论文部分内容阅读
摘要 [目的]将耐铝的黑麦（389和390）与不耐铝的四倍体小麦（5020）远源杂交获得耐铝的小黑麦（5020×389 和5020×390），比较铝胁迫下小黑麥及其异源亲本活性氧代谢。[方法]通过水培及Al 胁迫处理，检测不同处理时间小黑麦及其亲本的膜稳定性、活性氧含量及代谢。[结果]AlCl3 处理后5020、5020×389 和5020×390 的MDA含量与质膜透性显著增加，铝处理2和12 d，与无铝处理相比增幅为57.7%、11.1%、10.8% 和22.8%、17.4%、2.2%。Al促进5020、5020×389 和5020×390 活性氧含量的显著提高，铝处理2 d 时，H2O2 含量分别增加了63.2%、47.1%、37%，O2- 产生速率分别增加了63.2%、41.1%、37%，且在铝处理12 d时，只有5020活性氧显著增加。5020、5020×389和5020×390的SOD 活性在铝处理2 和12 d时分别增加了74.5%、63.2%、61.7% 和45.1%、31.4%、20.1%。Al处理12 d时，与对照相比5020除了CAT外APX、GPX、GR活性均减小显著减小了74.1%、69%、18%；5020×389和5020×390叶中APX、GPX、GR活性增加显著分别增加了3.56倍、9.54倍与2.96倍、1.22倍与2.4倍、5.74倍。5020、5020×389和5020×390的GSH含量和GSSH含量均在铝处理12 d显著增加分别增加了54.0%、118.2% 和25.3%、18.0% 和22.0%、12.3%。[结论]小黑麦5020×389 和5020×390 表现为耐铝，且耐铝性5020×390稍强于5020×389。同时，研究表明不同耐铝品种间叶中APX、GPX和GR活性差异是小黑麦及其异源亲本耐铝性差异显著的原因之一。APX与GPX可能是5020×390耐铝的主要作用酶，GR可能是5020×389耐铝的主要作用酶。
关键词 小黑； 远源杂交； 铝毒； 活性氧
中图分类号 S501文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）15-0039-05
Abstract [Objective]Aluminum-tolerant triticale （ 5020×389 and 5020×390） were obtained from the aluminum-resistant rye （ 389 and 390） and aluminum-deficient tetraploid wheat （ 5020 ），and to compare the triticale and its heterologous parents active oxygen metabolism under aluminum stress.[Method]The membrane stability，active oxygen content and metabolism of triticale and its parents in different treatment time were detected by hydroponics and Al stress treatment.[Result]The contents of MDA and plasma membrane permeability of 5020，5020×389 and 5020×390 were significantly increased after AlCl3 treatment.The contents of MDA and membrane permeability of Al treatments were significantly increased after treatment with AlCl3 for 2 and 12 d （ 57.7%，11.1%，10.8% and 22.8%，17.4%，2.2%），respectively.Al promoted the content of active oxygen in 5020，5020×389 and 5020×390，and the contents of H2O2 increased by 63.2%，47.1%，37% and 63.2%，41.1%，37%，respectively，and only 5020 reactive oxygen species increased significantly after 12 days of aluminum treatment.The activities of SOD at 5020，5020×389 and 5020×390 increased by 74.5%，63.2%，61.7% and 45.1%，31.4%，20.1% at 2 d and 12 d，respectively.After Al treatment for 12 days，the activities of APX，GPX，and GR in 5020 except CAT were significantly reduced by 74.1%，69%，and 18%，respectively，compared to the control.The activities of APX，GPX，and GR in 5020×389 and 5020×390 leaves were significantly reduced.The increase was significantly increased by 3.56 times，9.54 times and 2.96 times，1.22 times and 2.4 times and 5.74 times respectively.GSH content and GSSH content of 5020，5020×389 and 5020×390 increased significantly by 54.0%，118.2% and 25.3%，18.0% and 22.0%，12.3% respectively after 12 d of aluminum treatment.[Conclusion]Triticale 5020×389 and 5020×390 are resistant to aluminum，and the aluminum tolerance 5020×390 is slightly stronger than 5020×389.At the same time，the results showed that the differences of APX，GPX and GR activity among different aluminum tolerant cultivars were one of the reasons that the differences of aluminum tolerance between triticale and its heterologous parents were significant.APX and APX may be the main action enzymes of 5020×390 aluminum-resistant，and GR may be the main action enzyme of 5020×389 aluminum-resistant Key words Triticale；Wild hybridization；Aluminium toxicity；Reactive oxygen species
四倍体小麦（硬粒小麦AABB）品质好，但由于没有D染色体，表现为不耐铝毒[1]，黑麦（RR）有广谱抗性，但品质差，将黑麦耐铝基因导入到硬粒小麦，可以提高硬粒小麦耐铝性。早在20 世纪60 年代国外已经获得的有六倍体小黑麦Rosner 和57 等品种[2]。我国育种学家鲍文奎等也通过远缘杂交成功合成了八倍体小黒麦。由于兼备了小麦和黑麦双亲的优良特点，小黑麦具有良好的高产性、较强的抗逆性和广泛的适应性，小黑麦的成功繁育促进了小麦品种的进化和黑麦改良小麦育种的进程[3]。活性氧主要包括O2-、H2O2、·OH和1O2，在正常情况下植物细胞内SOD、GPX、CAT、GR、APX 等酶可以有效地清除细胞内的活性氧，维持细胞内活性氧代谢相对稳定。但如果活性氧过度积累，超过活性氧代谢的酶分解能力，将引发细胞膜酯化，破坏细胞膜系统，更严重的将会引起细胞的死亡[4]。铝是地壳中最丰富的元素，且许多植物物种对土壤中铝十分敏感，尤其是Al3+的形式的铝[5]，受到铝毒胁迫的植物表现出一种主要反应，即促进活性氧（ROS）的迅速产生，当植物受到铝胁迫时活性氧产生和清除无法平衡时，就会导致活性氧的积累，以及膜系统、DNA分子、蛋白质及其他细胞成分的严重损伤[6-7]。笔者前期成功以四倍体小麦5020为母本，以黑麦近等系389 和390 为父本，远源杂交获得小黑麦5020×389与5020×390。在此基础上，研究铝胁迫下小黑麦和异源亲本膜稳定性及活性氧代谢酶活性，从而提高硬粒小麦的耐铝性，并揭示其耐铝机理。
1 材料与方法
1.1 试验材料
四倍体小麦5020，近等系黑麦390（耐铝性强）和389（耐铝性弱）及其杂交种小黑麦5020×390 与5020×389。
1.2 试验材料的培养
种子用0.5%次氯酸钠消毒、蒸馏水清洗后置于4 ℃冰箱中催芽24 h，将露白发芽的种子进行沙培，植株大约10 cm时移栽到1/5 Hoagland营养液中，预培养7 d后进行处理，对照用1/5 Hoagland营养液继续培养，铝毒用含0.5 mmol/L AlCl3的1/5 Hoagland营养液培养，水培过程中每2 d更换1次营养液、每天08：00和18：00调节pH使之维持在4.5 以下，每小时定时通气10 min。处理开始后6 h、2 d和12 d取材料进行生理指标测定。
1.3 叶中和活性氧代谢途径相关的生理性指标测定
SOD 活性的测定参考 Gianopolotis和 Ries（1977）[8]， CAT 活性的测定参考 Rao等（1997）[9]的方法，丙二醛含量的测定参考 Dhindsa等（1981）[10]的方法，GR 和 APX 的活性测定参考李忠光等（2014）[11]的方法。H2O2 含量根据Yang 等[12]的方法测定。 GPX酶活性测定参考黄爱缨等[13]的方法。 GSH 和 GSSG 按照Aravind 等[14]的方法测定。
1.4 统计分析 采用SPSS Statistics 19 和Microsoft Excel 2010 软件进行单因素方差分析，对数据处理、分析及制图。
2 结果与分析
2.1 对小黑麦及其异源亲本叶质膜透性、MDA 的影响
铝胁迫后活性氧代谢平衡被打破，膜结构受破坏，透性增加，膜脂过氧化产物MDA大量积累。由图1可知，随着铝 胁迫时间的延长， MDA 含量表现为先增加后减小。且在铝处理2和12 d时增加显著，5020、5020×389、5020×390 叶中MDA含量分别比无铝处理增加了107.6%、93.9%、60.3% 和90.0%、68.0%、9.0%。5020 叶中MDA 含量显著高于5020×389 和5020×390。质膜透性的变化与MDA 含量的变化一致，且在铝处理2和12 d时5020、5020×389、5020×390叶中质膜透性分别比无铝处理增加了57.7%、11.1%、10.8% 和22.8%、17.4%、2.2%。三者在铝处理2 d時均显著增加。铝处理12 d时与无铝处理相比，5020和5020×389增加显著，5020×390增加不显著，表明铝处理增加小黑麦及其异源亲本叶中膜质的过氧化及质膜透性，5020×389和5020×390 具有耐铝性，且显著高于5020，而5020×390 的耐铝性强于5020×389。
2.2 对小黑麦及其异源亲本叶中活性氧的影响
植物受到铝胁迫时，会在植物细胞内大量产生和积累活性氧。铝处理使三者的O2- 产生速率均不同程度的增加，且变化趋势为先增加后减小，铝处理6 h时5020×389和5020×390的叶中O2-产生速率显著增加，5020增加不显著；铝处理2 d时三者的O2- 产生速率增加显著，5020、5020×389 和5020×390 叶中O2- 产生速率比无铝处理增加63.2%、41.1%、37%。且在铝处理12 d时只有5020增加显著。SOD酶可催化O2- 发生歧化反应，生成H2O2。铝处理后5020、5020×389和5020×390叶的H2O2含量变化趋势与O2- 产生速率趋于一致。铝处理2 d时三者叶中H2O2含量显著增加，5020、5020×389和5020×390增量为63.2%、47.1%、37%。与对照相比，铝处理12 d时仅5020 增加显著，表明铝处理促进了叶中活性氧的积累。
2.3 对小黑麦及其异源亲本叶中SOD的影响
SOD可以将植物细胞内超氧阴离子自由基歧化为氧分子和过氧化氢，其在维持细胞内O2- 产生和清除的动态平衡中起到重要作用。铝处理使三者叶中SOD的活性随着铝处理的时间的延长而增加。铝处理6 h时5020×389 和5020×390 叶的SOD 酶活性显著高于5020，由于铝处理初期5020×389和5020×390叶中的O2- 产生速率的增加。铝处理2 d时和12 d与无铝处理相比三者SOD 的酶活均显著增加，5020、5020×389和5020×390 的增量为74.5%、63.2%、61.7% 和45.1%、31.4%、20.1%。表明随着处理时间的延长，铝处理可以显著提高三者叶中SOD 的酶活。 2.4 对小黑麦及其异源亲本叶中APX、CAT、GPX和GR活性的影响
APX，CAT，GR 和GPX 均可清除H2O2。APX 主要存在植物叶绿体和细胞质中催化AsA 与H2O2反应的抗氧化酶。GR 是维持植物细胞内谷胱甘肽稳定的重要酶，催化GSSG 还原为GSH。GPX 以GSH 为底物，清除H2O2，生成GSSH。与对照相比，铝胁迫6 h后5020、5020×389 和5020×390 叶中APX活性显著增加，分别增加了51.6%、3.74倍、11.9倍；Al胁迫2 d时5020、5020×390 叶中APX活性分别显著减小了16%、19%，而5020×389叶中APX活性显著增加了87.7%；Al胁迫12 d时，5020叶中APX活性显著减小了75%，5020×389 和5020×390 叶中APX活性显著增加，分别增加了3.56倍、9.54倍。
与对照相比，铝胁迫2～12 d时，5020、5020×389 和5020×390 叶中CAT活性显著增加，分别增加了112.6%、24.5%、21.4%与51.9%、8.85%、3.96%。
5020、5020×389 和5020×390 叶中GR 酶随着胁迫时间的延长逐渐增大。与对照相比，Al处理6 h时5020叶中GR活性减小不显著，5020×389 和5020×390 叶中GR 酶显著增加了1.62、4.1倍；Al处理2 d时5020、5020×389 和5020×390 叶中GR 酶分别显著增加了10.1%、4.45倍、1.05倍；Al处理6 h时5020叶中GR活性显著减小了18.8%，5020×389 和5020×390 叶中GR 酶增加显著增加了2.96、1.22倍。
与对照相比，铝胁迫2 d后 5020、5020×389 和5020×390 叶中GPX活性分别显著减小了67.7%、58.0%、40.2%；铝胁迫12 d后5020叶中GPX活性显著减小了69.0%，5020×389 和5020×390叶中GPX活性分别显著增加了2.40、5.74倍。
2.5 对不同小黑麦及其异源亲本叶中GSH 和GSSG 含量的影响
GSH在清除活性氧的过程中给起到重要作用，可直接与活性氧反应将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中扮演重要角色。GSH可以和H2O2 反应生成GSSH 来清除H2O2。铝处理促进5020、5020×389 和5020×390 叶中GSH 和GSSH 含量的增加。5020、5020×389 和5020×390 的对照组叶中GSH 含量的变化为先减小后增加，5020×390 的铝胁迫组叶中GSH 含量的变化为先增加后减小，且GSSH含量的变化趋势为先减小后增加。5020、5020×389、5020×390的GSH和GSSH含量均在铝处理12 d时显著增加，增量分别为54.0%、118.2% 和25.3%、18.0% 和22.0%、12.3%。5020 叶中GSH 含量在铝处理12 d时达到最大，表明长时间的铝处理显著提高5020 叶中GSH 含量，增加其清除H2O2 的能力。
3 讨论
植物受到Al胁迫后活性氧代谢平衡被打破，膜结构受破坏，透性增加，膜脂过氧化产物MDA大量积累。铝胁迫促进5020、5020×389 与5020×390 的质膜透性、显著增加MDA 含量，且在铝处理2 和12 d时5020×389与5020×390的质膜透性和MDA含量的增加量显著低于5020，表明5020×389与5020×390表现为耐铝性。5020×390 叶中质膜透性和MDA含量的增加量最小，说明5020×390强于5020×389。耐铝性的黑麦和不耐铝的四倍体小麦杂交可显著调高四倍体小麦的抗性。
铝胁迫使植物体活性氧大量积累。活性氧包括超氧自由基、过氧化氢、羟自由基和单线态氧等。铝胁迫促进5020、5020×389 与5020×390 中O2- 产生速率，显著增加H2O2 的含量。何虎翼等[15]研究发现铝胁迫根中产生O2- 可能被SOD 催化转变为H2O2，再转运到叶片作为信号因子，诱导整体植株的抗性，这可能与铝胁迫6 h 时5020×389与5020×390叶中H2O2含量增加有关。SOD 酶作为抗氧化系统的第一道防线可以将O2- 转化为H2O2，显著增加O2-产生速率，促进SOD 酶活性增加，进而促进H2O2 含量的增加，H2O2 的含量的变化均呈先增加后减小的趋势。O2- 产生速率和H2O2含量的减小可能与SOD、CAT、APX 等的抗氧化酶协作有关。
作为清除O2-的重要酶，SOD在活性氧代谢中起到重要作用。铝胁迫促进5020、5020×389 与5020×390 叶中SOD 酶活显著增加，尤其在铝处理 2 d 时。韦冬萍等[16]研究发现200 μmol/L Al3+ 浓度可显著提高油菜葉中SOD 酶活性，与该试验结果一致。
CAT、APX、GR 和GPX 均可清除H2O2。在铝胁迫12 时5020的APX、GR 和GPX活性均显著减小，但5020×389、5020×390叶中APX、GR 和GPX活性显著增加，表明提高活性氧代谢酶活性是小黑麦耐铝毒毒害的主要形式。 5020×389、5020×390在铝胁迫叶中APX、GR 和GPX活性变化显示，APX与GPX可能是5020×390耐铝的主要作用酶，GR可能是5020×389耐铝的主要作用酶。5020在铝处理12 d时，APX活性显著减小，这可能由于铝毒抑制APX 活力，也可能与铝胁迫APX 酶蛋白降解有关[17]。在铝处理12 d 时，5020 的CAT酶活显著升高。有研究表明叶片中清除H2O2 主要依靠叶绿体类囊体膜上的上的APX和微体中的CAT[18]，在铝处理12 d时5020叶中APX 酶活减弱，通过增强其叶中CAT 的活力来增强清除叶中H2O2的能力。 GR 是维持细胞内GSH稳定的重要酶。Al胁迫促进了叶中GR和GSH含量的增加，在铝处理12 d时5020和5020×390的叶中GR 活性最大，同时其叶中GSH 含量也最大。5020、5020×389和5020×390的GSH含量与对照相比均显著增加，表明通过提高抗氧化剂的含量来提高小黑麦及其异源亲本耐铝毒毒害的能力。但是5020、5020×389和5020×390的GR 活性变化趋势和GSH含量并不一致，这可能由于GSH 并不是全由GR 这一条途径合成，GSH也可由γ-ECS 和GSHS 催化合成。
4 结论
小黑麦5020×389和5020×390 表現为具有耐铝性，且5020×390 耐铝性强于5020×389。不同耐铝品种间叶的APX、GPX和GR活性差异是小黑麦及其异源亲本耐铝性差异显著的原因之一。APX与GPX可能是5020×390耐铝的主要作用酶，而GR可能是5020×389耐铝的主要作用酶。
参考文献
[1] 曾道孝.硬粒小麦简介[J].农业科技通讯，1979（12）：6.
[2] WILSON A S.III.-On the fertilisation of the cereals[J].Trans Proc Bot Soc Edinburgh，1873，12（1/2/3/4）：84-95.
[3] 杨漫宇.小麦-黑麦1RS/1BL易位系及4RS/4DL新型易位系的鉴定及分子细胞遗传学研究[D].雅安：四川农业大学，2014：2-3.
[4] MITTLER R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J].Trends Plant Sci，2002，7（9）：405-410.
[5] CHEN L S，QI Y P，JIANG H X，et al.Photosynthesis and photoprotective systems of plants in response to aluminum toxicity[J].Afr J Biotechnol，2010，9：9237-9247.
[6] INZ D，MONTAGU M V.Oxidative stress in plants[J].Curr Opin Plant Biotech，1995，6（2）：153-158.
[7]DEL RIO L A.ROS and RNS in plant physiology：An overview[J].J Exp Bot，2015，66（10）：2827-2837.
[8]GIANNOPOLITIS C N，RIES S K.Superoxide dismutases：I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol，1997，59（2）：309-314.
[9] RAO M V，PALIYATH G，ORMROD D P，et al.Influence of salicylic acid on H2O2 production，oxidative stress，and H2O2-metabolizing enzymes[J].Plant Physiol，1997，115（1）：137-149.
[10] DHINDSA R S，PLUMB-DHINDSA P，THORPE T A.Leaf senescence：Correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation，and decreased levels of superoxide dismutase and catalase[J].J Exp Bot，198132：93-101.
[11] 李忠光，龚明.植物生理学综合性和设计性实验教程[M].武汉：华中科技大学出版社，2014：59-60.
[12] YANG Y J，CHENG L M，LIU Z H.Rapid effect of cadmium on lignin biosynthesis in soybean roots[J].Plant Sci，2007，172：632-639.
[13] 黄爱缨，吴珍龄.水稻谷胱甘肽过氧化物酶的测定法[J].西南农业大学学报，1999，21（4）：324-327.
[14] ARAVIND P，PRASAD M N V.Modulation of cadmium-induced oxidative stress in Ceratophyllum demersum by zinc involves ascorbate-glutathione cycle and glutathione metabolism[J].Plant physiology and biochemistry，2005，43（2）：107-116.
[15] 何虎翼，何龙飞，黎晓峰，等.铝胁迫对黑麦幼苗活性氧系统的影响[J].麦类作物学报，2005，25（6）：91-95.
[16] 韦冬萍，刘鹏，徐根娣，等.Al胁迫下油菜生物量Al积累及保护酶系统的响应[J].农业环境科学学报，2008，27（6）：2351-2356.
[17] 蒋明义，荆家海.植物体内羟自由基的产生及其与脂质过氧化作用启动的关系[J].植物生理学通讯，1993（4）：300-305.
[18] 冯晴，徐朗莱，叶茂炳，等.小麦叶片衰老过程中CAT和APX活力及其同工酶谱的变化[J].南京农业大学学报，1997，20（2）：95-99.
关键词 小黑； 远源杂交； 铝毒； 活性氧
中图分类号 S501文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）15-0039-05
Abstract [Objective]Aluminum-tolerant triticale （ 5020×389 and 5020×390） were obtained from the aluminum-resistant rye （ 389 and 390） and aluminum-deficient tetraploid wheat （ 5020 ），and to compare the triticale and its heterologous parents active oxygen metabolism under aluminum stress.[Method]The membrane stability，active oxygen content and metabolism of triticale and its parents in different treatment time were detected by hydroponics and Al stress treatment.[Result]The contents of MDA and plasma membrane permeability of 5020，5020×389 and 5020×390 were significantly increased after AlCl3 treatment.The contents of MDA and membrane permeability of Al treatments were significantly increased after treatment with AlCl3 for 2 and 12 d （ 57.7%，11.1%，10.8% and 22.8%，17.4%，2.2%），respectively.Al promoted the content of active oxygen in 5020，5020×389 and 5020×390，and the contents of H2O2 increased by 63.2%，47.1%，37% and 63.2%，41.1%，37%，respectively，and only 5020 reactive oxygen species increased significantly after 12 days of aluminum treatment.The activities of SOD at 5020，5020×389 and 5020×390 increased by 74.5%，63.2%，61.7% and 45.1%，31.4%，20.1% at 2 d and 12 d，respectively.After Al treatment for 12 days，the activities of APX，GPX，and GR in 5020 except CAT were significantly reduced by 74.1%，69%，and 18%，respectively，compared to the control.The activities of APX，GPX，and GR in 5020×389 and 5020×390 leaves were significantly reduced.The increase was significantly increased by 3.56 times，9.54 times and 2.96 times，1.22 times and 2.4 times and 5.74 times respectively.GSH content and GSSH content of 5020，5020×389 and 5020×390 increased significantly by 54.0%，118.2% and 25.3%，18.0% and 22.0%，12.3% respectively after 12 d of aluminum treatment.[Conclusion]Triticale 5020×389 and 5020×390 are resistant to aluminum，and the aluminum tolerance 5020×390 is slightly stronger than 5020×389.At the same time，the results showed that the differences of APX，GPX and GR activity among different aluminum tolerant cultivars were one of the reasons that the differences of aluminum tolerance between triticale and its heterologous parents were significant.APX and APX may be the main action enzymes of 5020×390 aluminum-resistant，and GR may be the main action enzyme of 5020×389 aluminum-resistant Key words Triticale；Wild hybridization；Aluminium toxicity；Reactive oxygen species
四倍体小麦（硬粒小麦AABB）品质好，但由于没有D染色体，表现为不耐铝毒[1]，黑麦（RR）有广谱抗性，但品质差，将黑麦耐铝基因导入到硬粒小麦，可以提高硬粒小麦耐铝性。早在20 世纪60 年代国外已经获得的有六倍体小黑麦Rosner 和57 等品种[2]。我国育种学家鲍文奎等也通过远缘杂交成功合成了八倍体小黒麦。由于兼备了小麦和黑麦双亲的优良特点，小黑麦具有良好的高产性、较强的抗逆性和广泛的适应性，小黑麦的成功繁育促进了小麦品种的进化和黑麦改良小麦育种的进程[3]。活性氧主要包括O2-、H2O2、·OH和1O2，在正常情况下植物细胞内SOD、GPX、CAT、GR、APX 等酶可以有效地清除细胞内的活性氧，维持细胞内活性氧代谢相对稳定。但如果活性氧过度积累，超过活性氧代谢的酶分解能力，将引发细胞膜酯化，破坏细胞膜系统，更严重的将会引起细胞的死亡[4]。铝是地壳中最丰富的元素，且许多植物物种对土壤中铝十分敏感，尤其是Al3+的形式的铝[5]，受到铝毒胁迫的植物表现出一种主要反应，即促进活性氧（ROS）的迅速产生，当植物受到铝胁迫时活性氧产生和清除无法平衡时，就会导致活性氧的积累，以及膜系统、DNA分子、蛋白质及其他细胞成分的严重损伤[6-7]。笔者前期成功以四倍体小麦5020为母本，以黑麦近等系389 和390 为父本，远源杂交获得小黑麦5020×389与5020×390。在此基础上，研究铝胁迫下小黑麦和异源亲本膜稳定性及活性氧代谢酶活性，从而提高硬粒小麦的耐铝性，并揭示其耐铝机理。
1 材料与方法
1.1 试验材料
四倍体小麦5020，近等系黑麦390（耐铝性强）和389（耐铝性弱）及其杂交种小黑麦5020×390 与5020×389。
1.2 试验材料的培养
种子用0.5%次氯酸钠消毒、蒸馏水清洗后置于4 ℃冰箱中催芽24 h，将露白发芽的种子进行沙培，植株大约10 cm时移栽到1/5 Hoagland营养液中，预培养7 d后进行处理，对照用1/5 Hoagland营养液继续培养，铝毒用含0.5 mmol/L AlCl3的1/5 Hoagland营养液培养，水培过程中每2 d更换1次营养液、每天08：00和18：00调节pH使之维持在4.5 以下，每小时定时通气10 min。处理开始后6 h、2 d和12 d取材料进行生理指标测定。
1.3 叶中和活性氧代谢途径相关的生理性指标测定
SOD 活性的测定参考 Gianopolotis和 Ries（1977）[8]， CAT 活性的测定参考 Rao等（1997）[9]的方法，丙二醛含量的测定参考 Dhindsa等（1981）[10]的方法，GR 和 APX 的活性测定参考李忠光等（2014）[11]的方法。H2O2 含量根据Yang 等[12]的方法测定。 GPX酶活性测定参考黄爱缨等[13]的方法。 GSH 和 GSSG 按照Aravind 等[14]的方法测定。
1.4 统计分析 采用SPSS Statistics 19 和Microsoft Excel 2010 软件进行单因素方差分析，对数据处理、分析及制图。
2 结果与分析
2.1 对小黑麦及其异源亲本叶质膜透性、MDA 的影响
铝胁迫后活性氧代谢平衡被打破，膜结构受破坏，透性增加，膜脂过氧化产物MDA大量积累。由图1可知，随着铝 胁迫时间的延长， MDA 含量表现为先增加后减小。且在铝处理2和12 d时增加显著，5020、5020×389、5020×390 叶中MDA含量分别比无铝处理增加了107.6%、93.9%、60.3% 和90.0%、68.0%、9.0%。5020 叶中MDA 含量显著高于5020×389 和5020×390。质膜透性的变化与MDA 含量的变化一致，且在铝处理2和12 d时5020、5020×389、5020×390叶中质膜透性分别比无铝处理增加了57.7%、11.1%、10.8% 和22.8%、17.4%、2.2%。三者在铝处理2 d時均显著增加。铝处理12 d时与无铝处理相比，5020和5020×389增加显著，5020×390增加不显著，表明铝处理增加小黑麦及其异源亲本叶中膜质的过氧化及质膜透性，5020×389和5020×390 具有耐铝性，且显著高于5020，而5020×390 的耐铝性强于5020×389。
2.2 对小黑麦及其异源亲本叶中活性氧的影响
植物受到铝胁迫时，会在植物细胞内大量产生和积累活性氧。铝处理使三者的O2- 产生速率均不同程度的增加，且变化趋势为先增加后减小，铝处理6 h时5020×389和5020×390的叶中O2-产生速率显著增加，5020增加不显著；铝处理2 d时三者的O2- 产生速率增加显著，5020、5020×389 和5020×390 叶中O2- 产生速率比无铝处理增加63.2%、41.1%、37%。且在铝处理12 d时只有5020增加显著。SOD酶可催化O2- 发生歧化反应，生成H2O2。铝处理后5020、5020×389和5020×390叶的H2O2含量变化趋势与O2- 产生速率趋于一致。铝处理2 d时三者叶中H2O2含量显著增加，5020、5020×389和5020×390增量为63.2%、47.1%、37%。与对照相比，铝处理12 d时仅5020 增加显著，表明铝处理促进了叶中活性氧的积累。
2.3 对小黑麦及其异源亲本叶中SOD的影响
SOD可以将植物细胞内超氧阴离子自由基歧化为氧分子和过氧化氢，其在维持细胞内O2- 产生和清除的动态平衡中起到重要作用。铝处理使三者叶中SOD的活性随着铝处理的时间的延长而增加。铝处理6 h时5020×389 和5020×390 叶的SOD 酶活性显著高于5020，由于铝处理初期5020×389和5020×390叶中的O2- 产生速率的增加。铝处理2 d时和12 d与无铝处理相比三者SOD 的酶活均显著增加，5020、5020×389和5020×390 的增量为74.5%、63.2%、61.7% 和45.1%、31.4%、20.1%。表明随着处理时间的延长，铝处理可以显著提高三者叶中SOD 的酶活。 2.4 对小黑麦及其异源亲本叶中APX、CAT、GPX和GR活性的影响
APX，CAT，GR 和GPX 均可清除H2O2。APX 主要存在植物叶绿体和细胞质中催化AsA 与H2O2反应的抗氧化酶。GR 是维持植物细胞内谷胱甘肽稳定的重要酶，催化GSSG 还原为GSH。GPX 以GSH 为底物，清除H2O2，生成GSSH。与对照相比，铝胁迫6 h后5020、5020×389 和5020×390 叶中APX活性显著增加，分别增加了51.6%、3.74倍、11.9倍；Al胁迫2 d时5020、5020×390 叶中APX活性分别显著减小了16%、19%，而5020×389叶中APX活性显著增加了87.7%；Al胁迫12 d时，5020叶中APX活性显著减小了75%，5020×389 和5020×390 叶中APX活性显著增加，分别增加了3.56倍、9.54倍。
与对照相比，铝胁迫2～12 d时，5020、5020×389 和5020×390 叶中CAT活性显著增加，分别增加了112.6%、24.5%、21.4%与51.9%、8.85%、3.96%。
5020、5020×389 和5020×390 叶中GR 酶随着胁迫时间的延长逐渐增大。与对照相比，Al处理6 h时5020叶中GR活性减小不显著，5020×389 和5020×390 叶中GR 酶显著增加了1.62、4.1倍；Al处理2 d时5020、5020×389 和5020×390 叶中GR 酶分别显著增加了10.1%、4.45倍、1.05倍；Al处理6 h时5020叶中GR活性显著减小了18.8%，5020×389 和5020×390 叶中GR 酶增加显著增加了2.96、1.22倍。
与对照相比，铝胁迫2 d后 5020、5020×389 和5020×390 叶中GPX活性分别显著减小了67.7%、58.0%、40.2%；铝胁迫12 d后5020叶中GPX活性显著减小了69.0%，5020×389 和5020×390叶中GPX活性分别显著增加了2.40、5.74倍。
2.5 对不同小黑麦及其异源亲本叶中GSH 和GSSG 含量的影响
GSH在清除活性氧的过程中给起到重要作用，可直接与活性氧反应将其还原，又可作为酶的底物在活性氧的清除过程中扮演重要角色。GSH可以和H2O2 反应生成GSSH 来清除H2O2。铝处理促进5020、5020×389 和5020×390 叶中GSH 和GSSH 含量的增加。5020、5020×389 和5020×390 的对照组叶中GSH 含量的变化为先减小后增加，5020×390 的铝胁迫组叶中GSH 含量的变化为先增加后减小，且GSSH含量的变化趋势为先减小后增加。5020、5020×389、5020×390的GSH和GSSH含量均在铝处理12 d时显著增加，增量分别为54.0%、118.2% 和25.3%、18.0% 和22.0%、12.3%。5020 叶中GSH 含量在铝处理12 d时达到最大，表明长时间的铝处理显著提高5020 叶中GSH 含量，增加其清除H2O2 的能力。
3 讨论
植物受到Al胁迫后活性氧代谢平衡被打破，膜结构受破坏，透性增加，膜脂过氧化产物MDA大量积累。铝胁迫促进5020、5020×389 与5020×390 的质膜透性、显著增加MDA 含量，且在铝处理2 和12 d时5020×389与5020×390的质膜透性和MDA含量的增加量显著低于5020，表明5020×389与5020×390表现为耐铝性。5020×390 叶中质膜透性和MDA含量的增加量最小，说明5020×390强于5020×389。耐铝性的黑麦和不耐铝的四倍体小麦杂交可显著调高四倍体小麦的抗性。
铝胁迫使植物体活性氧大量积累。活性氧包括超氧自由基、过氧化氢、羟自由基和单线态氧等。铝胁迫促进5020、5020×389 与5020×390 中O2- 产生速率，显著增加H2O2 的含量。何虎翼等[15]研究发现铝胁迫根中产生O2- 可能被SOD 催化转变为H2O2，再转运到叶片作为信号因子，诱导整体植株的抗性，这可能与铝胁迫6 h 时5020×389与5020×390叶中H2O2含量增加有关。SOD 酶作为抗氧化系统的第一道防线可以将O2- 转化为H2O2，显著增加O2-产生速率，促进SOD 酶活性增加，进而促进H2O2 含量的增加，H2O2 的含量的变化均呈先增加后减小的趋势。O2- 产生速率和H2O2含量的减小可能与SOD、CAT、APX 等的抗氧化酶协作有关。
作为清除O2-的重要酶，SOD在活性氧代谢中起到重要作用。铝胁迫促进5020、5020×389 与5020×390 叶中SOD 酶活显著增加，尤其在铝处理 2 d 时。韦冬萍等[16]研究发现200 μmol/L Al3+ 浓度可显著提高油菜葉中SOD 酶活性，与该试验结果一致。
CAT、APX、GR 和GPX 均可清除H2O2。在铝胁迫12 时5020的APX、GR 和GPX活性均显著减小，但5020×389、5020×390叶中APX、GR 和GPX活性显著增加，表明提高活性氧代谢酶活性是小黑麦耐铝毒毒害的主要形式。 5020×389、5020×390在铝胁迫叶中APX、GR 和GPX活性变化显示，APX与GPX可能是5020×390耐铝的主要作用酶，GR可能是5020×389耐铝的主要作用酶。5020在铝处理12 d时，APX活性显著减小，这可能由于铝毒抑制APX 活力，也可能与铝胁迫APX 酶蛋白降解有关[17]。在铝处理12 d 时，5020 的CAT酶活显著升高。有研究表明叶片中清除H2O2 主要依靠叶绿体类囊体膜上的上的APX和微体中的CAT[18]，在铝处理12 d时5020叶中APX 酶活减弱，通过增强其叶中CAT 的活力来增强清除叶中H2O2的能力。 GR 是维持细胞内GSH稳定的重要酶。Al胁迫促进了叶中GR和GSH含量的增加，在铝处理12 d时5020和5020×390的叶中GR 活性最大，同时其叶中GSH 含量也最大。5020、5020×389和5020×390的GSH含量与对照相比均显著增加，表明通过提高抗氧化剂的含量来提高小黑麦及其异源亲本耐铝毒毒害的能力。但是5020、5020×389和5020×390的GR 活性变化趋势和GSH含量并不一致，这可能由于GSH 并不是全由GR 这一条途径合成，GSH也可由γ-ECS 和GSHS 催化合成。
4 结论
小黑麦5020×389和5020×390 表現为具有耐铝性，且5020×390 耐铝性强于5020×389。不同耐铝品种间叶的APX、GPX和GR活性差异是小黑麦及其异源亲本耐铝性差异显著的原因之一。APX与GPX可能是5020×390耐铝的主要作用酶，而GR可能是5020×389耐铝的主要作用酶。
参考文献
[1] 曾道孝.硬粒小麦简介[J].农业科技通讯，1979（12）：6.
[2] WILSON A S.III.-On the fertilisation of the cereals[J].Trans Proc Bot Soc Edinburgh，1873，12（1/2/3/4）：84-95.
[3] 杨漫宇.小麦-黑麦1RS/1BL易位系及4RS/4DL新型易位系的鉴定及分子细胞遗传学研究[D].雅安：四川农业大学，2014：2-3.
[4] MITTLER R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J].Trends Plant Sci，2002，7（9）：405-410.
[5] CHEN L S，QI Y P，JIANG H X，et al.Photosynthesis and photoprotective systems of plants in response to aluminum toxicity[J].Afr J Biotechnol，2010，9：9237-9247.
[6] INZ D，MONTAGU M V.Oxidative stress in plants[J].Curr Opin Plant Biotech，1995，6（2）：153-158.
[7]DEL RIO L A.ROS and RNS in plant physiology：An overview[J].J Exp Bot，2015，66（10）：2827-2837.
[8]GIANNOPOLITIS C N，RIES S K.Superoxide dismutases：I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol，1997，59（2）：309-314.
[9] RAO M V，PALIYATH G，ORMROD D P，et al.Influence of salicylic acid on H2O2 production，oxidative stress，and H2O2-metabolizing enzymes[J].Plant Physiol，1997，115（1）：137-149.
[10] DHINDSA R S，PLUMB-DHINDSA P，THORPE T A.Leaf senescence：Correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation，and decreased levels of superoxide dismutase and catalase[J].J Exp Bot，198132：93-101.
[11] 李忠光，龚明.植物生理学综合性和设计性实验教程[M].武汉：华中科技大学出版社，2014：59-60.
[12] YANG Y J，CHENG L M，LIU Z H.Rapid effect of cadmium on lignin biosynthesis in soybean roots[J].Plant Sci，2007，172：632-639.
[13] 黄爱缨，吴珍龄.水稻谷胱甘肽过氧化物酶的测定法[J].西南农业大学学报，1999，21（4）：324-327.
[14] ARAVIND P，PRASAD M N V.Modulation of cadmium-induced oxidative stress in Ceratophyllum demersum by zinc involves ascorbate-glutathione cycle and glutathione metabolism[J].Plant physiology and biochemistry，2005，43（2）：107-116.
[15] 何虎翼，何龙飞，黎晓峰，等.铝胁迫对黑麦幼苗活性氧系统的影响[J].麦类作物学报，2005，25（6）：91-95.
[16] 韦冬萍，刘鹏，徐根娣，等.Al胁迫下油菜生物量Al积累及保护酶系统的响应[J].农业环境科学学报，2008，27（6）：2351-2356.
[17] 蒋明义，荆家海.植物体内羟自由基的产生及其与脂质过氧化作用启动的关系[J].植物生理学通讯，1993（4）：300-305.
[18] 冯晴，徐朗莱，叶茂炳，等.小麦叶片衰老过程中CAT和APX活力及其同工酶谱的变化[J].南京农业大学学报，1997，20（2）：95-99.