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摘要：目的：研究跑台运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠肝脏MAPK和骨骼肌Akt磷酸化的影响，探索运动缓解Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗的肝脏和骨骼肌机制。方法：牛fetuin-A注射建立胰岛素抵抗鼠模型。设一次性运动组（FOE）、8周运动组（FAE）、安静对照组（FC）和正常安静对照组（C）。免疫印记法、RT-PCR法检测骨骼肌、肝脏和血液的相关指标。结果：（1）与C组相比，各组实验鼠血清Fetuin-A、HOMA-IR和肝脏PEPCK表达均显著增加（P<0.01），肝脏MAPK磷酸化、GK表达和肝糖原均显著减少（P<0.01）；骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率均显著减少（P <0.01）。（2）与FC组相比，FAE组肝脏MAPK磷酸化、GK表达和肝糖原含量均显著增加（P<0.01），PEPCK表达显著降低（P<0.01）；FOE组和FAE组骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率均显著增加（P<0.01）。结论：运动能够显著改善Fe—tuin-A诱导的胰岛素抵抗，机制涉及运动后肝脏MAPK磷酸化和骨骼肌Akt磷酸化增加，从而减少肝脏向血液过量释放葡萄糖，并增加骨骼肌葡萄糖摄取。
关键词：运动；Fetuin-A；胰岛素抵抗；促分裂素原活化蛋白激酶；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
中图分类号：G804 文献标识码：A
文章编号：1008-2808（2015）06-0024-07
来源于肝脏的Fetuin-A是胰岛素刺激的胰岛素受体酪氨酸激酶的天然抑制剂，通过抑制骨骼肌胰岛素信号转导，影响葡萄糖转运，诱导胰岛素抵抗。随后的临床流行病学研究发现了胰岛素抵抗、糖尿病与高循环水平Fetuin-A之间的联系证据，对数千名患者的流行病学调查研究显示，Fe-tuin -A的基因型及循环水平与身体的形态学特征（胖瘦以及腹部肥胖）关系密切。在肝脏中，Fetuin-A调节肝细胞促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，影响肝糖原合成和肝糖异生功能，妨碍餐后葡萄糖清除，调节肝脏向血液的葡萄糖释放，导致血糖稳态异常，参与糖尿病、胰岛素抵抗产生和转归的病理过程。
与药物治疗以及热量摄人控制的效果相似，运动也能够降低成人和儿童的血清Fetuin-A水平，并伴随胰岛素抵抗的缓解。鉴于前期研究已经证实：Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制分别涉及骨骼肌胰岛素信号转导和肝脏葡萄糖代谢功能异常，而运动能够降低Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗，推测运动可能影响了异常的骨骼肌胰岛素信号转导和肝糖代谢过程。因此，本研究拟制备Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗模型，观察一次和8周有氧运动后肝脏MAPK磷酸化、肝糖合成调节酶葡萄糖激酶（GK）、肝糖异生催化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）表达和肝糖原含量；骨骼肌胰岛素信号通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）磷酸化和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达；尝试分别在肝脏和骨骼肌层面揭示运动改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
多克隆抗phospho-p44/42MAPK抗体、多克隆抗phospho-Akt抗体、Fetuin-A ELISA试剂盒、胰岛素放射免疫试剂盒、牛Fetuin-A（纯度95%）和其它试剂均购白厦门慧嘉生物公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验鼠模型的制备和运动分组 8周龄SPF级雄性KM小鼠，平均体重42.8±3.9g，许可证：SCXK（粤）2013-0020，广州中医药大学大学城实验动物中心提供。Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠的制备方法参考Hennige AM[9]等的研究，实验鼠上午10：00腹腔注射95%牛Fetuin-A，每公斤体重注射0.75mg。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=空腹胰岛素（IU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5，用于检验是否产生胰岛素抵抗。对照组注射生理盐水，注射8h后检测并计算尾静脉血HOMA-IR。Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠模型制备成功（Fetuin-A注射组HOMA-IR：24.1±3.0；对照组HOMA-IR：12.5+2.2，p<0.01）.
Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠随机分组：安静对照组（Fetuin-A control group，FC）、一次性运动组（Fetuin-A one time exercise group， FOE）、8周有氧运动组（Fetuin-A aerobic exercise group，FAE），另设未予Fetuin-A处理的正常安静对照组（Control group，C），每组10只。鼠有氧运动处方参考Thomas DP等的研究，适应性训练3天后，实验鼠每天下午3：00跑台运动60min，5天/周，以70%-75%最大摄氧量强度作为有氧运动强度的参照，此强度对应的跑台速度为15m/min，FAE组持续训练8周，FOE组在第8周末取材前进行一次相同运动处方内容的训练。FAE组、FOE组和FC组每天Fetuin-A腹腔注射一次，持续8周，维持胰岛素抵抗病理状态。4只小鼠因为各种原因未能全程完成运动干预，最终纳入统计的各组实验鼠数量均为6只。
1.2.2 血清Fetuin-A、HOMA-IR和肝糖原含量检测 FAE组实验鼠最后一次运动后休息过夜，取材前各组实验鼠禁食12h，第二日下午4：00 FOE组运动后立即与FAE组实验鼠均腹腔注射10%水合氯醛，心脏取血，处死后取肝脏组织和腓肠肌组织备用。血清Fetuin-A检测采用酶联免疫法，空腹胰岛素检测采用放射免疫法，空腹血糖检测采用酶法。肝糖原含量测定采用蒽酮显色法，以每100g肝组织中所含糖原量为实际肝糖原含量。
1.2.3 肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化检测 免疫印记法检测肝脏MAPK和骨骼肌Akt磷酸化。骨骼肌予胰岛素（lOnmol/L）和D-葡萄糖（25mmol/l）孵育20min预处理。分别提取肝脏和骨骼肌待测细胞的总蛋白，lOOug细胞裂解上清溶解物SDS-PAGE蛋白分离、转膜3h，分别加抗phospho - p44/42MAPK和抗phospho-Akt抗体（工作浓度均为1：800），洗膜，加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗；曝光，洗涤后DAB显色，光密度定量分析采用LeicaQ图像分析仪。 1.2.4 肝脏GK、PEPCK和骨骼肌GULT4表达RT-PCR法检测肝脏GK、PEPCK和骨骼肌GULT4的mRNA表达。以Ttizol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度计和1%琼脂糖电泳检测RNA纯度和完整性，依照试剂盒说明书进行逆转录，生产cDNA进行PCR扩增。Primer Express2.0软件设计待测和β-actin基因的上、下游引物。GK上游引物5’-GGCCACCAAGAAGGAAAAGGT-3’，下游引物5’-CCTCTCCCACTTTCACCAGCA -3’：PEPCK上游引物5’-CGCTGGATGT-CAGAACAGG-3’，下游引物5’-GCAGTGAGT-TCCCACCGTAT-3’：GLUT4上游引物5’-CGT-GCGTGACATTAAAGAG-3’，下游引物5’-CTG-GAAGGTGGACAGTGAG-3’；内参β-actin上游引物：5’-AGATAGACGTGCACAGGAAG -3’，下游引物：5’-GCTGGCCAACCGCCACAGCT -3’。总反应体系20μL，预变性lOmin，PCR30个循环（94℃×30s，55℃×30s，72℃×30s），终末延伸72℃×7min，PCR产物以1.3%琼脂糖凝胶电泳0.5h，凝胶成像系统分析PCR产物的电泳成像，待测基因/β-actin的值表示相对表达量。
1.2.5 骨骼肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取率液闪仪测定经过胰岛素和D-葡萄糖预处理后的骨骼肌葡萄糖摄取率（pmol/g. min），各组重复测定2次，取平均值为实际葡萄糖摄取率。
1.3 统计学处理
各组间的指标数据进行单因素方差分析，以均数±标准差表示，采用LSD检验，显著水平和非常显著水平分别取0. 05和0.01，P<0.05和P<0.01表示差异存在显著和非常显著统计学意义，统计软件为SPSS16.0。
2 实验结果
2.1 血清Fetuin-A和胰岛素抵抗变化
与C组相比，第8周末各组实验鼠血清Fetuin-A和HOMA-IR均增高，差异均具有非常显著性（P<0.01）。与FC组相比，一次性和8周有氧运动均能够降低小鼠血清Fetuin-A和HOMA-IR，差异均具有非常显著性（P<0.01）（见表1）。
2.2 肝脏MAPK磷酸化和肝糖原变化
与C组相比，第8周末各组实验鼠肝脏MAPK磷酸化、GK表达、肝糖原均减少，PEPCK表达均增加，差异均具有非常显著性（P<0.01）。与FC组相比，一次性运动后FOE组小鼠肝脏MAPK磷酸化、GK表达、PEPCK表达、肝糖原变化均无显著性（P>0.05）；与FC组相比，8周有氧运动增加FAE组小鼠肝脏MAPK磷酸化、GK表达和肝糖原含量，降低PEPCK表达，差异均具有非常显著性（P<0.01）。
2.3 骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率变化
与C组相比，第8周末各组实验鼠骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率均降低，差异均具有非常显著性（P<0.01）。与FC组相比，一次性和8周有氧运动均能够增加实验鼠骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率，差异均具有非常显著性（P 3 讨论
3.1 肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化与Fe-tuin-A诱导的胰岛素抵抗
本研究试图从肝脏和骨骼肌层面探讨运动影响Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制，首先成功制备了Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠模型，与正常鼠相比，模型鼠肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化显著降低，胰岛素抵抗产生，与以往的研究结果一致。还观察到肝脏GK表达显著降低，PEPCK表达显著增加，肝糖含量下降；骨骼肌GLUT4表达显著降低，骨骼肌葡萄糖摄取减少（见表1、表2）。
Mathews ST等的研究揭示了Fetuin-A诱导胰岛素抵抗的作用机制，研究显示：与正常野生鼠相比，Fetuin-A基因敲除小鼠胰岛素敏感性显著提高，机制分别涉及骨骼肌和肝脏，骨骼肌胰岛素信号传导的Akt经典信号途径激活程度显著增加，Akt磷酸化增加，葡萄糖摄率提高；肝脏中MAPK的磷酸化显著增加，肝糖含量增加。MAPK是细胞跨膜信号转导的信号蛋白，调节增殖、分化、转化和凋亡等细胞生物化学反应过程。Akt又称PKB或Rac，是胰岛素等生长因子激活的信号转导蛋白，与上游的胰岛素受体、受体底物和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）一起，共同构成磷酸化级连反应系统，向下游传导胰岛素刺激的级连反应，实现由GLUT4完成的葡萄糖跨膜转运功能，与胰岛素抵抗关系密切。
肝脏通过向血液释放葡萄糖，在维持机体葡萄糖自稳态过程中发挥重要作用。糖尿病者存在肝糖代谢障碍，肝糖含量显著减少，采用高糖高胰岛素混合物刺激后，该病理改变没有缓解，空腹或餐后的肝糖异生功能亢进，肝脏输出过量的葡萄糖加入血液，是胰岛素抵抗的肝脏病理机制之一。肝脏MAPK信号通路通过调节肝脏糖原合成和肝糖异生过程，调节能量代谢平衡，调控肝脏向循环的葡萄糖释放，从而参与高血糖和胰岛素抵抗的发生。Fetuin-A不仅仅抑制肝脏MAPK的磷酸化，调节肝糖代谢，Fetuin-A还抑制骨骼肌胰岛素信号通路中信号蛋白的磷酸化，阻碍胰岛素信号转导，导致胰岛素刺激的葡萄糖转运能力下降，在肝脏和骨骼肌同时发挥调节作用，参与全身性胰岛素抵抗的形成。
3.2 运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠肝脏MAPK和骨骼肌AKT影响
既往的研究曾经报道了运动对肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt的影响，及其与糖代谢和胰岛素抵抗的关系。Hoene M等的研究报道了4周有氧运动和急性运动干预后，非肥胖大鼠和小鼠肝脏MAPK表达增加，并揭示了运动后肝脏MAPK表达变化及其信号通路在调节肝糖代谢和胰岛素抵抗过程中的作用。对糖尿病、肥胖等实验鼠的研究显示，多种形式的运动干预均报道了骨骼肌Akt表达的显著增加，并显示出了对改善胰岛素抵抗的良好作用。 尽管大量的研究已经报道了运动对肝脏MAPK、骨骼肌AKT的影响，及其与糖代谢和胰岛素抵抗的关系，然而运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠肝脏MAPK、骨骼肌AKT影响的研究则鲜见报道。为了揭示肝脏MAPK、骨骼肌AKT在运动影响Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗中的作用，本研究对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠分别进行了一次性和8周有氧运动干预，观察肝糖代谢和骨骼肌胰岛素信号调节蛋白变化情况。结果显示：与FC组相比，2种形式的干预均显著降低实验鼠血清Fetuin-A和HOMA-IR，缓解胰岛素抵抗。观察肝脏发现，肝脏MAPK磷酸化和肝糖原含量的变化情况出现分化，与FC组相比，一次性运动没有显著改变肝脏MAPK磷酸化、GK表达、PEP-CK表达和肝糖原含量；8周有氧运动则显著增加了肝脏MAPK磷酸化、GK表达和肝糖原含量，降低了PEPCK表达（见表1、表2）。结果提示：一次性运动没有显著改变Fetuin-A抑制的肝脏MAPK通路；而8周有氧运动通过增加被Fetuin-A抑制的肝脏MAPK磷酸化，使肝脏糖原合成功能增加，抑制了肝糖异生，肝脏向血液释放的葡萄糖量减少，是Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗缓解的肝脏机制之一。
观察骨骼肌发现，与FC组相比，经过一次性和8周有氧运动干预，Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和胰岛素刺激的葡萄糖摄取率均显著增加（见表1、表2）。结果提示：2种形式的运动均能够显著改善Fetuin-A抑制的骨骼肌胰岛素信号蛋白Akt磷酸化，恢复Akt经典信号途径的正常信号传导功能，最终增加骨骼肌的葡萄糖转运和摄取，是Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗缓解的骨骼肌机制之一。前期对Fe-tuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠的研究发现，急性运动和8周有氧运动能够增加骨骼肌胰岛素受体（Tyr1150）、胰岛素受体底物1（Tyr612）磷酸化和GLUT4mRNA表达，改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗。本研究继续关注了胰岛素受体底物的下游蛋白激酶Akt的变化特征，进一步丰富和拓展了研究深度。
综上所述，Fetuin-A分别在肝脏抑制了MAPK磷酸化，增加了内源性葡萄糖向血液的释放；在骨骼肌抑制了Akt磷酸化，阻碍了葡萄糖摄取，共同诱导了全身性胰岛素抵抗的产生。一次性和8周有氧运动改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗，机制均涉及解除了骨骼肌Akt磷酸化的抑制作用；而8周有氧运动还解除了肝脏MAPK磷酸化的抑制作用。Fetuin-A对肝糖代谢和骨骼肌葡萄糖转运的调节机制非常复杂，本研究仅仅观察了运动干预后部分指标的变化，用于说明本研究结论，存在较显著的局限性，需要大量的后续研究补充完善。
至于运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠肝脏MAPK和骨骼肌AKT影响的可能原因，本研究则没有能够给出具有说服力的直接证据，然而综合以往相关文献和本研究结果，初步考虑可能与一下因素有关，首先，肝脏MAPK、骨骼肌Akt在Fe-tuin-A的诱导下产生了异常变化，参与到胰岛素抵抗产生的机制中。其次，运动从不同的层次和角度改善胰岛素抵抗，在肝脏中可能调节异常的MAPK表达以及磷酸化过程，并可能在异常的骨骼肌Akt信号途径的前端发挥调节作用，最终实现对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗的调节作用。
4 结论
（I）Fetuin-A显著降低肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化，增加了肝脏向血液的葡萄糖释放，抑制了骨骼肌葡萄糖摄取，诱导胰岛素抵抗。
（2）一次性和8周有氧运动解除了Fetuin-A对骨骼肌Akt磷酸化的抑制作用，增加了葡萄糖摄取；8周有氧运动解除了肝脏MAPK磷酸化的抑制作用，减少了肝脏向血液的葡萄糖释放，改善了Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗。
关键词：运动；Fetuin-A；胰岛素抵抗；促分裂素原活化蛋白激酶；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶
中图分类号：G804 文献标识码：A
文章编号：1008-2808（2015）06-0024-07
来源于肝脏的Fetuin-A是胰岛素刺激的胰岛素受体酪氨酸激酶的天然抑制剂，通过抑制骨骼肌胰岛素信号转导，影响葡萄糖转运，诱导胰岛素抵抗。随后的临床流行病学研究发现了胰岛素抵抗、糖尿病与高循环水平Fetuin-A之间的联系证据，对数千名患者的流行病学调查研究显示，Fe-tuin -A的基因型及循环水平与身体的形态学特征（胖瘦以及腹部肥胖）关系密切。在肝脏中，Fetuin-A调节肝细胞促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化，影响肝糖原合成和肝糖异生功能，妨碍餐后葡萄糖清除，调节肝脏向血液的葡萄糖释放，导致血糖稳态异常，参与糖尿病、胰岛素抵抗产生和转归的病理过程。
与药物治疗以及热量摄人控制的效果相似，运动也能够降低成人和儿童的血清Fetuin-A水平，并伴随胰岛素抵抗的缓解。鉴于前期研究已经证实：Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制分别涉及骨骼肌胰岛素信号转导和肝脏葡萄糖代谢功能异常，而运动能够降低Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗，推测运动可能影响了异常的骨骼肌胰岛素信号转导和肝糖代谢过程。因此，本研究拟制备Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗模型，观察一次和8周有氧运动后肝脏MAPK磷酸化、肝糖合成调节酶葡萄糖激酶（GK）、肝糖异生催化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）表达和肝糖原含量；骨骼肌胰岛素信号通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）磷酸化和葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）表达；尝试分别在肝脏和骨骼肌层面揭示运动改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制。
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
多克隆抗phospho-p44/42MAPK抗体、多克隆抗phospho-Akt抗体、Fetuin-A ELISA试剂盒、胰岛素放射免疫试剂盒、牛Fetuin-A（纯度95%）和其它试剂均购白厦门慧嘉生物公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验鼠模型的制备和运动分组 8周龄SPF级雄性KM小鼠，平均体重42.8±3.9g，许可证：SCXK（粤）2013-0020，广州中医药大学大学城实验动物中心提供。Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠的制备方法参考Hennige AM[9]等的研究，实验鼠上午10：00腹腔注射95%牛Fetuin-A，每公斤体重注射0.75mg。胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=空腹胰岛素（IU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5，用于检验是否产生胰岛素抵抗。对照组注射生理盐水，注射8h后检测并计算尾静脉血HOMA-IR。Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠模型制备成功（Fetuin-A注射组HOMA-IR：24.1±3.0；对照组HOMA-IR：12.5+2.2，p<0.01）.
Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠随机分组：安静对照组（Fetuin-A control group，FC）、一次性运动组（Fetuin-A one time exercise group， FOE）、8周有氧运动组（Fetuin-A aerobic exercise group，FAE），另设未予Fetuin-A处理的正常安静对照组（Control group，C），每组10只。鼠有氧运动处方参考Thomas DP等的研究，适应性训练3天后，实验鼠每天下午3：00跑台运动60min，5天/周，以70%-75%最大摄氧量强度作为有氧运动强度的参照，此强度对应的跑台速度为15m/min，FAE组持续训练8周，FOE组在第8周末取材前进行一次相同运动处方内容的训练。FAE组、FOE组和FC组每天Fetuin-A腹腔注射一次，持续8周，维持胰岛素抵抗病理状态。4只小鼠因为各种原因未能全程完成运动干预，最终纳入统计的各组实验鼠数量均为6只。
1.2.2 血清Fetuin-A、HOMA-IR和肝糖原含量检测 FAE组实验鼠最后一次运动后休息过夜，取材前各组实验鼠禁食12h，第二日下午4：00 FOE组运动后立即与FAE组实验鼠均腹腔注射10%水合氯醛，心脏取血，处死后取肝脏组织和腓肠肌组织备用。血清Fetuin-A检测采用酶联免疫法，空腹胰岛素检测采用放射免疫法，空腹血糖检测采用酶法。肝糖原含量测定采用蒽酮显色法，以每100g肝组织中所含糖原量为实际肝糖原含量。
1.2.3 肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化检测 免疫印记法检测肝脏MAPK和骨骼肌Akt磷酸化。骨骼肌予胰岛素（lOnmol/L）和D-葡萄糖（25mmol/l）孵育20min预处理。分别提取肝脏和骨骼肌待测细胞的总蛋白，lOOug细胞裂解上清溶解物SDS-PAGE蛋白分离、转膜3h，分别加抗phospho - p44/42MAPK和抗phospho-Akt抗体（工作浓度均为1：800），洗膜，加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗；曝光，洗涤后DAB显色，光密度定量分析采用LeicaQ图像分析仪。 1.2.4 肝脏GK、PEPCK和骨骼肌GULT4表达RT-PCR法检测肝脏GK、PEPCK和骨骼肌GULT4的mRNA表达。以Ttizol试剂提取细胞总RNA，紫外分光光度计和1%琼脂糖电泳检测RNA纯度和完整性，依照试剂盒说明书进行逆转录，生产cDNA进行PCR扩增。Primer Express2.0软件设计待测和β-actin基因的上、下游引物。GK上游引物5’-GGCCACCAAGAAGGAAAAGGT-3’，下游引物5’-CCTCTCCCACTTTCACCAGCA -3’：PEPCK上游引物5’-CGCTGGATGT-CAGAACAGG-3’，下游引物5’-GCAGTGAGT-TCCCACCGTAT-3’：GLUT4上游引物5’-CGT-GCGTGACATTAAAGAG-3’，下游引物5’-CTG-GAAGGTGGACAGTGAG-3’；内参β-actin上游引物：5’-AGATAGACGTGCACAGGAAG -3’，下游引物：5’-GCTGGCCAACCGCCACAGCT -3’。总反应体系20μL，预变性lOmin，PCR30个循环（94℃×30s，55℃×30s，72℃×30s），终末延伸72℃×7min，PCR产物以1.3%琼脂糖凝胶电泳0.5h，凝胶成像系统分析PCR产物的电泳成像，待测基因/β-actin的值表示相对表达量。
1.2.5 骨骼肌胰岛素刺激的葡萄糖摄取率液闪仪测定经过胰岛素和D-葡萄糖预处理后的骨骼肌葡萄糖摄取率（pmol/g. min），各组重复测定2次，取平均值为实际葡萄糖摄取率。
1.3 统计学处理
各组间的指标数据进行单因素方差分析，以均数±标准差表示，采用LSD检验，显著水平和非常显著水平分别取0. 05和0.01，P<0.05和P<0.01表示差异存在显著和非常显著统计学意义，统计软件为SPSS16.0。
2 实验结果
2.1 血清Fetuin-A和胰岛素抵抗变化
与C组相比，第8周末各组实验鼠血清Fetuin-A和HOMA-IR均增高，差异均具有非常显著性（P<0.01）。与FC组相比，一次性和8周有氧运动均能够降低小鼠血清Fetuin-A和HOMA-IR，差异均具有非常显著性（P<0.01）（见表1）。
2.2 肝脏MAPK磷酸化和肝糖原变化
与C组相比，第8周末各组实验鼠肝脏MAPK磷酸化、GK表达、肝糖原均减少，PEPCK表达均增加，差异均具有非常显著性（P<0.01）。与FC组相比，一次性运动后FOE组小鼠肝脏MAPK磷酸化、GK表达、PEPCK表达、肝糖原变化均无显著性（P>0.05）；与FC组相比，8周有氧运动增加FAE组小鼠肝脏MAPK磷酸化、GK表达和肝糖原含量，降低PEPCK表达，差异均具有非常显著性（P<0.01）。
2.3 骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率变化
与C组相比，第8周末各组实验鼠骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率均降低，差异均具有非常显著性（P<0.01）。与FC组相比，一次性和8周有氧运动均能够增加实验鼠骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和葡萄糖摄取率，差异均具有非常显著性（P
3.1 肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化与Fe-tuin-A诱导的胰岛素抵抗
本研究试图从肝脏和骨骼肌层面探讨运动影响Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗机制，首先成功制备了Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠模型，与正常鼠相比，模型鼠肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化显著降低，胰岛素抵抗产生，与以往的研究结果一致。还观察到肝脏GK表达显著降低，PEPCK表达显著增加，肝糖含量下降；骨骼肌GLUT4表达显著降低，骨骼肌葡萄糖摄取减少（见表1、表2）。
Mathews ST等的研究揭示了Fetuin-A诱导胰岛素抵抗的作用机制，研究显示：与正常野生鼠相比，Fetuin-A基因敲除小鼠胰岛素敏感性显著提高，机制分别涉及骨骼肌和肝脏，骨骼肌胰岛素信号传导的Akt经典信号途径激活程度显著增加，Akt磷酸化增加，葡萄糖摄率提高；肝脏中MAPK的磷酸化显著增加，肝糖含量增加。MAPK是细胞跨膜信号转导的信号蛋白，调节增殖、分化、转化和凋亡等细胞生物化学反应过程。Akt又称PKB或Rac，是胰岛素等生长因子激活的信号转导蛋白，与上游的胰岛素受体、受体底物和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）一起，共同构成磷酸化级连反应系统，向下游传导胰岛素刺激的级连反应，实现由GLUT4完成的葡萄糖跨膜转运功能，与胰岛素抵抗关系密切。
肝脏通过向血液释放葡萄糖，在维持机体葡萄糖自稳态过程中发挥重要作用。糖尿病者存在肝糖代谢障碍，肝糖含量显著减少，采用高糖高胰岛素混合物刺激后，该病理改变没有缓解，空腹或餐后的肝糖异生功能亢进，肝脏输出过量的葡萄糖加入血液，是胰岛素抵抗的肝脏病理机制之一。肝脏MAPK信号通路通过调节肝脏糖原合成和肝糖异生过程，调节能量代谢平衡，调控肝脏向循环的葡萄糖释放，从而参与高血糖和胰岛素抵抗的发生。Fetuin-A不仅仅抑制肝脏MAPK的磷酸化，调节肝糖代谢，Fetuin-A还抑制骨骼肌胰岛素信号通路中信号蛋白的磷酸化，阻碍胰岛素信号转导，导致胰岛素刺激的葡萄糖转运能力下降，在肝脏和骨骼肌同时发挥调节作用，参与全身性胰岛素抵抗的形成。
3.2 运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠肝脏MAPK和骨骼肌AKT影响
既往的研究曾经报道了运动对肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt的影响，及其与糖代谢和胰岛素抵抗的关系。Hoene M等的研究报道了4周有氧运动和急性运动干预后，非肥胖大鼠和小鼠肝脏MAPK表达增加，并揭示了运动后肝脏MAPK表达变化及其信号通路在调节肝糖代谢和胰岛素抵抗过程中的作用。对糖尿病、肥胖等实验鼠的研究显示，多种形式的运动干预均报道了骨骼肌Akt表达的显著增加，并显示出了对改善胰岛素抵抗的良好作用。 尽管大量的研究已经报道了运动对肝脏MAPK、骨骼肌AKT的影响，及其与糖代谢和胰岛素抵抗的关系，然而运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠肝脏MAPK、骨骼肌AKT影响的研究则鲜见报道。为了揭示肝脏MAPK、骨骼肌AKT在运动影响Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗中的作用，本研究对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠分别进行了一次性和8周有氧运动干预，观察肝糖代谢和骨骼肌胰岛素信号调节蛋白变化情况。结果显示：与FC组相比，2种形式的干预均显著降低实验鼠血清Fetuin-A和HOMA-IR，缓解胰岛素抵抗。观察肝脏发现，肝脏MAPK磷酸化和肝糖原含量的变化情况出现分化，与FC组相比，一次性运动没有显著改变肝脏MAPK磷酸化、GK表达、PEP-CK表达和肝糖原含量；8周有氧运动则显著增加了肝脏MAPK磷酸化、GK表达和肝糖原含量，降低了PEPCK表达（见表1、表2）。结果提示：一次性运动没有显著改变Fetuin-A抑制的肝脏MAPK通路；而8周有氧运动通过增加被Fetuin-A抑制的肝脏MAPK磷酸化，使肝脏糖原合成功能增加，抑制了肝糖异生，肝脏向血液释放的葡萄糖量减少，是Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗缓解的肝脏机制之一。
观察骨骼肌发现，与FC组相比，经过一次性和8周有氧运动干预，Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠骨骼肌Akt磷酸化、GLUT4表达和胰岛素刺激的葡萄糖摄取率均显著增加（见表1、表2）。结果提示：2种形式的运动均能够显著改善Fetuin-A抑制的骨骼肌胰岛素信号蛋白Akt磷酸化，恢复Akt经典信号途径的正常信号传导功能，最终增加骨骼肌的葡萄糖转运和摄取，是Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗缓解的骨骼肌机制之一。前期对Fe-tuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠的研究发现，急性运动和8周有氧运动能够增加骨骼肌胰岛素受体（Tyr1150）、胰岛素受体底物1（Tyr612）磷酸化和GLUT4mRNA表达，改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗。本研究继续关注了胰岛素受体底物的下游蛋白激酶Akt的变化特征，进一步丰富和拓展了研究深度。
综上所述，Fetuin-A分别在肝脏抑制了MAPK磷酸化，增加了内源性葡萄糖向血液的释放；在骨骼肌抑制了Akt磷酸化，阻碍了葡萄糖摄取，共同诱导了全身性胰岛素抵抗的产生。一次性和8周有氧运动改善Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗，机制均涉及解除了骨骼肌Akt磷酸化的抑制作用；而8周有氧运动还解除了肝脏MAPK磷酸化的抑制作用。Fetuin-A对肝糖代谢和骨骼肌葡萄糖转运的调节机制非常复杂，本研究仅仅观察了运动干预后部分指标的变化，用于说明本研究结论，存在较显著的局限性，需要大量的后续研究补充完善。
至于运动对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗鼠肝脏MAPK和骨骼肌AKT影响的可能原因，本研究则没有能够给出具有说服力的直接证据，然而综合以往相关文献和本研究结果，初步考虑可能与一下因素有关，首先，肝脏MAPK、骨骼肌Akt在Fe-tuin-A的诱导下产生了异常变化，参与到胰岛素抵抗产生的机制中。其次，运动从不同的层次和角度改善胰岛素抵抗，在肝脏中可能调节异常的MAPK表达以及磷酸化过程，并可能在异常的骨骼肌Akt信号途径的前端发挥调节作用，最终实现对Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗的调节作用。
4 结论
（I）Fetuin-A显著降低肝脏MAPK磷酸化、骨骼肌Akt磷酸化，增加了肝脏向血液的葡萄糖释放，抑制了骨骼肌葡萄糖摄取，诱导胰岛素抵抗。
（2）一次性和8周有氧运动解除了Fetuin-A对骨骼肌Akt磷酸化的抑制作用，增加了葡萄糖摄取；8周有氧运动解除了肝脏MAPK磷酸化的抑制作用，减少了肝脏向血液的葡萄糖释放，改善了Fetuin-A诱导的胰岛素抵抗。