接和农药混用，将限制生防菌的存活率和向侵染部位的转运效率[27]。本试验尝试将桑氏链霉菌突变株产生的抑菌物质用于病害的防治，获得了很大突破，作用方式更直接，生物活性成分更高，这与张晓云[28]将枯草芽胞杆菌抗菌蛋白应用于黄瓜白粉病中的结果一致。盆栽试验还表明，福美双 MV2活性物质混合施用防效最好，显著高于两者单独施用，MV2、MV4的抑菌物质对病原菌的抑制作用较KJ40有所提高；能让紫纹羽丝核菌无法扩展生长，达到杀灭紫纹羽丝核菌的效果。这一结果有效降低放线菌抗菌物质对化学药剂的敏感性，增加其生防潜能，使生防菌剂与杀菌剂协同效应在综合防治体系中的应用成为可能。但本试验中用的是无菌土，田间试验的环境比盆栽试验更为复杂，生防菌会受到温度、湿度、土壤pH等的影响，田间试验的结果可能会与盆栽试验不一致[29]。MV2、MV4及其活性物质能否在田间土壤中定殖、在田间试验中是否具有防治作用还需进一步探究。 参考文献
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（责任编辑：杨明丽）
本文在平板对峙法测定桑氏链霉菌突变株MV2和MV4拮抗活性的基础上，用不同有机溶剂对其发酵液和菌丝体进行萃取，采用孔洞法测定发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌活性，并分析活性物质的热、酸碱、光稳定性，耐储藏性和对福美双的耐受性；通过盆栽试验，探索突变株抑菌物质和福美双对杨树紫纹羽病的防治效果。结果表明，两株突变株和原始菌株KJ40对除终极腐霉外的7种植物病原真菌均有拮抗作用，对紫纹羽丝核菌作用最强。乙酸乙酯的发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌效果最明显；突变株MV2的抑菌效果略好于MV4和KJ40。在稳定性检测中，突变株比原始菌株具有更好的热、酸碱、光、储藏稳定性，对福美双耐受性更强。说明突变株更适宜于生产，具有较大的开发潜力。在盆栽防效试验中，抑菌物质和福美双混合施用比单独施用效果更好，其中MV2和福美双混合施用预防杨树紫纹羽病的效果最好，防治效果超过80%；原始菌株的抑菌物质无论和福美双混合还是单独施用，效果都不如突变株。
关键词
桑氏链霉菌；突变菌株；抑真菌作用；防治效果
中图分类号：
S 763.15
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.05.010
Abstract
On the basis of antagonistic activity of Streptomyces sampsonii mutant strains tested with dual culture method， the fermentation liquid was extracted by different organic solvents. The antifungal activities of fermentation liquid extract and mycelium extract were studied by hole method， and the thermal， pH， ultraviolet light， storage stability， and tolerance to thiram of the active antifungal substances were analyzed. The control effect of the active substances of mutant strain and thiram was explored in potted experiments. The results showed that two mutant strains （MV2 and MV4） and original strain KJ40 had antagonistic effects on seven species of pathogens except Pythium ultimum， and the effect was strongest on Rhizoctonia crocorum. The antifungal effects of liquid extract and mycelium extract were also most obvious by ethyl acetate extraction. The effect of mutant strain MV2 was slightly better than MV4 and the original strain. In the stability testing， the mutant strain had better thermal， pH， ultraviolet light and storage stability than the original strain， and the tolerance against thiram was stronger. In the potted experiment， the effect of mixed application of antifungal substances and thiram was better than separate application， of which the incidence was lowest and control effect was more than 80% in the mixed application of MV2 and thiram. The antifungal effect of original strain was not as good as that of the two mutant strains whether mixed with thiram or separate application.
Key words
Streptomyces sampsonii；mutant strain；antifungal effect；control effect
随着对环境健康、食品安全的重视，逐步降低化学农药用量是控制植物病害的趋势。由此，开发高效低毒、环境兼容性好的替代化学杀菌剂的新型生物农药是目前国内外植物保护领域研究的热点之一[12]。尽管如此，由于生防微生物种群的繁殖易受到环境温度、湿度、土壤pH等诸多因素的影响，药效反应慢，作用效果大多不明显甚至无效[34]。有报道指出[5]，生防微生物和化学农药混合使用，不仅可以降低化学农药的使用量，减轻对环境的污染，还因为化学杀菌剂削弱了病原菌的生长，使其对生防菌更加敏感，从而提高了生防微生物的防治效果。因此，生物农药的研究和开发要根据现有的基础和优势有针对性地发展。紫纹羽病又称紫色根腐病，是由紫纹羽丝核菌（ Rhizoctonia crocorum Fr.）引起的一种苗木病害。该菌寄主范围广泛，达45科，76属，100多种，包括松、柏、杉、刺槐、杨、榆、桑、柳、苹果等，是一种重要的土传病原菌。利用生防微生物防治紫纹羽丝核菌的研究，在国内外还未见报道。 链霉菌属（Streptomyces）是放线菌中分布最广、种类最多的一个属，也是用于植物病虫害生物防治最重要的一个属[67]。现已筛选出许多种具有生防价值的链霉菌，例如灰黄链霉菌（S.flavogriseus）、哥斯达黎加链霉菌（S.costaricanus）、灰色链霉菌（S.griseus）、利迪链霉菌（S.lydicus）、波赛链霉菌（S.peucetius）等，这些链霉菌在植物病害的防治中起到了重要作用[8]，生防链霉菌的研究主要集中在作物病害生物防治方面，如水稻纹枯病[9]、香蕉黑星病[10]、马铃薯土传病害[11]、烟草细菌性枯萎病[12]等，在林木植物上报道较少。链霉菌所产生的抗生素[13]、酶类[1416]等一系列次生代谢产物在医疗、农业与食品领域已被广泛开发利用。桑氏链霉菌（S.sampsonii）KJ40是本实验室从杨树根系中分离到的一株对紫纹羽丝核菌有较强抑制作用的放线菌[17]，还能够产生几丁质酶。国内外对该菌研究较少，Jain等[18]从花园的土壤中分离得到S.sampsonii GS1322菌株，发现其对指示真菌白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum）和毛癣菌属（Trichophyton sp.）均具有抑制作用。由于野生链霉菌对农药抗药性差，农药对具生防作用的菌株也有杀灭效果。福美双是一种广泛应用的植物杀菌剂，对多种疫病、立枯病、猝倒病、根腐病等有较好的防治作用[19]。本研究测定了对福美双具有抗性的2株桑氏链霉菌突变株MV2、MV4[20]对8种重要林木真菌的抑制作用，并探索了其发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌活性，研究了抑菌物质在不同温度、pH、光照、储藏温度条件下的稳定性及对福美双耐受性，将抑菌物质与福美双用于杨树紫纹羽病的盆栽防治试验，旨在为将其制作成生物农药投放生产提供实践依据。
1材料与方法
1.1供试拮抗菌和病原菌
桑氏链霉菌（S.sampsonii）原始菌株KJ40和抗福美双突变株MV2、MV4[20]，由四川农业大学林学院森林保护省级重点实验室分离、鉴定、诱变和保存。病原菌：红豆杉根腐病病菌（终极腐霉 Pythium ultimum Trow）、板栗疫病病菌[寄生隐丛赤壳菌Cryphonectria parasitica（Murr.）Barr.]、松落针病病菌[松针散斑壳菌 Lophodermium pinastri （Schrad.） Chevall.]、杨树紫纹羽病病菌[紫纹羽丝核菌R.crocorum （Pers.） DC.]、杂交竹梢枯病病菌[暗孢节菱孢菌Arthrinium phaeospermum （Corda） M.B.Ellis]、桉树焦枯病病菌（帚梗柱枝孢霉 Cylindrocladium scoparium Morgan）、山茶灰斑病病菌[茶褐斑拟盘多毛孢Pestalotiopsis guepinii （Desm.） Stey.]、油橄榄孔雀斑病病菌[橄榄环黑星霉Spilocaea oleaginea （Cast.） Hughes = Cycloconium oleaginum Cast.]， 由四川农业大学林学院森林保护省级重点实验室提供。
1.2供试植株
1年生欧美杂交杨（Populus deltoides×P.nigra）由四川省崇州市桤泉镇杨树苗圃提供。
1.3培养基及试剂
牛肉膏蛋白胨（NA）培养基（葡萄糖10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂粉20 g、NaCl 15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2）用于放线菌的培养；PDA 培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH自然）用于拮抗性测定；发酵培养基（葡萄糖10 g、黄豆饼粉10 g、蛋白胨3 g、NaCl 2.5 g、CaCO3 2 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0）；所用试剂均为国产AR级试剂。乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、甲苯、丙酮、甲醇，购自成都市科龙化工试剂厂；40%福美双可湿性粉剂，购自山东潍坊万盛生物农药有限公司。
1.4KJ40及其突变株MV2和MV4的平板抑菌效果测定
采用平板对峙法[21]：将活化的直径5 mm的各病原菌菌碟分别与拮抗菌株KJ40、MV2、MV4在PDA平板距中心25 mm对称的两点接种。26 ℃培养5 d后，观察记录抑菌情况，测定病原菌的菌落直径，计算抑制率，以只接病原菌为对照，每处理重复3次。菌落直径（mm）=测量菌落直径-5.0；菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径× 100。
1.5KJ40及其突变株MV2和MV4的发酵液制备
分别将106 cfu/mL的KJ40和MV2、MV4的孢子悬浮液按1%（v/v）的接种量接种至盛有200 mL发酵培养基的300 mL三角瓶中，26 ℃、140 r/min 振荡培养3 d，发酵液于12 000 r/min离心20 min，收集上清液和菌丝体于4 ℃冷藏备用。
1.6KJ40及其突变株MV2和MV4的发酵液萃取物和菌丝体浸出物的抑菌作用
萃取液的制备[22]：取MV2、MV4，以及原始菌株KJ40的发酵液，分别用2倍体积的乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、甲苯溶液萃取，经RE2000E旋转蒸发器（上海科升仪器有限公司）浓缩至完全干燥，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4 ℃下冷藏备用。
菌丝体浸出物的制备[22]：取MV2、MV4，以及原始菌株KJ40的菌丝体，分别用乙酸乙酯、氯仿、丙酮、甲醇各50 mL超声处理15 min，常温下浸出48 h后过滤，滤液经RE2000E旋转蒸发器浓缩至完全干燥，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，4 ℃下冷藏备用。 抑菌作用测定：采用孔洞法[23]。将供试病原菌菌饼（d=5 mm）置于PDA培养基中央，距菌饼3 cm处用打孔器（d=5 mm）打孔，每孔加入100 μL发酵液萃取物或菌丝体浸出物，每种病原菌做3次重复，以只接病原菌为对照，置于26 ℃下培养，待对照菌落长满平板为止，观察并测量抑菌圈直径。
1.7KJ40及其突变株MV2和MV4抑菌活性物质的稳定性测定
将KJ40、MV2和MV4中抑菌作用最强的有机溶剂萃取液和菌丝体浸出物合并，旋转蒸发器浓缩至完全干燥，甲醇溶解，即为含抑菌物质的混合液，以紫纹羽丝核菌为指示菌，测定抑菌活性物质的稳定性。热稳定性：将混合液分别置于40、60、80、100和121 ℃下处理30 min，冷却至室温；酸碱稳定性：将混合液分别用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl调至pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11，4 ℃过夜，然后再将各pH调回至中性；紫外光稳定性：将混合液置于28 W紫外灯下，距离10 cm处分别照射2、4、8、12、24 h；耐储藏性：将混合液置于2 mL封口离心管中，分别在-20、4、20、40、60 ℃的恒温条件下保存30 d后，恢复至室温；对福美双的耐受性：将混合液与200 μg/mL的福美双按体积比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合；以上各处理均采用1.6中孔洞法测定其抑菌活性，观察并测量抑菌圈直径，每处理设3次重复，以未经处理的混合液为对照。
1.8KJ40及其突变株MV2和MV4对紫纹羽丝核菌的盆栽防效
盆栽试验在四川农业大学林学院苗圃中进行。病原菌孢子悬浮液制备：将紫纹羽丝核菌接种于PDA平板上，25～28 ℃培养，产孢后用无菌水配成104cfu/mL的孢子悬浮液备用。将杨树苗扦插于经高温灭菌的土壤里，经14 d，杨树苗生根后，分别用（1）MV2活性物质混合液；（2）MV4活性物质混合液；（3）KJ40活性物质混合液；（4）200 μg/mL的福美双；（5）200 μg/mL的福美双 MV2活性物质混合液（1∶1）；（6）200 μg/mL的福美双 MV4活性物质混合液（1∶1）；（7）200 μg/mL的福美双 KJ40活性物质混合液（1∶1）；（8）CK（无菌水）对杨树苗进行灌根[24]处理，每隔7 d灌根1次，每次20 mL，共3次，1个月后用制备的紫纹羽丝核菌孢子悬液60 mL进行灌根，每处理10株，重复3次。接种紫纹羽丝核菌30 d后，按下列方法进行病害调查统计，计算发病率、病情指数和防治效果。
病害分级标准[24]：0级，根部健康；1级，侧根腐烂<1/5；2级，1/5≤侧根腐烂<1/3；3级，1/3≤侧根腐烂≤2/3；4级，侧根腐烂>2/3甚至整株死亡。发病率（%）=（发病株数/总接种株数）×100；病情指数=[∑（各病级株数×代表级值）/（总株数×最高病级数）]×100；防治效果（%）=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100。
1.9数据分析
试验数据采用Excel和SPSS 19.0软件分析处理，LSD法进行多重比较（P<0.05）。
2结果与分析
2.1KJ40及其突变株MV2和MV4对病原菌的平板抑制效果
平板对峙法测定结果（表1）显示，KJ40及MV2、MV4对鞭毛菌亚门藻状菌纲的终极腐霉（P.ultimum）无抑制作用；对子囊菌亚门子囊菌纲的寄生隐丛赤壳菌（C.parasitica）和松针散斑壳（L.pinastri）抑制率达到70%以上；对半知菌亚门丝孢纲的暗孢节菱孢菌（A.phaeospermum）、帚梗柱枝孢霉（C.scoparium）、茶褐斑拟盘多毛孢（P.guepinii）、橄榄环黑星霉（S.oleaginea）抑制率均超过60%；对担子菌亚门层菌纲的紫纹羽丝核菌（R.crocorum）的抑制作用最强，菌落直径均低于15 mm，抑菌率高于90%，显著高于其余供试病原菌。从3种供试拮抗菌抑菌效果上看，MV2对病原菌抑制作用最强，但在病原菌菌落直径上除寄生隐丛赤壳菌和松针散斑壳外均与MV4、KJ40差异不显著；从抑菌率上看，MV2对寄生隐丛赤壳菌、松针散斑壳、暗孢节菱孢菌的抑菌率与MV4、KJ40差异显著；MV2对紫纹羽丝核菌的抑菌率与MV4差异显著，但与KJ40差异不显著。
2.2KJ40及其突变株发酵液萃取物及菌丝体浸出物的抑菌作用
KJ40、MV2和MV4发酵液的不同溶剂萃取物对供试病原菌的抑制作用结果（表2）显示，4种有机溶剂萃取物对终极腐霉、茶褐斑拟盘多毛孢、橄榄环黑星霉无抑制作用，对其余5种病原菌有不同程度的抑制作用，说明发酵液萃取物含有某些抗菌物质。在4种溶剂中，乙酸乙酯萃取物的抑菌效果高于其余3种，其中对紫纹羽丝核菌产生的抑菌圈直径最大，显著大于其余病原菌，孔洞周围出现明显的透明圈（图1）。在3种供试拮抗菌株中，MV2和MV4抑菌效果大部分略好于原始菌株KJ40，但除乙酸乙酯萃取物对紫纹羽丝核菌和帚梗柱枝孢霉的抑制作用与KJ40差异显著外，其余均不显著。MV2抑菌效果略好于MV4，但差异均不显著。
菌丝体浸出物对供试病原菌的抑制作用结果（表3）显示，4种有机溶剂浸出物对终极腐霉、寄生隐丛赤壳菌、帚梗柱枝孢霉无抑制作用，对其余5种病原菌有不同程度的作用，说明拮抗菌株胞内存在抑菌活性物质；结合表2结果，3种拮抗菌对寄生隐丛赤壳菌、帚梗柱枝孢霉有抑菌活性的物质只存在于发酵液萃取物中，而菌丝体浸出物中存在对茶褐斑拟盘多毛孢、油橄榄环黑星霉有抑菌作用的物质。同样，乙酸乙酯浸出物的抑菌效果显著优于其余3种溶剂，其中对紫纹羽丝核菌产生的抑菌圈直径最大，显著大于其余病原菌（P<0.05）。在3种供试拮抗菌株中，MV2和MV4抑菌效果稍好于原始菌株KJ40，但差异不显著。综合以上结果，乙酸乙酯萃取所得到发酵液萃取物和菌丝体浸出物抑菌效果最强。 2.3KJ40及其突变株MV2和MV4抑菌物质的稳定性
MV2、MV4和KJ40活性物质经不同温度处理30 min后，抑菌活性随温度升高而下降（图2a）。MV2和MV4的抑菌物质经40～80 ℃处理30 min，其抑菌活性下降不显著；100和121 ℃处理后，其抑菌活性虽显著低于对照和前3个温度处理，但抑菌圈直径仍在11 mm以上；KJ40中的抑菌物质经不同温度处理后，其抑菌活性降幅显著，121 ℃处理仅有5.5 mm抑菌圈，说明突变株所产生的活性物质比原始菌株的热稳定性更强。
酸碱稳定性结果（图2b）表明，随pH提高，3个拮抗菌株的抑菌活性增强，当pH为7时，抑菌活性达到最大，抑菌圈与对照差异不显著；但随pH继续增大，活性显著下降。对比突变株和原始菌株，可以看出不管pH高低，MV2、MV4的活性物质对病原菌产生的抑菌圈仍较大，均大于10 mm，说明突变株对酸碱的耐受性较强。
在紫外光下经不同时间照射后（图2c），随时间延长，KJ40及其突变株抑菌物质活性均降低。处理2 h，MV2和MV4的抑菌活性与未经照射的处理差异不显著，并且其降幅低于KJ40；处理24 h，KJ40活性物质的抑菌圈很小，说明其不耐紫外光照射，而MV2和MV4对紫外光有一定的耐受性。
KJ40及其突变株在不同温度中储藏30 d后（图2d），各处理的抑菌活性存在差异，-20 ℃和4 ℃储藏后3个菌株活性物质的抑菌活性变化不大，特别是2株突变株，其抑菌圈直径均大于14 mm。但20 ℃储藏后3个菌株的抑菌活性均有一定程度的降低，KJ40降幅最大；40和60 ℃储藏后，抑菌物质活性与-20 ℃和4 ℃比均显著下降。可见活性物质在4 ℃以下低温储藏更好。
在按不同比例与福美双混合后（图2e），从9∶1到5∶5之间，两株突变株抑菌物质活性差异不显著；当福美双含量继续增大，其活性降低。而KJ40抑菌物质加入福美双后其活性呈显著下降趋势，当与福美双的体积比达到1∶9时，其活性丧失，可见未经诱变的菌株对福美双耐受性较差。
综合来看， MV2抑菌物质的稳定性强于MV4，两者的活性物质比KJ40的活性物质更稳定。
2.4KJ40及其突变株MV2和MV4对杨树紫纹羽病的盆栽防效
KJ40、MV2、MV4单独施用及与福美双混合施用后，杨树紫纹羽病的发病率、病情指数和防治效果见表4。结果显示，单独接种抑菌物质，MV2和MV4的防效显著优于KJ40；MV2的防效略高于MV4，但差异不显著。与单独施用福美双相比，MV4的防效显著低于福美双，MV2的防效虽亦低于福美双，但差异不显著。抑菌物质和福美双混合施用均比单独施用效果更好，其中MV2和福美双混合施用杨树发病率显著降低，病情指数在10以下，防效最佳，超过80%。KJ40的抑菌物质无论单独施用还是和福美双混合施用，效果都不如MV2和MV4。以上结果说明，MV2和MV4产生的抑菌物质和福美双混用对杨树紫纹羽病有协同防治作用，且比KJ40更适宜在生产实践中用于病害的防治。
3讨论
由于传统农药以及新型生物农药的局限性，研究者更期望将具有抗药性的生物农药与化学农药相结合用于植物病害的防治，最大限度地发掘其生防潜力。本文以前期筛选到的具有抗药性、拮抗性稳定持久的桑氏链霉菌KJ40突变株MV2、MV4[20]为基础，研究其抑菌谱。平板对峙试验结果显示，2个突变株除对鞭毛菌亚门藻状菌纲的终极腐霉无抑制作用外，对其余7株分属于子囊菌亚门、半知菌亚门和担子菌亚门的林木病原真菌抑制作用较强。通过4种有机溶剂对KJ40及其突变株发酵液和菌丝体进行萃取，得到的发酵液萃取物和菌丝体浸出物活性物质抑菌谱较广，但仍对终极腐霉无作用，其中乙酸乙酯萃取的物质活性最强。汪鹰[25]报道灰藤黄链霉菌（Streptomyces griseoluteus）产生的多种吩嗪类活性代谢产物对终极腐霉有强烈抑制作用，与本试验结果不同，但链霉菌所产生的代谢产物多种多样，进一步的研究将集中在KJ40发酵产物中活性物质的分离纯化及结构鉴定，并对抑菌机理进行探索。结果中突变株和原始菌株及其活性物质均对杨树紫纹羽病病原菌紫纹羽丝核菌抑制作用最强，这可能与桑氏链霉菌本身就来自杨树根系有关。突变株MV2及其活性物质抑菌作用最强，可能与诱变前后菌株产生的抑菌物质种类有所不同使得抑菌效果不同有关。本文只选择几种代表性林木病原真菌，为将桑氏链霉菌发展成为广谱性生防菌，下一步试验应扩大测试病原菌范围。
在稳定性检测中，MV2和MV4产生的抑菌物质具有较好的热稳定性、较宽的pH作用范围，抗紫外线辐射能力也较强，而原始菌株各种稳定性均较差，因此，突变株的特性使其在生产实践中比原始菌株更能适应环境，具有更大的开发潜力。但在高温中储藏后抑菌物质的活性显著下降，结合隋勤等[2]的报道，可合理选择相应的稳定剂等助剂，对将实际投入应用的生防制剂剂型进行深加工，以增加其货架期和田间防治效果。另外， MV2、MV4和KJ40对福美双的耐受性也表明，突变株抑菌混合物在与福美双不同配比下其活性仍较强，而原始菌株抑菌活性则显著降低甚至丧失。
虽然笔者曾将桑氏链霉菌发酵液直接用于杨树紫纹羽病的防治[17]，但由于链霉菌在自然条件下定殖及繁殖能力还不够稳定[26]，如果直接和农药混用，将限制生防菌的存活率和向侵染部位的转运效率[27]。本试验尝试将桑氏链霉菌突变株产生的抑菌物质用于病害的防治，获得了很大突破，作用方式更直接，生物活性成分更高，这与张晓云[28]将枯草芽胞杆菌抗菌蛋白应用于黄瓜白粉病中的结果一致。盆栽试验还表明，福美双 MV2活性物质混合施用防效最好，显著高于两者单独施用，MV2、MV4的抑菌物质对病原菌的抑制作用较KJ40有所提高；能让紫纹羽丝核菌无法扩展生长，达到杀灭紫纹羽丝核菌的效果。这一结果有效降低放线菌抗菌物质对化学药剂的敏感性，增加其生防潜能，使生防菌剂与杀菌剂协同效应在综合防治体系中的应用成为可能。但本试验中用的是无菌土，田间试验的环境比盆栽试验更为复杂，生防菌会受到温度、湿度、土壤pH等的影响，田间试验的结果可能会与盆栽试验不一致[29]。MV2、MV4及其活性物质能否在田间土壤中定殖、在田间试验中是否具有防治作用还需进一步探究。 参考文献
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（责任编辑：杨明丽）