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摘要[目的]研究4种市售酱油的挥发性成分。[方法]将顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）和气相色谱/质谱联用（gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS）技术结合，分析与比较了4种常见市售酱油的挥发性成分，并对固相微萃取条件进行了优化。[结果]确定HS-SPME较佳的试验条件：65 μm PDMS/DVB萃取头，萃取温度为60 ℃，萃取时间为40 min，解析时间为3 min，样品量为75 mL。在此条件下，在海天特级金标生抽、鲁花自然鲜酱香酱油、李锦记精选生抽和欣和六月鲜特级酱油中分别检测出34、30、33、31种化合物，主要为醇类、酯类和酚类等物质。[结论]不同酱油所含的挥发性成分的种类及含量均存在着明显的差异。该方法为科学评价和鉴别酱油的内在质量提供理论依据。
关键词酱油;挥发性成分;气相色谱-质谱联用;顶空固相微萃取
中图分类号TS261.2+1文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）28-0172-04
Study of the Volatile Components of Four Kinds of Marketed Soy Sauce
JI Xiaoyue（Advanced Analysis and Testing Center of Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037）
Abstract[Objective] The research aimed to study the volatile constituents of four kinds of marketed soy sauces.[Method]The volatile components of four kinds of marketed soy sauce were analyzed and compared by the headspace solid-phase microextraction （HS-SPME） coupled with gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS），and the conditions of solid phase microextraction were optimized.[Result]The optimum experimental conditions of HS-SPME were determined as follows： the 65 μm PDMS/DVB fiber was used，the extraction temperature was 60 ℃，the extraction time was 40 min，the desorption time was 3 min，and the sample amount was 75 mL.Under these conditions，34，30，33 and 31 compounds were detected in the Haitian premium golden label superior light soy sauce，Luhua soy sauce aroma style，Lee Kum Kee selected soy sauce and June fresh premium soy sauce，which were mainly alcohols，esters and phenols.[Conclusion]There are significant differences in the types and contents of volatile components contained in different soy sauces.This method provides a theoretical basis for the scientific evaluation and identification of the intrinsic quality of soy sauce.
Key wordsSoy sauce;Volatile components;Gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS）;Headspace solid-phase microextraction（HS-SPME）
醬油是一种具有独特酱香的古老调味品，它是由蛋白质、碳水化合物和食盐等组成的红褐色水溶液[1-2]。酱油鲜香美味，能够促进食欲，且价格低廉[3-4]，深受我国消费者的欢迎。由于酿造各种酱油的原料、条件以及发酵微生物种类等不同，不同酱油具有不同的香气特点[5]。酱油中香气的差异性是衡量其品质的重要指标之一。但是酱油中的香气成分种类多样，不稳定，大部分含量较低，因此有必要发展高效、快速、高选择性的方法，用以分离分析酱油中挥发性成分。
固相微萃取（SPME）作为一种新颖的萃取技术，具有萃取时间短、所需样品量少、无需溶剂、能耗低等特点[6-8]，与气相色谱（gas chromatography，GC）或气相色谱/质谱联用（gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS）被广泛地用于提取、分析挥发性及半挥发性样品，在食品香气的研究中被广泛应用[9-11]。笔者以4种常见市售酱油为研究对象，将
顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）
与GC/MS联合，对样品中的挥发性成分进行了系统的分析与比较，为获得更好的测试结果，对HS-SPME条件进行了优化，以期为科学评价和鉴别酱油的内在质量提供理论依据。 1材料与方法
1.1材料与试剂
4种酱油样品，市售;其中，海天特级金标生抽，佛山市海天调味品食品股份有限公司;鲁花自然鲜酱香酱油，山东鲁花生物科技有限公司;李锦记精选生抽，李锦记（新会）食品有限公司;欣和六月鲜特级酱油，烟台欣和企业食品有限公司。样品编号依次为HT、LH、LJJ、XH。
1.2仪器与设备
仪器型号：TRACE ISQ （美国Thermo Fisher Scientific公司）; SPME 手动进样器、65 μm PDMS/DVB萃取头、100 μm PDMS萃取头、75 μm Car/PDMS萃取头、85 μm PA萃取头（美国Supelco公司）;HHS电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。
1.3试验方法
1.3.1色谱条件。
DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;高纯氦气（99.999%）为载气，进样口温度为250 ℃，采用恒流模式，流速为1 mL/min。升温程序：起始温度35 ℃，保持3 min，而后以5 ℃/min升至150 ℃，再以15 ℃/min升至250 ℃，保留3 min。进样模式为不分流进样。
1.3.2质谱条件。电离方式：电子电离源（electron ionization，EI），傳输线温度为250 ℃，离子源温度250 ℃，电子能量70 eV，全扫描模式，扫描质量范围为33～450 amu，溶剂延迟时间为1 min。操作系统为Xcalibur软件。
1.3.3数据分析。
根据质谱数据和GC-MS联用仪标准图谱数据库（NIST14）检索结果鉴定挥发性成分化学组分;各个不同挥发性化学组分的相对百分含量采用峰面积归一化法计算。
1.3.4HS-SPME萃取过程。
取75 mL 的样品于250 mL的样品瓶中，用封口膜封口后，向瓶中插入萃取头（新萃取头在使用前需根据使用说明在GC进样口进行老化），顶空吸附一定的时间后拔出，随即插入进样口温度为250 ℃的GC/MS仪，解吸时间为3 min，进行GC/MS分析。
1.3.5SPME萃取条件的优化。
为使SPME方法高效、快速、高选择地从各品牌酱油中萃取富集挥发性成分，并得到灵敏、正确的分析结果，以海天特级金标生抽为参考，对萃取头、萃取温度、萃取时间进行优化，以酱油的挥发性成分的峰面积、峰数2个评价指标综合分析，确定较佳的萃取条件。
1.3.5.1萃取头的选择。SPME萃取装置的核心是萃取头，它直接影响方法的灵敏度、选择性和分析时间[12]。为了得到较佳的萃取条件，比较了4种不同极性和厚度的萃取头（100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB、75 μm Car/PDMS）对酱油挥发性成分的萃取效果。样品量75 mL，萃取温度为20 ℃，萃取时间为40 min，解吸时间为3 min，结果如图1所示。结果表明萃取头的涂层材料对萃取的效率具有显著的影响。从萃取的挥发性成分的总数来看，100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB和75 μm Car/PDMS分别吸附了7、18、23和7个组分，所以选择65 μm PDMS/DVB萃取头萃取样品的挥发性成分。
1.3.5.2萃取温度的选择。萃取温度对萃取结果具有双重影响，一方面，当温度升高时有利于提高分析物的扩散速率，从而增加萃取速率;另一方面，当温度升高时会降低萃取头的灵敏度，所以有必要对萃取温度进行优化。该试验选取20、40、50、60、70 ℃进行萃取。65 μm PDMS/DVB萃取头，样品量75 mL，萃取时间为40 min，解吸时间为3 min，结果如图2所示。由图2可见，随着萃取温度增加，有效峰个数逐渐增加，当萃取温度达到60 ℃时峰数达到最大，当温度进一步增加时，有效峰个数略微降低。因此，选择60 ℃作为该试验的萃取温度。
1.3.5.3
萃取时间的选择。萃取时间是指开始萃取至达到平衡所需的时间，SPME方法是基于分配平衡，分析物在涂层上的最大萃取量是在平衡时间达到[13]。在该试验中，采用65 μm PDMS/DVB萃取头分别探究了20、30、40、50 min各时间点的萃取效果。样品量75 mL，萃取温度为60 ℃，解析时间为3 min，结果如图3所示。由图3可见，随着萃取时间的增加，有效峰个数增加，当40 min时，达到萃取平衡。所以40 min为最佳的萃取时间。
2结果与分析
采用HS-SPME技术萃取4种市售酱油的挥发性有机化合物，并应用GC/MS对其进行分离分析，总离子流图如图4所示，其分析结果如表1所示。酱油的挥发性成分主要由醇、酯、酸、醛、酮、酚和杂环类化合物构成，它们协同作用形成了各种酱油特有的香气。从4种市售酱油挥发性成分中共鉴定出56种化学成分，其中共有相同成分14种。在共有香气成分中，乙醇、异戊醇、乙酸-5-乙基-2-甲基-3（2氢）-呋喃酮-4-醇酯、丁二酸二乙酯、4-乙基-2-甲氧基苯酚等的相对含量较高。
HS-SPME-GC/MS检测到海天特级金标生抽含有34种挥发性成分，包括6种醇类物质（53.34%）、9种酯类物质（23.78%）、3种酸类物质（10.21%）、4种醛类物质（3.11%）、3种酮类物质（2.60%）、2种烷烃（2.40%）、3种酚类化合物（1.56%）、2种杂环类化合物（0.72%）、2种其他类化合物（1.93%）;其中，乙醇（25.82%）、苯乙醇（21.01%）相对含量较高。通过HS-SPME-GC-MS检测到鲁花自然鲜酱香酱油30种挥发性成分，包括7种醇类物质（63.88%）、8种酯类物质（9.09%）、2种酸类物质（3.17%）、3种醛类物质（3.73%）、3种酮类物质（3.33%）、1种烷烃（0.38%）、2种酚类化合物（9.94%）、4种杂环类化合物（1.85%）;其中，乙醇（36.54%）、苯乙醇（19.86%）、4-乙基-2-甲氧基苯酚（9.05%）相对含量较高。通过HS-SPME-GC-MS检测到欣和六月鲜特级酱油 31种挥发性成分，包括5种醇类物质（46.97%）、11种酯类物质（10.24%）、1种酸类物质（0.15%）、4种醛类物质（3.57%）、 3种酮类物质（2.35%）、1种烷烃（1.06%）、4种酚类化合物（34.55%）、1种杂环类化合物（0.35%）、1种其他类化合物（0.67%）;其中，乙醇（32.27%）、苯乙醇（11.50%）、4-乙基-2-甲氧基苯酚（32.60%）相对含量较高。通过HS-SPME-GC-MS检测到李锦记精选生抽33种挥发性成分，包括5种醇类物质（49.74%）、8种酯类物质（9.82%）、4种酸类物质（19.45%）、5种醛类物质（2.54%）、 3种酮类物质（2.28%）、1种烷烃（0.80%）、6种酚类化合物（14.61%）、1种杂环类化合物（0.34%）。其中，乙醇（23.77%）、苯乙醇（20.22%）、山梨酸（18.82%）相对含量较高。 酱油挥发性成分受到酿造原料、生产工艺、参与发酵的微生物以及环境条件等的影响，构成了它们不同的特点[2]。由表1可知，在4种酱油样品中所检测到的挥发性物质中，酯类种类最多。酯类化合物通常具有特殊的香气[14-15]，如4种酱油样品都含有的2-甲基戊酸乙酯有苹果样的香气特征，并伴有青香香气;苯乙酸乙酯有浓烈而甜的蜂蜜香气，常用于配制各种花香型日用香精。
乙醇、异戊醇、苯乙醇在4种酱油样品中的相对含量都较高，其中具有苹果白兰地香气和辛辣味的异戊醇主要用以
配制苹果和香蕉型香精;而具有玫瑰花香气的苯乙醇应用在玫瑰花、苹果等香型香精中。酚类和杂环类化合物也是酱油样品香气的重要组成部分。在李锦记精选生抽中，酚类化合物的种类多于其他3种酱油样品，而在鲁花自然鲜酱香酱油的香气成分中杂环化合物的种类多于其他3种样品。具有草药似香气的4-乙基-2-甲氧基苯酚是4种酱油样品香气成分中的共有成分，但在欣和六月鲜特级酱油中相对含量明显高于其他3种酱油样品。
3结论
該研究优化了HS-SPME试验条件，并与GC/MS结合，建立了酱油挥发性成分的分析方法。结果表明，4种酱油样品中所含挥发性成分种类和含量之间存在明显的差异，挥发性成分主要由醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、酚类和杂环类化合物构成，形成了各种酱油特有的香气特征与质量上的不同。
参考文献
[1]
黄持都，鲁绯，纪凤娣，等.酱油研究进展[J].中国酿造，2009，28（10）：7-9.
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关键词酱油;挥发性成分;气相色谱-质谱联用;顶空固相微萃取
中图分类号TS261.2+1文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）28-0172-04
Study of the Volatile Components of Four Kinds of Marketed Soy Sauce
JI Xiaoyue（Advanced Analysis and Testing Center of Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037）
Abstract[Objective] The research aimed to study the volatile constituents of four kinds of marketed soy sauces.[Method]The volatile components of four kinds of marketed soy sauce were analyzed and compared by the headspace solid-phase microextraction （HS-SPME） coupled with gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS），and the conditions of solid phase microextraction were optimized.[Result]The optimum experimental conditions of HS-SPME were determined as follows： the 65 μm PDMS/DVB fiber was used，the extraction temperature was 60 ℃，the extraction time was 40 min，the desorption time was 3 min，and the sample amount was 75 mL.Under these conditions，34，30，33 and 31 compounds were detected in the Haitian premium golden label superior light soy sauce，Luhua soy sauce aroma style，Lee Kum Kee selected soy sauce and June fresh premium soy sauce，which were mainly alcohols，esters and phenols.[Conclusion]There are significant differences in the types and contents of volatile components contained in different soy sauces.This method provides a theoretical basis for the scientific evaluation and identification of the intrinsic quality of soy sauce.
Key wordsSoy sauce;Volatile components;Gas chromatography/mass spectrometry （GC/MS）;Headspace solid-phase microextraction（HS-SPME）
醬油是一种具有独特酱香的古老调味品，它是由蛋白质、碳水化合物和食盐等组成的红褐色水溶液[1-2]。酱油鲜香美味，能够促进食欲，且价格低廉[3-4]，深受我国消费者的欢迎。由于酿造各种酱油的原料、条件以及发酵微生物种类等不同，不同酱油具有不同的香气特点[5]。酱油中香气的差异性是衡量其品质的重要指标之一。但是酱油中的香气成分种类多样，不稳定，大部分含量较低，因此有必要发展高效、快速、高选择性的方法，用以分离分析酱油中挥发性成分。
固相微萃取（SPME）作为一种新颖的萃取技术，具有萃取时间短、所需样品量少、无需溶剂、能耗低等特点[6-8]，与气相色谱（gas chromatography，GC）或气相色谱/质谱联用（gas chromatography/mass spectrometry，GC/MS）被广泛地用于提取、分析挥发性及半挥发性样品，在食品香气的研究中被广泛应用[9-11]。笔者以4种常见市售酱油为研究对象，将
顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）
与GC/MS联合，对样品中的挥发性成分进行了系统的分析与比较，为获得更好的测试结果，对HS-SPME条件进行了优化，以期为科学评价和鉴别酱油的内在质量提供理论依据。 1材料与方法
1.1材料与试剂
4种酱油样品，市售;其中，海天特级金标生抽，佛山市海天调味品食品股份有限公司;鲁花自然鲜酱香酱油，山东鲁花生物科技有限公司;李锦记精选生抽，李锦记（新会）食品有限公司;欣和六月鲜特级酱油，烟台欣和企业食品有限公司。样品编号依次为HT、LH、LJJ、XH。
1.2仪器与设备
仪器型号：TRACE ISQ （美国Thermo Fisher Scientific公司）; SPME 手动进样器、65 μm PDMS/DVB萃取头、100 μm PDMS萃取头、75 μm Car/PDMS萃取头、85 μm PA萃取头（美国Supelco公司）;HHS电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。
1.3试验方法
1.3.1色谱条件。
DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;高纯氦气（99.999%）为载气，进样口温度为250 ℃，采用恒流模式，流速为1 mL/min。升温程序：起始温度35 ℃，保持3 min，而后以5 ℃/min升至150 ℃，再以15 ℃/min升至250 ℃，保留3 min。进样模式为不分流进样。
1.3.2质谱条件。电离方式：电子电离源（electron ionization，EI），傳输线温度为250 ℃，离子源温度250 ℃，电子能量70 eV，全扫描模式，扫描质量范围为33～450 amu，溶剂延迟时间为1 min。操作系统为Xcalibur软件。
1.3.3数据分析。
根据质谱数据和GC-MS联用仪标准图谱数据库（NIST14）检索结果鉴定挥发性成分化学组分;各个不同挥发性化学组分的相对百分含量采用峰面积归一化法计算。
1.3.4HS-SPME萃取过程。
取75 mL 的样品于250 mL的样品瓶中，用封口膜封口后，向瓶中插入萃取头（新萃取头在使用前需根据使用说明在GC进样口进行老化），顶空吸附一定的时间后拔出，随即插入进样口温度为250 ℃的GC/MS仪，解吸时间为3 min，进行GC/MS分析。
1.3.5SPME萃取条件的优化。
为使SPME方法高效、快速、高选择地从各品牌酱油中萃取富集挥发性成分，并得到灵敏、正确的分析结果，以海天特级金标生抽为参考，对萃取头、萃取温度、萃取时间进行优化，以酱油的挥发性成分的峰面积、峰数2个评价指标综合分析，确定较佳的萃取条件。
1.3.5.1萃取头的选择。SPME萃取装置的核心是萃取头，它直接影响方法的灵敏度、选择性和分析时间[12]。为了得到较佳的萃取条件，比较了4种不同极性和厚度的萃取头（100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB、75 μm Car/PDMS）对酱油挥发性成分的萃取效果。样品量75 mL，萃取温度为20 ℃，萃取时间为40 min，解吸时间为3 min，结果如图1所示。结果表明萃取头的涂层材料对萃取的效率具有显著的影响。从萃取的挥发性成分的总数来看，100 μm PDMS、85 μm PA、65 μm PDMS/DVB和75 μm Car/PDMS分别吸附了7、18、23和7个组分，所以选择65 μm PDMS/DVB萃取头萃取样品的挥发性成分。
1.3.5.2萃取温度的选择。萃取温度对萃取结果具有双重影响，一方面，当温度升高时有利于提高分析物的扩散速率，从而增加萃取速率;另一方面，当温度升高时会降低萃取头的灵敏度，所以有必要对萃取温度进行优化。该试验选取20、40、50、60、70 ℃进行萃取。65 μm PDMS/DVB萃取头，样品量75 mL，萃取时间为40 min，解吸时间为3 min，结果如图2所示。由图2可见，随着萃取温度增加，有效峰个数逐渐增加，当萃取温度达到60 ℃时峰数达到最大，当温度进一步增加时，有效峰个数略微降低。因此，选择60 ℃作为该试验的萃取温度。
1.3.5.3
萃取时间的选择。萃取时间是指开始萃取至达到平衡所需的时间，SPME方法是基于分配平衡，分析物在涂层上的最大萃取量是在平衡时间达到[13]。在该试验中，采用65 μm PDMS/DVB萃取头分别探究了20、30、40、50 min各时间点的萃取效果。样品量75 mL，萃取温度为60 ℃，解析时间为3 min，结果如图3所示。由图3可见，随着萃取时间的增加，有效峰个数增加，当40 min时，达到萃取平衡。所以40 min为最佳的萃取时间。
2结果与分析
采用HS-SPME技术萃取4种市售酱油的挥发性有机化合物，并应用GC/MS对其进行分离分析，总离子流图如图4所示，其分析结果如表1所示。酱油的挥发性成分主要由醇、酯、酸、醛、酮、酚和杂环类化合物构成，它们协同作用形成了各种酱油特有的香气。从4种市售酱油挥发性成分中共鉴定出56种化学成分，其中共有相同成分14种。在共有香气成分中，乙醇、异戊醇、乙酸-5-乙基-2-甲基-3（2氢）-呋喃酮-4-醇酯、丁二酸二乙酯、4-乙基-2-甲氧基苯酚等的相对含量较高。
HS-SPME-GC/MS检测到海天特级金标生抽含有34种挥发性成分，包括6种醇类物质（53.34%）、9种酯类物质（23.78%）、3种酸类物质（10.21%）、4种醛类物质（3.11%）、3种酮类物质（2.60%）、2种烷烃（2.40%）、3种酚类化合物（1.56%）、2种杂环类化合物（0.72%）、2种其他类化合物（1.93%）;其中，乙醇（25.82%）、苯乙醇（21.01%）相对含量较高。通过HS-SPME-GC-MS检测到鲁花自然鲜酱香酱油30种挥发性成分，包括7种醇类物质（63.88%）、8种酯类物质（9.09%）、2种酸类物质（3.17%）、3种醛类物质（3.73%）、3种酮类物质（3.33%）、1种烷烃（0.38%）、2种酚类化合物（9.94%）、4种杂环类化合物（1.85%）;其中，乙醇（36.54%）、苯乙醇（19.86%）、4-乙基-2-甲氧基苯酚（9.05%）相对含量较高。通过HS-SPME-GC-MS检测到欣和六月鲜特级酱油 31种挥发性成分，包括5种醇类物质（46.97%）、11种酯类物质（10.24%）、1种酸类物质（0.15%）、4种醛类物质（3.57%）、 3种酮类物质（2.35%）、1种烷烃（1.06%）、4种酚类化合物（34.55%）、1种杂环类化合物（0.35%）、1种其他类化合物（0.67%）;其中，乙醇（32.27%）、苯乙醇（11.50%）、4-乙基-2-甲氧基苯酚（32.60%）相对含量较高。通过HS-SPME-GC-MS检测到李锦记精选生抽33种挥发性成分，包括5种醇类物质（49.74%）、8种酯类物质（9.82%）、4种酸类物质（19.45%）、5种醛类物质（2.54%）、 3种酮类物质（2.28%）、1种烷烃（0.80%）、6种酚类化合物（14.61%）、1种杂环类化合物（0.34%）。其中，乙醇（23.77%）、苯乙醇（20.22%）、山梨酸（18.82%）相对含量较高。 酱油挥发性成分受到酿造原料、生产工艺、参与发酵的微生物以及环境条件等的影响，构成了它们不同的特点[2]。由表1可知，在4种酱油样品中所检测到的挥发性物质中，酯类种类最多。酯类化合物通常具有特殊的香气[14-15]，如4种酱油样品都含有的2-甲基戊酸乙酯有苹果样的香气特征，并伴有青香香气;苯乙酸乙酯有浓烈而甜的蜂蜜香气，常用于配制各种花香型日用香精。
乙醇、异戊醇、苯乙醇在4种酱油样品中的相对含量都较高，其中具有苹果白兰地香气和辛辣味的异戊醇主要用以
配制苹果和香蕉型香精;而具有玫瑰花香气的苯乙醇应用在玫瑰花、苹果等香型香精中。酚类和杂环类化合物也是酱油样品香气的重要组成部分。在李锦记精选生抽中，酚类化合物的种类多于其他3种酱油样品，而在鲁花自然鲜酱香酱油的香气成分中杂环化合物的种类多于其他3种样品。具有草药似香气的4-乙基-2-甲氧基苯酚是4种酱油样品香气成分中的共有成分，但在欣和六月鲜特级酱油中相对含量明显高于其他3种酱油样品。
3结论
該研究优化了HS-SPME试验条件，并与GC/MS结合，建立了酱油挥发性成分的分析方法。结果表明，4种酱油样品中所含挥发性成分种类和含量之间存在明显的差异，挥发性成分主要由醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、酚类和杂环类化合物构成，形成了各种酱油特有的香气特征与质量上的不同。
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