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摘要：解淀粉芽孢杆菌B15是来源于酿酒葡萄表面的生防菌，通过研究该菌株发酵液对23种植物病原菌的抑制效果，并以水稻为试验对象进行安全性测试。结果表明，生防菌解淀粉芽孢杆菌B15的发酵稀释液（浓度为 10 CFU/mL）对23种植物病原菌的抑制率均在50%以上，对香菇烂筒病、苹果腐烂病、棉花炭疽病、花生褐斑病和黄瓜枯萎病5种病原真菌的抑制率在90%以上，计算可得EC50的范围为0.000～11.704 个/mL，表明解淀粉芽孢杆菌B15具有广谱抗菌性。通过室内田间安全测试试验，验证了该菌株对作物的安全性，从而为该菌株生物农药的开发与应用提供数据支持。
关键词：解淀粉芽孢杆菌;植物病原菌;抑制率;抗菌谱;安全性测试
中图分类号： TQ458;S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2021）05-0102-05
笔者所在实验室在前期的研究中，从酿酒葡萄表面筛选、鉴定发现1株具有明显抑制霉菌效果的解淀粉芽孢杆菌（Bacillm amyloliquefaciens），将其编号为B15，并对其抑菌活性成分和代谢机制进行研究。解淀粉芽孢杆菌为学界公认的植物病原真菌的生防细菌，能够产生脂肽类抑菌物质，并且分裂繁殖速度快、对营养条件要求简单，因而被广泛应用于植物疫病防治和果蔬保鲜中，是经美国食品和药物管理局（FDA）安全认证的菌种，也是国内农业农村部批准的生物农药使用菌种之一。据统计，以芽孢杆菌为基础的产品约占细菌生物防治剂产品的一半[7]。
目前，国内研究者分离、研究并进行初步应用的解淀粉芽孢杆菌菌株有YN-1（来源于郑州果园）[8]、TB-2（来源于茄科作物内生菌）、PEBA20（来源于杨树内生菌）、HN-06（来源于土壤）等，发现解淀粉芽孢杆菌能够抑制苹果炭疽病、苹果轮纹病、苹果腐烂病、芹菜菌核病、香蕉轴腐病、桃褐腐病、烟草黑胫病、辣椒疫霉、番茄灰霉等病原菌的生长，并且应用芽孢杆菌处理在防病稳定性与化学农药的相容性等方面具有明显优势[15]。
本研究分析来源于酿酒葡萄表面的解淀粉芽孢杆菌B15的抗菌谱和安全性，旨在为将该菌株作为生防菌开发生物农药提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
水稻品种为明恢86、武育粳3号、沈农265。
生防菌菌株解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）B15来源于酿酒葡萄表皮，贮藏于国家级酒类品质与安全国际联合研究中心。23种植物病原见表1，来源于中国农业科学院植物保护研究所农业部农药化学与应用技术重点开放实验室。
1.2 培养基
种子液活化培养基为营养肉汤（NB），病原菌活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。基础发酵培养基为改良Landy培养基，配方如下：30 g/L 葡萄糖，14 g/L谷氨酸钠，0.5 g/L MgSO4，05 g/L KCl，1.0 g/L KH2PO4，0.15 mg/L FeSO4，50 mg/L MnSO4，0.16 mg/L CuSO4，pH值为7.0。
1.3 菌株B15发酵液的制备
将保存于4 ℃的解淀粉芽孢杆菌B15接种到斜面上，于30 ℃培养48 h，再将其接种于NB培养基上， 于37 ℃、 120 r/min 振荡培养24 h后进行活化扩培，得到种子液。将种子液按4%的接种量接种于改良Landy培养基中，于30 ℃、180 r/min条件振荡培养50 h，得到发酵液，然后将发酵液于 8 000 r/min 離心15 min，取上清液。
1.4 抗菌谱的室内生测方法
1.4.1 植物病原菌的活化 用打孔器在实验室保存的23种植物病原菌平板上取1块菌板，置于PDA平板中央，放入培养箱中于25 ℃进行培养，待病原菌即将铺满平板时取出，用封口膜封好后放入4 ℃冰箱中备用。
1.4.2 发酵液的稀释 经测定，“1.3”节制备的发酵液的孢子数为1.9×108个/mL，按梯度稀释为7个浓度（分别为150.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.5个/mL）的稀释液试验组，分别取100 μL稀释液加入60 mL PDA培养基中，平均倒3个平板，以无菌水作为对照组（即不添加解淀粉芽孢杆菌B15菌液的PDA平板），备用。
1.4.3 菌丝生长速率的测定 参照NY/T 1156.2—2006《农药室内生物测定试验准则 杀菌剂 第2部分：抑制病原真菌菌丝生长试验 平皿法》，将培养好的病原菌在无菌操作条件下用直径为 7 mm 的灭菌打孔器自菌落边缘切取菌苔（约 6 mm），将菌丝面向下接种在上述平板中央，25 ℃恒温培养，待空白对照平板中的菌落充分生长后，用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算抑制率，计算公式如下：
菌落增长直径=菌落直径平均值-菌饼直径;（1）
菌丝生长抑制率=对照菌落增长直径-处理菌落增长直径对照菌落增长直径×100%。（2）
采用回归分析法对试验数据进行分析，以各处理浓度的对数值为横坐标、以菌丝生长抑制率换算成的概率值为纵坐标，求出回归方程和有效抑制浓度（EC50、EC90）。
1.5 安全性测试方法
测试试验在中国农业科学院植物保护研究所温室内进行，浇透水后均匀撒播种子，温室白天温度为28 ℃，夜间温度为25 ℃，培育1周后进行施药。
测定“1.3”节制备的发酵液孢子数，按梯度稀释为3个浓度（150、50、10个/mL）的稀释液试验组，以无菌水作为空白对照组，每个设浓度3个处理，每个处理设10株。采用Spraying System公司生产的气力喷头Air Atom喷雾，喷雾压力0.2 MPa。 施药后7 d通过目测法观察各处理水稻的生长情况，观察水稻是否有变色、坏死、萎蔫等药害症状，从而判断不同浓度解淀粉芽孢杆菌发酵液对水稻苗的药害情况。
药害分级标准（分5级）：-表示无症状; 表示新叶上有少量药斑; 表示新叶上有较多药斑，但生长基本正常; 表示新叶畸形扭曲且少量脱落，或花蕾少量脱落，或幼果上有明显药斑; 表示花蕾大量脱落，甚至新梢枯死，或花蕾大量脱落，或果实严重受害致畸、脱落。
测量各处理水稻的株高、根长和鲜质量，计算不同浓度菌株B15发酵液喷雾对水稻生长的影响。试验中的数据采用DPS统计软件处理，采用Duncans法比较不同处理之间水稻株高、根长和鲜质量之间的差异显著性。相关公式如下：
株高（鲜质量、根长）抑制率=（CK水稻的株高、鲜质量、根长-处理组的株高、鲜质量、根长）/CK水稻的株高、鲜质量、根长×100%。
2 结果与分析
2.1 B15发酵液抗菌谱的测定
部分室内生物活性测定试验结果见图1，其中第1个平板中的CK为空白对照，不添加解淀粉芽孢杆菌B15发酵液，其余各平板为不同稀释浓度的解淀粉芽孢杆菌B15菌液。试验结果表明，病原菌在CK平板中的长势良好，而在添加B15菌液平板中的生长受到明显抑制，生长直径与菌液浓度成反比。
以棉花枯萎病病菌为例，生长5 d时，测定不同浓度发酵液处理组的菌落增长直径，从而计算抑制率（表2），按照“浓度-对数值”和“抑制率-概率值”进行直线回归分析（图2），计算得出，EC50为 0.086个/mL，95%置信限为0.056～0.133个/mL，EC90为24.29个/mL，95%置信限为19.54～30.20个/mL。
采用“1.4”节的室内生测方法测定解淀粉芽孢杆菌B15发酵液的抗菌谱，结果（表3）表明，该菌株 10 CFU/mL 稀释发酵液对供试23种植物病原真菌的抑制率达到50%以上，其中对香菇烂筒病、苹果腐烂病、棉花炭疽病、花生褐斑病和黄瓜枯萎病5种病原真菌的抑制率在90%以上。由此可见，解淀粉芽孢杆菌B15发酵液的抑菌范围较广。
2.2 安全性试验
喷雾处理后7 d通过目测法观察药害情况。由表4可以看出，3种水稻均生长正常，叶色鲜绿，无坏死斑，叶缘无枯黄状，且无药害产生。
测定每个水稻品种、每个处理（10株水稻）的株高、根长和鲜质量。由表5可以看出，各浓度解淀粉芽孢杆菌B15对明恢86株高的影响无论在0.05水平还是在0.01水平都没有显著差异，而对武育粳3号品种水稻的影响有显著差异。
由表6可以看出，各浓度的解淀粉芽孢杆菌B15对明恢86、武育粳3号2个水稻品种的根长无论在0.05水平还是在0.01水平都没有显著影响。在对沈农265根长的影响方面，各浓度与CK间在0.01水平上有显著差异，而各浓度之间不具有显著差异。
由表7可以看出，各浓度解淀粉芽孢杆菌B15对武育粳3号2个水稻品种鲜质量的影响无论在005水平还是在0.01水平都没有显著影响。而在对沈农265的水稻鲜质量方面，50、150 CFU/mL处理与CK在0.05水平上具有显著差异;在001水平上，各解淀粉芽孢杆菌B15浓度与CK及其他各浓度之间都没有显著差异。
3 讨论与结论
本研究以解淀粉芽孢杆菌B15为研究对象，进行室内生物活性测定和安全性测定， 旨在为将该生防菌株作为生物农药推广应用奠定研究基础。研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌B15对23种供试植物病原菌均有抑制作用，且抑制率高，作用浓度低，同时对测试水稻植株无药害作用，安全性高。以本研究为基础，可以进行解淀粉芽孢杆菌B15可湿性粉剂的开发与田间应用研究。
参考文献：
[1]龚谷迪，周广田，郭 阳，等. 脂肽surfactin、iturin、fengycin性质鉴定的研究与展望. 中国食品添加剂，2013（3）：211-215.
[2]朱弘元，康 健，范 昕，等. 解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽的分离鉴定及抑菌机理. 江苏农业科学，2016，44（5）：186-189.
[3]潘虹余，金玮鋆，张晓蒙，等. 解淀粉芽孢杆菌B15抑菌物质对葡萄灰霉病灰葡萄孢的抑菌机理. 微生物学报，2018，58（7）：1245-1254
[4]林 毅，陈金辉，黄志鹏. 芽孢杆菌几丁质酶及其在植物病虫害生物防治中的应用. 福建农业科技，1998（增刊1）： 32-33.
[5]Vitullo D，Pietro A D，Romano A，et al. Role of new bacterial surfactins in the antifungal interaction between Bacillus amyloliquefaciensand Fusarium oxysporum. Plant Pathology，2012，61（4）：689-699.
[6]Reva O N，Dixelius C，Meijer J，et al. Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciensand Bacillus subtilis. FEMS Microbiology Ecology，2004，48（2）：249-259.
[7]Fravel D R. Commercialization and implementation of biocontrol. Annual Review of Phytopathology 2005，43：A337-359.
[8]鄧建良. 解淀粉芽孢杆菌YN-1抑制植物病原真菌活性物质研究. 武汉：华中农业大学，2009：1.
[9]邱思鑫，阮宏春，宋美仙，等. 内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株活性物质诱导辣椒果抗疫病的生化机理. 热带作物学报，2010，31（10）：1813-1820.
[10]邱思鑫，何 红，阮宏椿，等. 内生芽孢杆菌TB2防治辣椒疫病效果及其机理初探. 植物病理学报，2004（2）：173-179.
[11]胥丽娜. 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌PEBA20的抑菌活性研究. 泰安：山东农业大学，2009：16-21.
[12]李祥英，张英华，胥丽娜，等. 解淀粉芽孢杆菌对烟草叶片光合特性的影响. 山东农业大学学报（自然科学版），2018，49（3）：518-522，527.
[13]张峰峰，周 可，谢凤行，等. 解淀粉芽孢杆菌HN固体菌剂发酵制备技术研究. 中国饲料，2018（23）：33-39.
[14]陈 成. 一株解淀粉芽孢杆菌产抗真菌物质的研究. 广州：华南理工大学，2010：13-22.
[15]Chen X，Scholz R，Borriss M，et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciensare efficient in controlling fire blight disease. Journal of Biotechnology 2009，140（1/2）：38-44.
关键词：解淀粉芽孢杆菌;植物病原菌;抑制率;抗菌谱;安全性测试
中图分类号： TQ458;S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2021）05-0102-05
笔者所在实验室在前期的研究中，从酿酒葡萄表面筛选、鉴定发现1株具有明显抑制霉菌效果的解淀粉芽孢杆菌（Bacillm amyloliquefaciens），将其编号为B15，并对其抑菌活性成分和代谢机制进行研究。解淀粉芽孢杆菌为学界公认的植物病原真菌的生防细菌，能够产生脂肽类抑菌物质，并且分裂繁殖速度快、对营养条件要求简单，因而被广泛应用于植物疫病防治和果蔬保鲜中，是经美国食品和药物管理局（FDA）安全认证的菌种，也是国内农业农村部批准的生物农药使用菌种之一。据统计，以芽孢杆菌为基础的产品约占细菌生物防治剂产品的一半[7]。
目前，国内研究者分离、研究并进行初步应用的解淀粉芽孢杆菌菌株有YN-1（来源于郑州果园）[8]、TB-2（来源于茄科作物内生菌）、PEBA20（来源于杨树内生菌）、HN-06（来源于土壤）等，发现解淀粉芽孢杆菌能够抑制苹果炭疽病、苹果轮纹病、苹果腐烂病、芹菜菌核病、香蕉轴腐病、桃褐腐病、烟草黑胫病、辣椒疫霉、番茄灰霉等病原菌的生长，并且应用芽孢杆菌处理在防病稳定性与化学农药的相容性等方面具有明显优势[15]。
本研究分析来源于酿酒葡萄表面的解淀粉芽孢杆菌B15的抗菌谱和安全性，旨在为将该菌株作为生防菌开发生物农药提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
水稻品种为明恢86、武育粳3号、沈农265。
生防菌菌株解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）B15来源于酿酒葡萄表皮，贮藏于国家级酒类品质与安全国际联合研究中心。23种植物病原见表1，来源于中国农业科学院植物保护研究所农业部农药化学与应用技术重点开放实验室。
1.2 培养基
种子液活化培养基为营养肉汤（NB），病原菌活化培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。基础发酵培养基为改良Landy培养基，配方如下：30 g/L 葡萄糖，14 g/L谷氨酸钠，0.5 g/L MgSO4，05 g/L KCl，1.0 g/L KH2PO4，0.15 mg/L FeSO4，50 mg/L MnSO4，0.16 mg/L CuSO4，pH值为7.0。
1.3 菌株B15发酵液的制备
将保存于4 ℃的解淀粉芽孢杆菌B15接种到斜面上，于30 ℃培养48 h，再将其接种于NB培养基上， 于37 ℃、 120 r/min 振荡培养24 h后进行活化扩培，得到种子液。将种子液按4%的接种量接种于改良Landy培养基中，于30 ℃、180 r/min条件振荡培养50 h，得到发酵液，然后将发酵液于 8 000 r/min 離心15 min，取上清液。
1.4 抗菌谱的室内生测方法
1.4.1 植物病原菌的活化 用打孔器在实验室保存的23种植物病原菌平板上取1块菌板，置于PDA平板中央，放入培养箱中于25 ℃进行培养，待病原菌即将铺满平板时取出，用封口膜封好后放入4 ℃冰箱中备用。
1.4.2 发酵液的稀释 经测定，“1.3”节制备的发酵液的孢子数为1.9×108个/mL，按梯度稀释为7个浓度（分别为150.0、50.0、25.0、10.0、5.0、1.0、0.5个/mL）的稀释液试验组，分别取100 μL稀释液加入60 mL PDA培养基中，平均倒3个平板，以无菌水作为对照组（即不添加解淀粉芽孢杆菌B15菌液的PDA平板），备用。
1.4.3 菌丝生长速率的测定 参照NY/T 1156.2—2006《农药室内生物测定试验准则 杀菌剂 第2部分：抑制病原真菌菌丝生长试验 平皿法》，将培养好的病原菌在无菌操作条件下用直径为 7 mm 的灭菌打孔器自菌落边缘切取菌苔（约 6 mm），将菌丝面向下接种在上述平板中央，25 ℃恒温培养，待空白对照平板中的菌落充分生长后，用十字交叉法测量各处理的菌落直径，计算抑制率，计算公式如下：
菌落增长直径=菌落直径平均值-菌饼直径;（1）
菌丝生长抑制率=对照菌落增长直径-处理菌落增长直径对照菌落增长直径×100%。（2）
采用回归分析法对试验数据进行分析，以各处理浓度的对数值为横坐标、以菌丝生长抑制率换算成的概率值为纵坐标，求出回归方程和有效抑制浓度（EC50、EC90）。
1.5 安全性测试方法
测试试验在中国农业科学院植物保护研究所温室内进行，浇透水后均匀撒播种子，温室白天温度为28 ℃，夜间温度为25 ℃，培育1周后进行施药。
测定“1.3”节制备的发酵液孢子数，按梯度稀释为3个浓度（150、50、10个/mL）的稀释液试验组，以无菌水作为空白对照组，每个设浓度3个处理，每个处理设10株。采用Spraying System公司生产的气力喷头Air Atom喷雾，喷雾压力0.2 MPa。 施药后7 d通过目测法观察各处理水稻的生长情况，观察水稻是否有变色、坏死、萎蔫等药害症状，从而判断不同浓度解淀粉芽孢杆菌发酵液对水稻苗的药害情况。
药害分级标准（分5级）：-表示无症状; 表示新叶上有少量药斑; 表示新叶上有较多药斑，但生长基本正常; 表示新叶畸形扭曲且少量脱落，或花蕾少量脱落，或幼果上有明显药斑; 表示花蕾大量脱落，甚至新梢枯死，或花蕾大量脱落，或果实严重受害致畸、脱落。
测量各处理水稻的株高、根长和鲜质量，计算不同浓度菌株B15发酵液喷雾对水稻生长的影响。试验中的数据采用DPS统计软件处理，采用Duncans法比较不同处理之间水稻株高、根长和鲜质量之间的差异显著性。相关公式如下：
株高（鲜质量、根长）抑制率=（CK水稻的株高、鲜质量、根长-处理组的株高、鲜质量、根长）/CK水稻的株高、鲜质量、根长×100%。
2 结果与分析
2.1 B15发酵液抗菌谱的测定
部分室内生物活性测定试验结果见图1，其中第1个平板中的CK为空白对照，不添加解淀粉芽孢杆菌B15发酵液，其余各平板为不同稀释浓度的解淀粉芽孢杆菌B15菌液。试验结果表明，病原菌在CK平板中的长势良好，而在添加B15菌液平板中的生长受到明显抑制，生长直径与菌液浓度成反比。
以棉花枯萎病病菌为例，生长5 d时，测定不同浓度发酵液处理组的菌落增长直径，从而计算抑制率（表2），按照“浓度-对数值”和“抑制率-概率值”进行直线回归分析（图2），计算得出，EC50为 0.086个/mL，95%置信限为0.056～0.133个/mL，EC90为24.29个/mL，95%置信限为19.54～30.20个/mL。
采用“1.4”节的室内生测方法测定解淀粉芽孢杆菌B15发酵液的抗菌谱，结果（表3）表明，该菌株 10 CFU/mL 稀释发酵液对供试23种植物病原真菌的抑制率达到50%以上，其中对香菇烂筒病、苹果腐烂病、棉花炭疽病、花生褐斑病和黄瓜枯萎病5种病原真菌的抑制率在90%以上。由此可见，解淀粉芽孢杆菌B15发酵液的抑菌范围较广。
2.2 安全性试验
喷雾处理后7 d通过目测法观察药害情况。由表4可以看出，3种水稻均生长正常，叶色鲜绿，无坏死斑，叶缘无枯黄状，且无药害产生。
测定每个水稻品种、每个处理（10株水稻）的株高、根长和鲜质量。由表5可以看出，各浓度解淀粉芽孢杆菌B15对明恢86株高的影响无论在0.05水平还是在0.01水平都没有显著差异，而对武育粳3号品种水稻的影响有显著差异。
由表6可以看出，各浓度的解淀粉芽孢杆菌B15对明恢86、武育粳3号2个水稻品种的根长无论在0.05水平还是在0.01水平都没有显著影响。在对沈农265根长的影响方面，各浓度与CK间在0.01水平上有显著差异，而各浓度之间不具有显著差异。
由表7可以看出，各浓度解淀粉芽孢杆菌B15对武育粳3号2个水稻品种鲜质量的影响无论在005水平还是在0.01水平都没有显著影响。而在对沈农265的水稻鲜质量方面，50、150 CFU/mL处理与CK在0.05水平上具有显著差异;在001水平上，各解淀粉芽孢杆菌B15浓度与CK及其他各浓度之间都没有显著差异。
3 讨论与结论
本研究以解淀粉芽孢杆菌B15为研究对象，进行室内生物活性测定和安全性测定， 旨在为将该生防菌株作为生物农药推广应用奠定研究基础。研究结果表明，解淀粉芽孢杆菌B15对23种供试植物病原菌均有抑制作用，且抑制率高，作用浓度低，同时对测试水稻植株无药害作用，安全性高。以本研究为基础，可以进行解淀粉芽孢杆菌B15可湿性粉剂的开发与田间应用研究。
参考文献：
[1]龚谷迪，周广田，郭 阳，等. 脂肽surfactin、iturin、fengycin性质鉴定的研究与展望. 中国食品添加剂，2013（3）：211-215.
[2]朱弘元，康 健，范 昕，等. 解淀粉芽孢杆菌B15产脂肽的分离鉴定及抑菌机理. 江苏农业科学，2016，44（5）：186-189.
[3]潘虹余，金玮鋆，张晓蒙，等. 解淀粉芽孢杆菌B15抑菌物质对葡萄灰霉病灰葡萄孢的抑菌机理. 微生物学报，2018，58（7）：1245-1254
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[5]Vitullo D，Pietro A D，Romano A，et al. Role of new bacterial surfactins in the antifungal interaction between Bacillus amyloliquefaciensand Fusarium oxysporum. Plant Pathology，2012，61（4）：689-699.
[6]Reva O N，Dixelius C，Meijer J，et al. Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciensand Bacillus subtilis. FEMS Microbiology Ecology，2004，48（2）：249-259.
[7]Fravel D R. Commercialization and implementation of biocontrol. Annual Review of Phytopathology 2005，43：A337-359.
[8]鄧建良. 解淀粉芽孢杆菌YN-1抑制植物病原真菌活性物质研究. 武汉：华中农业大学，2009：1.
[9]邱思鑫，阮宏春，宋美仙，等. 内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株活性物质诱导辣椒果抗疫病的生化机理. 热带作物学报，2010，31（10）：1813-1820.
[10]邱思鑫，何 红，阮宏椿，等. 内生芽孢杆菌TB2防治辣椒疫病效果及其机理初探. 植物病理学报，2004（2）：173-179.
[11]胥丽娜. 杨树内生细菌的分离、多样性分析及解淀粉芽孢杆菌PEBA20的抑菌活性研究. 泰安：山东农业大学，2009：16-21.
[12]李祥英，张英华，胥丽娜，等. 解淀粉芽孢杆菌对烟草叶片光合特性的影响. 山东农业大学学报（自然科学版），2018，49（3）：518-522，527.
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[14]陈 成. 一株解淀粉芽孢杆菌产抗真菌物质的研究. 广州：华南理工大学，2010：13-22.
[15]Chen X，Scholz R，Borriss M，et al. Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciensare efficient in controlling fire blight disease. Journal of Biotechnology 2009，140（1/2）：38-44.